Name: 用于蛋白质磷酸化定量的优化单分子下拉测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解单分子下拉测定技术，通过优化抗体标记和固定条件实现蛋白质磷酸化定量分析，减少绿色通道自发荧光干扰，为神经科学和生物化学研究提供高灵敏度检测方法。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R35GM126934、R01AI153617 和 R01CA248166，授予 DSL。EMB 得到 ASERT-IRACDA 项目（NIH K12GM088021）的支持，JAR 得到新墨西哥大学 MARC 项目（NIH 2T34GM008751-20）的支持。我们衷心感谢新墨西哥大学综合癌症中心荧光显微镜共享资源平台的支持，该平台由 NIH P30CA118100 资助。我们谨向 Ankur Jain 博士和 Taekijip Ha 博士致谢，他们最初开发的 SiMPull 技术启发了本研究。 
ES-C 现地址：美国国立癌症研究所癌症研究中心整合癌症免疫学实验室免疫动态研究组，贝塞斯达

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
<li>Coba, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+drive+combinatorial+multistate+postsynaptic+density+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks.</a> Science Signaling. 2 (68), (2009).</li>
<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案经过优化，可在单个蛋白质水平上实现受体磷酸化的定量检测。我们对SiMPull方案进行了若干简单但重要的改进，以提高酪氨酸磷酸化检测的测量可靠性，包括采用NaBH4处理以降低自发荧光，以及对样品进行固定后处理以防止抗体解离。利用绿色荧光通道的掩膜来识别受体位置，从而计算其与抗磷酸化酪氨酸（anti-PY）抗体的共定位，可有效排除抗体与细胞裂解液非特异性结合所导致的潜在假象，提高测量准确性。本研究采用双色成像方法检测受体中发生磷酸化的比例。在此方案中，受体通过基因工程标记GFP，抗体则直接标记远红外荧光染料。SiMPull方法同样适用于其他具有特异性抗体的蛋白质靶标，包括细胞内蛋白。此外，由于无需变性条件，因此也可捕获多亚基受体/复合物。然而，若目标翻译后修饰（PTM）位于蛋白质的结构化区域，则可引入变性步骤14。最终，SiMPull方法可进一步拓展，实现对单个受体上不同酪氨酸磷酸化位点的同时标记，以定量分析多位点磷酸化模式15。这种对全长、完整受体的检测方式，是其他常规方法（如Western印迹和磷酸化质谱）所...

膜相关信号转导通过配体诱导的膜受体激活以及下游辅助蛋白的募集共同调控，后者负责信号的传递。受体胞内区关键酪氨酸的磷酸化对于启动信号复合物（即信号体）的形成至关重要1,2。因此，生物学中的一个重要问题是：磷酸化模式如何被建立并维持，以招募信号伙伴蛋白并决定细胞命运。这包括理解受体磷酸化的异质性，无论是磷酸化水平的差异，还是特定磷酸酪氨酸模式的多样性，这些均可通过调控信号体的组成来调节信号输出3,4,5,6,7。然而，当前研究蛋白质磷酸化的方法存在局限性。Western印迹分析在描述蛋白质磷酸化趋势方面表现优异，但其为半定量方法8，且由于将成千上万至数百万个受体信号平均化，无法提供系统异质性的信息。尽管Western印迹可利用针对特定酪氨酸的磷酸化特异性抗体对样本进行检测，却无法揭示同一蛋白质内多位点磷酸化的模式。定量磷酸化蛋白质组学可报告磷酸酪氨酸的丰度，但在检测多位点磷酸化方面仍存在限制，因为目标残基必须位于酶解后产生的同一肽段内（通常为7-35个氨基酸）9,10,11。
为克服上述局限性，单分子下拉（SiMPull）技术已被应用于在单分子水平上定量检测完整受体的磷酸化状态。Jain 等人首次证明了 SiMPull 是一种研究大分子复合物的有力工具。12,13在SiMPull中，大分子复合物通过抗体功能化的玻璃盖玻片进行免疫沉淀（IP），随后利用单分子显微镜分析蛋白质亚基数目及与复合物组分的共免疫沉淀情况12金等人的一种改良方法14被称为SiMBlot的方法是首个利用SiMPull的变体来分析变性蛋白质磷酸化的方法。&#160;SiMBlot 实验方案依赖于使用 NeutrAvidin 包被的盖玻片捕获生物素标记的细胞表面蛋白，随后通过磷酸化位点特异性抗体标记检测其磷酸化水平14尽管取得了这些进展，但仍需进一步改进，以增强翻译后修饰定量的稳健性，并使其适用于更广泛的蛋白质。
本方案描述了一种优化的SiMPull方法，该方法已被用于定量分析完整表皮生长因子受体（EGFR）在不同配体条件和癌基因突变下的磷酸化模式15。尽管本研究聚焦于EGFR，但该方法可适用于任何具有高质量抗体的膜受体或细胞质目标蛋白（POI）。本方案包含降低样品自发荧光的步骤、一种仅需极小样品体积并可同时处理多达20个样品的样品阵列设计，以及抗体标记和固定条件的优化。此外，已开发出用于单分子检测和磷酸化蛋白定量的数据分析算法。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl，pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl，pH 8.0 / 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 缓冲液</td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>用于存放经 piranha 溶液蚀刻的玻璃/阵列</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>危险品</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td></td><td></td><td>功能化玻璃储存 / KOH 重复使用</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl，pH 7.2 / 150 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>60 mm 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8% 戊二醛水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16020</td><td>危险品</td></tr><tr><td>丙酮（C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;O）</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>危险品</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS 酯</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>无动物源性重组人 EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>抗人 EGFR（胞外域）&amp;ndash; 生物素</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化酪氨酸抗体（PY99）Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>超声水浴机</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>生物素-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA，分子量 5,000</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>Tyrode 缓冲液组分</td></tr><tr><td>布氏漏斗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>本生灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Tyrode 缓冲液组分</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>锥形抽滤瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Coplin 染色缸</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 60 #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>emCCD 相机</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，Optima 级</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td>经热灭活处理</td></tr><tr><td>Fusion 360 软件</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素 G418 硫酸双盐</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸（CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;COOH）</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>危险品</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃搅拌棒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（D-(+)-葡萄糖）</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Tyrode 缓冲液组分</td></tr><tr><td>Halt 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合液（100X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Tyrode 缓冲液组分</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>危险品</td></tr><tr><td>过氧化氢（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）（3%）</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）（30%）</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630（NP-40）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F 浸油</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>实验室自建真空系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode 缓冲液组分</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>曲线拟合工具箱、并行计算工具箱和统计与机器学习工具箱</td></tr><tr><td>甲醇（CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;OH）</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>危险品</td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix-n-Stain CF 染料抗体标记试剂盒</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>推荐使用的偶联试剂盒</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯，分子量 5,000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-氨乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td>危险品</td></tr><tr><td>Nanogrid</td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin 生物素结合蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>氮气（压缩气体）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备 CUDA 的 NVIDIA GPU</td><td></td><td></td><td>请在 https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html 查询兼容性</td></tr><tr><td>Olympus iX71 显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>The Lab Depot</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 模拟加热板</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 EGFR 抗体（Tyr1068）（1H12）小鼠单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552</td><td>Tyrode 缓冲液组分</td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td>危险品</td></tr><tr><td>优质 PLA 线材，直径 1.75 mm</td><td>Raise 3D</td><td>PMS:2035U/RAL:3028</td><td>打印温度范围：205–235 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pro2 3D 打印机</td><td>Raise 3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 1 L 烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 100 mL 储存瓶</td><td>Corning</td><td>1395-100</td><td>用于重复使用甲醇（CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;OH）和丙酮（C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;O）</td></tr><tr><td>Pyrex 250 mL 烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 4 L 烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quad-view 图像分光器</td><td>Photometrics</td><td>Model QV2</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount 细胞计数器，EVE 细胞计数载玻片</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Semrock 发射滤光片：蓝色（445/45 nm）、绿色（525/45 nm）、红色（600/37 nm）、远红（685/40 nm）</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>移液管控制器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>smite 单分子分析软件包</td><td></td><td></td><td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>危险品</td></tr><tr><td>硼氢化钠（NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode 缓冲液组分</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>通过连续加热和 pH 循环激活</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>偏钒酸钠（Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6508</td><td>危险品</td></tr><tr><td>硫酸（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Millipore Sigma</td><td>258105</td><td>危险品</td></tr><tr><td>TetraSpeck 微球</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>多荧光微珠</td></tr><tr><td>Tris（Trizma）碱</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液，0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

一种优化的单分子下拉检测法用于蛋白质磷酸化定量

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

磷酸化是一种必要的翻译后修饰，可调控蛋白质功能并决定细胞信号转导的结果。目前用于检测蛋白质磷酸化的方法无法保留单个蛋白质之间磷酸化状态的异质性。单分子下拉（SiMPull）检测技术通过在玻璃盖玻片上进行蛋白质的免疫沉淀，随后开展单分子成像，用于研究大分子复合物的组成。via 该技术的现有方法经过改进，可在单分子水平上对全长膜受体的磷酸化状态进行稳健的定量分析。通过这种方式对数千个单个受体进行成像，可实现对蛋白质磷酸化模式的定量。本方案详细描述了从样品制备到成像的优化后 SiMPull 操作流程。玻璃表面处理及抗体固定方案的优化进一步提升了数据质量。本方案还提供了单分子数据分析代码，用于计算样品中磷酸化受体所占的比例。尽管本研究聚焦于表皮生长因子受体（EGFR）的磷酸化，但该方案可推广应用于其他膜受体及胞质信号分子。

显示了SiMPull过程的示意图 图1A盖玻片通过NeutrAvidin作为锚定分子，用于结合生物素标记的抗EGFR抗体，从而从总蛋白裂解液中捕获EGFR-GFP。在洗去未结合的蛋白后，磷酸化的受体使用抗磷酸酪氨酸（anti-PY）抗体进行标记15. 图1B 显示疏水性阵列的图像，其中多个样品可在同一盖玻片上制备并成像。该样品载具的一个优点是所需样品体积极小，约为10 µL 需要。可以通过将盖玻片直接放置在显微镜载物台上进行成像。然而，使用盖玻片固定器有助于稳定盖玻片。图中所示的盖玻片固定器 图1B 使用3D打印机制造，蓝图已在 补充编码文件 5疏水性墨水的自发荧光可作为寻找样品焦平面的有用参考图1C）。一个多通道原始图像的示例如下所示 图1D绿色和远红通道原始...

本方案描述了利用改进的单分子下拉（SiMPull）实验对蛋白质磷酸化进行定量的样品制备与数据分析方法。

磷酸化是一种必要的翻译后修饰，可调控蛋白质功能并决定细胞信号转导的结果。目前用于……的方法

该SiMPull方案通过优化抗体标记和固定条件，降低绿色荧光通道中的自发荧光，并提供可靠的单分子分析算法，从而实现对蛋白质磷酸化的定量检测。SiMPull的主要优势在于能够检测单个完整蛋白质分子的磷酸化状态。利用该方法，我们可以获得通过传统技术（如蛋白质印迹和质谱分析）无法获取的新信息。我们有一支研究人员团队协助演示该实验方案。首先，Julian Rojo 将展示如何使用piranha蚀刻盖玻片。随后，Rachel Grattan 将演示盖玻片的包被步骤。接下来，Elizabeth Bailey 将演示如何绘制阵列和图像样本。首先，通过每五分钟轻轻摇动反应烧杯，对盖玻片进行30分钟的piranha蚀刻处理。随后，通过逐渐加入弱碱中和piranha溶液。用玻璃棒将蚀刻的盖玻片转移至布氏漏斗中，并用双蒸水冲洗5分钟。然后将盖玻片放入玻璃染色缸中，加入甲醇覆盖。用封口膜密封盖子，并超声处理10分钟。超声处理后，将甲醇倒入玻璃储存瓶中。用丙酮重复此步骤。在考普林瓶中用双蒸水冲洗盖玻片三次。将盖玻片中的水分沥干，并通过在本生灯火焰上挥动使其干燥。将盖玻片放入干燥的科铂林瓶中。然后向科铂林瓶中加入氨基硅烷溶液，以对盖玻片进行氨基硅烷化处理。盖上盖子，并用封膜密封以避光。用甲醇冲洗盖玻片，并弃去废液。再次用双蒸水冲洗盖玻片，每次两分钟，共冲洗三次。用吸水纸吸去多余水分，并在空气中完全干燥10分钟。接着，使用疏水屏障笔绘制网格阵列。在盖玻片上标记标识符，以确定正确的方向。墨迹干燥后，将盖玻片放入湿化室中。将153毫克mPEG和3.9毫克生物素-PEG溶于609微升10毫摩尔的碳酸氢钠溶液中，涡旋混匀。在室温下以10,000 × g离心1分钟，以去除气泡。每平方区域加入 10 至 15 微升该溶液，完全覆盖芯片表面但避免溢出。将盖玻片置于避光的湿盒中，室温孵育 3 至 4 小时。随后将盖玻片依次浸入三个盛有重蒸水的烧杯中，每个烧杯中洗涤 10 秒。使用氮气去除盖玻片上的所有水分。将盖玻片背对背存放于装有氮气的50毫升锥形管中，并用封口膜密封。用封口膜包裹试管，置于-20摄氏度环境中。从冷冻环境中取出生物素-PEG功能化的阵列，使其平衡至室温。将带有阵列的一面朝上放置于已铺有密封膜的100毫米组织培养皿上。在室温下，用含10毫克/毫升硼氢化钠的PBS溶液孵育阵列的每个方格，孵育时间为4分钟。用 PBS 洗涤三次。接着在 T50 中加入 0.2 毫克/毫升 NeutrAvidin，孵育 5 分钟，随后用 T50 BSA 洗涤三次。再在 T50 BSA 中加入 2 微克/毫升生物素标记的 POI 特异性抗体，孵育 10 分钟，随后进行洗涤。首先，通过移液操作使裂解液解冻并混匀。取一微升裂解液，加入100微升预冷的T50 BSA PPI中进行稀释。将裂解液与芯片共同孵育10分钟，随后进行洗涤。将AF647标记的抗磷酸化酪氨酸抗体溶于预冷的含BSA的T50 PPI缓冲液中，加入芯片，4°C孵育一小时。在物镜上滴加一滴油。将纳米网格置于载物台上进行成像。使用透射白光，聚焦于网格图案。采集20幅网格图像，确保像素未饱和，并将图像序列保存为基准标记。使纳米网格失焦以形成艾里图案，采集20幅图像用于增益校准，并将图像保存为增益图像。然后，通过阻挡所有进入相机的光线，获取20张用于相机偏移的图像，并将这些图像保存为背景。要获取简单的图像，首先清洁油镜并在物镜上添加额外的镜油。将盖玻片阵列固定在显微镜载物台上。依次对每个样本进行成像，首先在远红光通道成像，然后对较短波长的荧光染料进行成像。每30至45分钟检查一次缓冲液液面，并根据需要补充。利用该技术，从总蛋白裂解液中成功捕获了EGFR-GFP。利用疏水性墨水的自发荧光作为定位样品焦平面的参考。原始数据图像通过相机芯片上的光谱通道分离获取。进一步对绿色和远红通道的叠加图像进行分析以获取数据。在从纳米网格获取的图像上执行了通道配准。参考标记图像的叠加显示配准不完全。通过将局部加权均值变换应用于远红和绿色通道坐标，实现了对齐，并用于后续SiMPull数据的配准。对来自 GFP 和 AF647 通道的背景光子计数之上的单个发射源进行框选，并通过高斯定位确定其位置。通过 EGFR-GFP 与 F647 的共定位来识别磷酸化受体，共定位的百分比用于确定磷酸化受体的比例。当使用硼氢化钠处理经食人鱼刻蚀的玻璃时，背景信号显著降低。在裂解液中观察到EGFR-GFP的稳定结合，同时PY99-AF647的非特异性结合极少，表明该方法能够有效保持表面功能化。SiMPull技术可提供有关蛋白质磷酸化的信息，并可用于研究广泛的自体信号传导问题。这有助于加深我们对正常和疾病状态下信号传导的理解。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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