用于蛋白质磷酸化定量的优化单分子下拉测定
2022年6月6日
本方案描述了样品制备和数据分析，以使用改进的单分子下拉（SiMPull）测定来量化蛋白质磷酸化。
该SiMPull方案通过改善抗体标记和固定条件，减少绿色通道中发现的自发荧光并提供强大的单分子分析算法，实现蛋白质磷酸化的定量。SiMPull的主要优点是它允许我们询问单个完整蛋白质的磷酸化状态。通过这种方法，我们可以获得通过传统技术无法获得的新信息，例如蛋白质印迹和质谱分析。
我们有一个研究团队来帮助演示该协议。首先，朱利安·罗霍将展示如何皮兰哈蚀刻盖玻片。然后，雷切尔·格拉坦将展示盖板玻璃的涂层步骤。
伊丽莎白·贝利将展示如何绘制阵列和图像样本。首先，食人鱼蚀刻盖子滑，每五分钟轻轻搅拌一次反应烧杯，持续30分钟。通过逐渐添加弱碱来中和食人鱼溶液。
用玻璃棒将蚀刻的盖子滑入Buchner漏斗中，然后在双蒸馏水中冲洗五分钟。然后将盖玻片放入玻璃Coplin罐中，并用甲醇覆盖。用密封膜密封盖子，并浸泡超声处理10分钟。
超声处理后，将甲醇倒入玻璃储存瓶中。用丙酮重复此步骤。用双蒸馏水在科普林罐中冲洗盖板三次。
从盖玻片中沥干水，并通过在本生燃烧器的火焰中挥手将其干燥。将盖玻片放入干燥的科普林罐中。然后将氨基硅烷溶液加入Coplin罐中，进行覆盖滑移氨基硅烷化。
盖上并涂上密封膜以保护避光。用甲醇冲洗盖玻片，并丢弃用过的溶液。再次，用双蒸馏水冲洗盖板滑三次，每次两分钟。
轻拍掉多余的水分，完全风干 10 分钟。接下来，使用疏水性屏障笔绘制网格阵列。在封面滑轨上标记标识符以标识正确的方向。
墨水干燥后，将盖玻片放入加湿室中。将153毫克mPEG和3.9毫克生物素-PEG重悬于609微升10毫摩尔碳酸氢钠和涡旋中。在室温下以10， 000 x g 离心一分钟以除去气泡。
每平方应用10至15微升该溶液，以完全覆盖阵列而不会溢出。将盖子滑入潮湿室，在室温下在黑暗中储存三到四个小时。然后将盖玻片依次浸入三个装满双蒸馏水的烧杯中10秒钟，将其清洗。
使用氮气清除盖玻片上的所有水分。将盖玻片背靠背存放在装有氮气的50毫升锥形管中，并用密封膜密封。用密封膜包裹管子，并将其置于零下20摄氏度。
从冰箱中取出生物素-PEG功能化阵列，并将其平衡至室温。将盖玻片放在阵列朝上，放在衬有密封膜的100毫米组织培养皿上。在室温下，将阵列的每个正方形与每毫升10毫克的硼氢化钠在PBS中孵育四分钟。
用 PBS 洗涤三次。接下来在T50中孵育每毫升0.2毫克的纽曲阿维丁五分钟，然后用T50 BSA洗涤三次。在T50 BSA中重复每毫升两微克的生物素化POI特异性抗体孵育10分钟，然后洗涤。
首先，通过移液解冻混合裂解物。将一微升裂解物稀释成100微升冰冷的T50 BSA PPI。将裂解物在阵列上孵育10分钟，然后洗涤。
在冰冷的T50 BSA PPI中制备AF647偶联抗磷酸酪氨酸抗体，并在阵列上孵育一小时。在物镜上滴一滴油。将纳米网格放在舞台上进行成像。
使用透射的白光，聚焦在网格图案上。获取网格的一系列20张图像，确保像素不饱和，并将图像系列保存为基准。散焦纳米网格以创建通风图案，获取一系列20张图像以进行增益校准，并将图像保存为增益。
然后获取一系列20张图像，通过阻挡所有光线到相机进行偏移，并保存图像背景。要获得简单的图像，首先，清洁油物镜并在物镜上沉积额外的油。将盖玻片阵列固定在显微镜载物台上。
采集每个样品的图像，首先在远红色通道中，然后是较低波长的荧光团。每30至45分钟检查一次缓冲液水平，并根据需要补充。使用这种技术，从总蛋白裂解物中捕获EGFR-GFP。
疏水性油墨的自发荧光被用作寻找样品焦平面的指南。原始数据图像是在相机芯片上分离的光谱通道采集的。进一步检查了绿色和远红色通道的叠加层以进行数据采集。
对从纳米网格获取的图像进行通道配准。基准图像的叠加显示配准不完整。对齐是通过在远红色和绿色通道坐标上应用局部加权均值变换来完成的，该变换用于注册随后的SiMPull数据。
来自GFP和AF647通道的背景光子计数以上的单个发射器被框住，并执行高斯定位以识别位置。EGFR-GFP在F647中的共定位是为了鉴定磷酸化受体。共定位的百分比用于确定磷酸化受体的比例。
当食人鱼蚀刻玻璃用硼氢化钠处理时，背景检测减少。在裂解物中观察到EGFR-GFP的强健结合，具有最小的非特异性PY99-AF647结合，表明使用该技术保留了表面官能化。SiMPull提供有关蛋白质磷酸化的信息，可以解决广泛的自信号问题。
这可以增强我们对正常和疾病状态下信号传导的理解。
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概述
该SiMPull协议通过改进抗体标记和固定条件实现蛋白质磷酸化的定量。它减少了绿色通道中的自发荧光，并提供了强大的单分子分析算法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 蛋白质分析
背景
- 蛋白质磷酸化是关键的翻译后修饰。
- 西方印迹和质谱等传统技术有其局限性。
- 单分子分析为蛋白质行为提供了新的洞见。
- 该协议旨在提高磷酸化定量的准确性。
研究目的
- 定量单分子水平的蛋白质磷酸化。
- 提高抗体标记和固定的可靠性。
- 提供一种超越传统分析技术的方法。
使用的方法
- 单分子拉下（SiMPull）测定。
- 改进的抗体标记技术。
- 优化的固定条件以减少自发荧光。
- 强大的单分子分析算法。
主要结果
- 增强了蛋白质磷酸化的定量。
- 成功减少了绿色通道中的自发荧光。
- 由研究团队展示了该协议。
- 能够询问单个蛋白质的磷酸化状态。
结论
- SiMPull协议在蛋白质分析方面提供了显著的进步。
- 它允许对之前无法获得的磷酸化进行详细的洞察。
- 这种方法可能在特定应用中取代传统技术。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying protein phosphorylation at the single-molecule level addresses a critical gap in understanding signaling heterogeneity and mechanistic pathway activation in drug discovery. The optimized SiMPull assay enables robust, quantitative assessment of receptor phosphorylation, supporting predictive confidence in target validation and early discovery decisions. This capability enhances portfolio triage by providing high-resolution data on posttranslational modifications relevant to disease biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of phosphorylation status for individual membrane receptors, clarifying pathway activation.
- Supports biological de-risking by revealing heterogeneity in posttranslational modification across protein populations.
- Improves predictive confidence for target engagement and functional validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative single-molecule readouts for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions through optimized antibody labeling and fixation protocols.
- Facilitates reproducible, scalable quantification of phosphorylation for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phosphorylation measurements with disease-relevant signaling pathways for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative modification data.
Pipeline & Workflow Integration
The SiMPull assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for quantitative posttranslational analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying phosphorylation at the single-molecule level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides robust statistical measurements of phosphorylation fractions across thousands of receptors.
- Translational Research: Enables alignment of signaling data with disease models for biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a generalizable protocol adaptable to diverse membrane receptors and signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of phosphorylation assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-resolution modification data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule imaging and quantitative data analysis.
- Demands specialized instrumentation for fluorescence imaging and robust computational infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of antibody labeling and fixation protocols.
- Adaptable to various model systems with protocol optimization for different protein targets.
- Practical limitations include the need for high-quality reagents and careful control of autofluorescence.
