Name: 乳腺活体亚细胞显微镜检查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: 学习使用激光扫描共聚焦和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的技术。该方法利用EGFP和BODIPY染料标记分泌上皮细胞和脂滴，实现高分辨率实时观察细胞动态，为乳腺发育生物学和疾病研究提供重要工具。

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作者感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所的 Sherry Rausch 和 Samri Gebre 在动物管理和护理方面的支持，以及 James Mather 在制作多种塑料垫片过程中提供的帮助。&#160;本研究得到了美国国立卫生研究院院内研究计划（部分）资助。

所有动物实验程序均经美国国家卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心机构动物照护与使用委员会批准，符合美国国家研究委员会《实验动物照护与使用指南》、美国公共卫生服务部《实验动物人道照护与使用政策》以及《实验动物照护与使用指南》的要求。本研究中，将4月龄至5月龄、哺乳第10天的雌性初产小鼠的第4对乳腺组织置于右侧卧位进行手术准备（图1A）。
1. 动物准备
<ol>
	<li>使用顶部加载式天平称量小鼠体重，以计算所需麻醉剂的用量。</li>
	<li>在给予麻醉剂期间及之后，将小鼠置于加热垫上以维持体温。</li>
	<li>通过在氧气饱和的呼吸室中短暂暴露于异氟烷（3.0%-3.5%）来麻醉小鼠（参见 材料表 持续1-2分钟，随后腹腔注射100 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪混合物。</li>
	<li>在手术和成像过程中，通过留置导管（见步骤3.4），每隔约45分钟根据需要追加滴定剂量的赛拉嗪和氯胺酮（剂量为步骤1.3中初始剂量的1/2至1/4），以维持动物处于深度麻醉状态。 
	注意：通过每10-20分钟检查眼睑反射和脚趾夹捏反射，可最简便地维持最佳麻醉平面。清醒小鼠的体温为36.5-38 °C，麻醉状态下体温会降至34.5 °C。</li>
	<li>交叉哺育幼崽22 如果可获得处于相似泌乳阶段的供体小鼠；否则，实施安乐死处理仔鼠。 
	&#8203;注意：幼崽 &#60;10日龄的幼崽应通过暴露于3.0%异氟烷后断头处死。≥10日龄的幼崽应通过CO₂安乐死。2 吸入麻醉后行颈椎脱位处死。</li>
</ol>
2. 手术步骤
<ol>
	<li>手术过程中始终将小鼠置于加热垫上以保持体温。使用手持式电动剃刀剃除第4和第5乳腺（仰卧位，右侧）周围皮肤上的毛发。用碘伏和酒精交替擦拭剃除区域三次进行消毒。</li>
	<li>用70%酒精擦拭所有手术器械。用镊子夹起皮肤，在第四乳头附近做一条长约1 cm的正中切口，并用锐利的剪刀剪开提起的皮肤。沿乳腺向头侧和尾侧方向做环形切口，小心地将皮肤从腹部分离。用生理盐水保持暴露的皮肤湿润。</li>
	<li>为减少出血，在切断明显血管前，使用手持电凝器（见材料表）进行封闭。任何外源性血液应立即用生理盐水清除，以避免后续光学分辨率下降。</li>
	<li>用精细镊子轻轻分离表面层，去除浅层结缔组织和脂肪组织。</li>
	<li>用生理盐水保持暴露的乳腺湿润，并用凝胶和半透明、柔韧的热塑性薄膜保护腹壁（见材料表）。 
	注：步骤2.2–2.5可形成一块皮瓣，其中部分乳腺及其相关血管已从腹壁分离（图1Bi-iv）。</li>
	<li>如需处理，可在手术期间将暴露的乳腺浸入外源性试剂中，例如药理学试剂或细胞器特异性染料。 
	&#8203;注：在所给示例中，EGFPcyto 或 EGFPmembr (mG) 小鼠的脂滴（LDs）使用1.0 mL硼-二吡咯亚甲基（BODIPY）665/676（二甲基亚砜配制的10 mM储备液，用生理盐水稀释1000倍，作用时间&#60;1 h）进行标记；在tdTomatomembr (mT) 或 EGFPmembr (mG) 小鼠中，则使用0.5 mL单丹磺酰戊烷23（二甲基亚砜配制的0.1 M储备液，用生理盐水稀释1000倍，作用5分钟）进行标记。</li>
</ol>
3. 成像准备
<ol>
	<li>将小鼠腹部朝下小心地放置在加热（37 °C）的倒置显微镜载物台上，使皮瓣延伸至中央盖玻片（30 mm）上（图1Biv）。用一层薄凝胶保护暴露区域。</li>
	<li>使用定制的垫片稳定皮瓣，以缓冲呼吸和心跳引起的运动伪影对腺体的影响。具体操作为：将由三根粘合在一起的棉签制成的带缺口垫片（图1Ci）置于皮瓣与体壁之间，并用胶带将后肢和尾巴固定在垫片后方的载物台上（图1Bv）。</li>
	<li>为防止成像过程中皮瓣滑动，将塑料盖板两端牢固地粘贴在载物台开口处（图1Cii）（图1Bv）。</li>
	<li>在背部皮肤下插入留置导管，并连接导管、注射器和泵（见材料表）。</li>
	<li>通过常规荧光显微镜观察确认皮瓣稳定且血流充足（图1Bvi）。</li>
	<li>成像期间用海绵纱布（见材料表）覆盖小鼠以保持体温， 
	&#8203;注意：步骤3.1–3.5是确保获得适用于定量分析的高分辨率视频最关键的步骤。除非已确认组织稳定性，否则不应继续后续操作。</li>
</ol>
4. 显微镜检查
<ol>
	<li>对于用 BODIPY665/676 标记的 EGFPcyto 或 EGFPmembr（mG）小鼠的常规共聚焦显微镜观察（图 2、视频 1 和 视频 2），使用配备预加热 60 倍油浸物镜的倒置显微镜，并维持在 37 °C（参见 材料表）。
	<ol>
		<li>分别使用 488 nm 和 633 nm 激光检测 EGFP 和 BODIPY665/676；对于 EGFP，激发波长为 488 nm，发射波长为 560 nm，采用带通滤光片 BA 505–605；对于 BODIPY665/676，激发波长为 633 nm，发射波长为 668 nm，采用带通滤光片 BA 655–755。</li>
		<li>以每像素 4 或 8 µs 的速度进行逐行扫描采集图像（512 × 512 像素；每像素 12 位），每隔 5 秒或 10 秒采集一次，持续 1–2 小时，并将图像存储为 TIFF 文件。在整个成像过程中通过校正 x/y 漂移手动保持扫描区域在视野内。使用显微镜配套软件从 z 扫描数据构建三维图像（参见 材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于用单丹磺酰戊烷（monodansylpentane）标记的 EGFPmembr（mG）小鼠的双光子显微镜观察（图 3、视频 3），使用配备可调谐激光器和预加热至 37 °C 的 30 倍物镜的倒置显微镜（参见 材料表）。
	<ol>
		<li>在 910 nm 处激发腺体，并使用两个 GaAs 探测器分别检测单丹磺酰戊烷和 EGFP，蓝色发射采用 410–460 nm 带通滤光片，绿色发射采用 495–540 nm 带通滤光片。</li>
		<li>以每像素 2 µs 的速度进行逐行扫描采集图像（320 × 320 像素；每像素 16 位），并将图像存储为 OIR 文件。在整个成像过程中通过校正 x/y 漂移手动保持扫描区域在视野内。使用显微镜配套软件从 z 扫描数据构建三维图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于用单丹磺酰戊烷标记的 tdTomatomembr（mT）小鼠的双光子显微镜观察（图 4、视频 4），使用配备可调谐激光器和预加热至 37 °C 的 63 倍物镜的倒置显微镜（参见 材料表）。
	<ol>
		<li>同时在 800 nm 和 1,060 nm 处激发样品，并使用设置在发射波长 418–471 nm 的 HyD 混合探测器检测单丹磺酰戊烷，使用另一设置在发射波长 595–667 nm 的 HyD 混合探测器检测 TdTomato。</li>
		<li>以 200 Hz 的频率进行逐行扫描采集图像，四线平均（512 × 512 像素；每像素 12 位），并将图像存储为 LIF 文件。在整个成像过程中通过校正 x/y 漂移手动保持扫描区域在视野内。使用显微镜配套软件从 z 扫描数据构建三维图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 安乐死
<ol>
	<li>在成像结束时，按照机构批准的方案，通过吸入 CO2 处死小鼠。</li>
</ol>
6. 实时视频的制作
<ol>
	<li>使用适当的软件将时间序列转换为 TIFF 文件，然后再转换为视频（参见材料表）。 
	注意：特定视频的定量分析超出了本文的范围，需要针对具体问题采用专门的方法。例如，参见 Ebrahim 等人24 关于肌动球蛋白复合物在唾液腺唾液外排中的作用，Meyer 等人25 关于肝脏胆汁分泌动态的研究，以及 Masedunskas 等人9 关于乳腺上皮细胞脂滴分泌的分析。</li>
</ol>

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<li>Russell, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+the+mammary+epithelium+with+adenovirus+vectors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo.</a> Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).</li>
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所有作者均无任何利益冲突需要声明。

使用单光子还是多光子显微镜，取决于所研究的科学问题、待成像组织的性质与位置，以及所需的分辨率。多光子显微镜基于在近红外波段产生两个或更多低能量光子，相较于单光子显微镜，其对组织的穿透深度更大，光毒性更小29,30。此外，荧光分子仅在焦点处被激发，从而减少了来自周围组织的光散射。因此，多光子显微成像已成为研究整个乳腺中细胞谱系追踪1,2,12、肿瘤转移进程3,13以及多细胞相互作用2的标准方法。在低功率下，双光子显微镜可对泌乳腺泡进行深层的整体观察，并评估每个腺泡的时间依赖性分泌状态。然而，多光子显微镜的分辨率低于单光子共聚焦显微镜所能达到的水平<sup class='xre...

活体小鼠乳腺的显微成像技术正日益受到关注，作为一种强大的方法，可用于分析多种生物学现象，包括干细胞的起源与分化1,2、转移性肿瘤的发展进程3,4,5，以及导管巨噬细胞在乳腺发育和退化过程中的作用6。随着活体亚细胞显微成像技术（Intravital Subcellular Microscopy, ISMic）的发展7，研究已拓展至哺乳期的膜运输与分泌机制8,9，以及催产素介导的肌上皮细胞收缩过程9,10。目前已发展出两种主要方法，均利用了乳腺位于皮肤与体壁之间的可及性优势。
在第一种方法中，将一块丙烯酸或玻璃窗片插入皮肤，并用金属固定环固定。1,3,11小鼠对这一手术耐受良好，可在数周内对同一只动物进行间歇性观察，分析多种现象。该方法在谱系示踪研究中已证明尤为有用。1,12 以及监测乳腺肿瘤的侵袭和进展 原位3,11然而，由于腺体仍附着于体壁，会受到呼吸和心跳引起的运动伪影影响，因此实现细胞整体水平以下的分辨率一直较为困难。
在第二种方法中，腺体通过带完整血管系统的皮瓣手术暴露，并使用垫片将其固定在显微镜载物台上4,9,13。由此，腺体的一部分被有效分离于腹壁之外，从而最大限度地减少了运动伪影。大多数情况下，将暴露的实质组织直接置于盖玻片上，小鼠腹面朝下，置于倒置显微镜下观察。在最近的一项改进方法中，小鼠仰卧于正置显微镜上，暴露的腺体被置于一个充满液体、并用盖玻片密封的腔室中加以保护2。后一种配置可在成像过程中便于对实质表面进行实验操作。两种情况下均可实现低于&#60;1 µm的分辨率，使得细胞内过程的分析成为可能，例如对乳腺上皮细胞中脂滴（LDs）的动态追踪9。
本实验方案详细描述了一种利用乳汁分泌过程中脂滴（LDs）的生物合成、转运和分泌为例，在活体水平上对乳腺上皮细胞进行亚细胞级成像的简便方法。该方法可广泛适用于其他多种生物学过程的研究，包括乳蛋白的转运与分泌14、蛋白质从上皮组织浆膜侧向腺泡腔的转胞吞作用15,16，以及乳腺在退化阶段的组织重塑过程17,18。
在大多数活体成像实验中，优先选用表达荧光蛋白的小鼠，以方便选择合适的成像区域，并作为形态学参考标记。目前已有多种适用的转基因和基因敲入小鼠品系，可在细胞器、细胞骨架成分、细胞膜及细胞器中表达荧光蛋白标记物19。在本文所示实例中，使用了EGFPcyto FvB小鼠，该小鼠在大多数细胞中将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）靶向定位于细胞质20（记为EGFPcyto），以及C57BL/6J Tomato（mT/mG）小鼠21，这是一种可表达tdTomato和EGFP双荧光的Cre工具小鼠。通过Cre介导切除tdTomato基因后，可启动EGFP的表达。上述两种荧光蛋白均通过源自MARCKS蛋白的序列元件靶向定位于大多数细胞的质膜21。在本研究中，表达红色荧光蛋白tdTomato的小鼠记为tdTomatomembr（mT），而经tdTomato基因切除后表达EGFP的小鼠记为EGFPmembr（mG）。
小鼠腹侧中线两侧各有五对乳腺，其中胸部区域有三对（编号为1-3），腹股沟区域有两对（编号为4-5）（图1A）。在活体显微成像（ISMic）中，腹股沟乳腺最易于接近和稳定固定，因为它们距离胸腔内与呼吸和心跳相关的整体运动最远。

<table><tbody><tr><td>488 激光器</td><td>Melles-Griot</td><td>-</td><td>CW&amp;nbsp; 激光器，50 mW</td></tr><tr><td>60倍 PLAPON 油浸物镜（NA 1.42）</td><td>Olympus</td><td>1-U2B933</td><td>共聚焦显微镜物镜</td></tr><tr><td>633 激光器</td><td>Melles-Griot</td><td>-</td><td>CW He-Ne 激光器，12 mW</td></tr><tr><td>63倍物镜（NA 1.40，HC PL APO CS2）</td><td>Leica</td><td>11506350</td><td>双光子显微镜物镜</td></tr><tr><td>BA 410-460 nm</td><td>Chroma</td><td>-</td><td>带通滤光片</td></tr><tr><td>BA 495-540 nm</td><td>Chroma</td><td>-</td><td>带通滤光片</td></tr><tr><td>BA 505-605 nm</td><td>Chroma</td><td>-</td><td>带通滤光片</td></tr><tr><td>BA 655-755 nm</td><td>Chroma</td><td>-</td><td>带通滤光片</td></tr><tr><td>硼-二吡咯甲烷（BODIPY）665/676</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B3932</td><td>脂质过氧化传感器</td></tr><tr><td>卡波姆-940</td><td>Snowdrift Farm</td><td>739601480651</td><td>凝胶</td></tr><tr><td>导管</td><td>Terumo</td><td>SV27EL</td><td>带翼输液套件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电灼器&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>GEM 5917</td><td>电灼系统</td></tr><tr><td>CMV-Cre 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson lab</td><td>006054</td><td>小鼠品系</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Bioptechs</td><td>-</td><td>适用于倒置显微镜的直径30 mm盖玻片</td></tr><tr><td>Curity 4x4 英寸通用海绵纱布</td><td>Covidien</td><td>9024</td><td>海绵</td></tr><tr><td>EGFP&lt;sub&gt;cyto&lt;/sub&gt; 小鼠</td><td>Jackson lab</td><td>003291</td><td>小鼠品系</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 软件</td><td>开源</td><td>-</td><td>免费软件工具</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>FC003 8</td><td>组织镊</td></tr><tr><td>Fluoview 1000 显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>FluoView 软件</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>共聚焦显微镜和双光子显微镜软件</td></tr><tr><td>手持式电动剃须刀</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>CLP-8786-451A</td><td>无线推剪</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>DPIP</td><td>动物用加热垫</td></tr><tr><td>HyD 检测器</td><td>Leica</td><td>-</td><td>Leica 4Tune 光谱检测器</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane / Oxford instruments</td><td>-</td><td>商业软件工具</td></tr><tr><td>Insight X3 可调谐激光器</td><td>Spectra Physics</td><td>Insight X3</td><td>可调谐脉冲激光器</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>VetOne</td><td>13985-046-40</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>氯胺酮&amp;nbsp;</td><td>VetOne</td><td>13985-702-10</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>LAS X 软件</td><td>Leica</td><td>-</td><td>双光子显微镜软件工具</td></tr><tr><td>Mai-Tai 可调谐激光器</td><td>Spectra Physics</td><td>Mai-Tai</td><td>激光器</td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>商业软件工具</td></tr><tr><td>单丹磺酰戊烷 AUTODOT</td><td>Abcepta</td><td>Sm1000a</td><td>脂滴染料</td></tr><tr><td>MPE-RS 显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td>双光子显微镜</td></tr><tr><td>mT/mG 小鼠</td><td>Jackson lab</td><td>007676</td><td>小鼠品系</td></tr><tr><td>物镜加热器</td><td>Bioptechs</td><td>150819</td><td>适用于共聚焦和双光子显微镜的物镜加热器</td></tr><tr><td>氧气饱和呼吸室</td><td>Patterson Scientific</td><td>78933385, SAS3 和 EVAC4</td><td>气体麻醉与排空系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS234526B</td><td>半透明、柔韧、热塑性薄膜</td></tr><tr><td>PMT 检测器</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>解扫描&amp;nbsp;&amp;nbsp;检测器</td></tr><tr><td>PMT 检测器</td><td>LSM-Technology</td><td>定制</td><td>非解扫描检测器</td></tr><tr><td>泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703602, 704402</td><td>纳升微量注射器及控制器</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Quality Biological</td><td>114-055-721EA</td><td>正常生理盐水</td></tr><tr><td>锋利的钝头剪刀</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SCT-S 508</td><td>外科剪刀</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Covidien</td><td>22-257-150</td><td>1 mL 结核菌素注射器</td></tr><tr><td>TCS SP8 Dive 光谱显微镜</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>双光子显微镜</td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>FC032</td><td>组织镊</td></tr><tr><td>赛拉嗪&amp;nbsp;</td><td>VetOne</td><td>13985-704-10</td><td>麻醉剂</td></tr></tbody></table>

活体乳腺组织亚细胞显微成像

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

乳腺构成了一种模型 卓越的 用于研究上皮细胞功能，包括组织重塑、细胞极性和分泌机制。妊娠期间，乳腺从脂肪垫中一个原始的导管结构发育为高度分支的腺泡网络，为初乳和乳汁的生成与分泌做好准备。产后，乳腺提供新生儿存活所需的全部营养物质，包括膜包被的脂滴（LDs）、蛋白质、碳水化合物、离子和水。多种乳汁成分，如乳糖、酪蛋白胶束和脱脂乳蛋白，在腺泡细胞内合成，并通过顶膜的胞吐作用从囊泡中分泌。脂滴在粗面内质网合成后被转运至细胞顶端，包裹细胞膜并以独特的顶浆分泌方式释放。其他预先形成的成分，如抗体和激素，则通过跨细胞转运从上皮的血清侧进入乳汁。由于乳腺属于皮肤腺，可直接进行实验操作，这些过程适合活体显微观察。本文介绍了一种简便的方法，用于研究脂滴分泌的动力学 原位在活体麻醉小鼠中实时进行。硼-二吡咯甲烷（BODIPY）665/676&#160;或使用单丹磺酰戊烷标记表达可溶性EGFP（增强型绿色荧光蛋白）的转基因小鼠中性脂质组分，这些小鼠的细胞质中表达EGFP，或表达与EGFP或tdTomato融合的膜靶向肽。膜定位的融合蛋白可作为细胞表面标记物，而脂质染料可分辨直径≥0.7 µm的脂滴。可通过标准激光扫描共聚焦显微镜在组织深度达15–25 µm处进行时间序列成像，或采用多光子显微镜对更深层组织进行成像。在手术过程中，可将乳腺组织持续暴露于药理学试剂或荧光染料中，从而为急性实验干预提供操作平台。

乳汁由极化的腺泡上皮细胞分泌，这些细胞在妊娠期间从复杂的导管树状结构的芽状分支中分化而来26（图2A）。乳汁合成的前体物质通过基底侧/外侧膜被吸收，最终产物则通过顶膜分泌至中央的“乳腔”中。每个腺泡的基底侧被星状排列的肌上皮细胞所包绕（图2A），其浆膜侧由基底膜保护（在图2A中未显示）。在“泌乳反射”过程中，催产素诱导肌上皮细胞收缩，促使分泌细胞中的脂滴（LDs）释放9,27，并将完成的乳汁产物经导管系统推向乳头，供哺乳的新生儿摄取10。 throughout，腺体的生理功能依赖于下方毛细血管床持续提供的血液来源物质维持。
利用ISMic技术，成像可穿透至毛细血管床、细胞外基质、肌上皮细胞和分泌...

本实验方案描述了一种利用激光扫描共聚焦显微镜和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的简便技术。

乳腺是研究上皮细胞功能的极佳模型，包括组织重塑、细胞极性和分泌功能等。

首先，将脱毛并麻醉的小鼠置于加热垫上。用镊子夹住第四乳头附近的皮肤，用锋利的剪刀剪开提起的皮肤，做一个约一厘米长的正中切口。沿腺体分别向头侧和尾侧做环形切口，并小心地将皮肤从腹部剥离。使用生理盐水及时清除任何外源性血液，以避免后续光学分辨率下降。为减少失血，使用手持电凝器封闭任何明显的血管。然后用精细镊子轻轻剥离表面层，以去除浅层结缔组织和脂肪组织。用生理盐水保持暴露的腺体湿润。如有需要，可在手术期间通过将暴露的腺体浸入外源性试剂（例如药理学试剂或细胞器特异性染料）中来处理腺体。用半透明、柔韧的热塑性薄膜保护腹壁。将小鼠腹部朝下小心地放置在倒置显微镜载物台上，使皮肤瓣延伸至中央盖玻片上。用一层薄凝胶保护暴露区域。用胶带将后肢和尾巴固定在载物台上。然后将由三根用胶带固定的棉棒制成的定制缺口垫片置于皮瓣与体壁之间，以缓冲呼吸和心跳引起的运动伪影对腺体的影响。在成像平台开口的两端牢固地用胶带固定塑料覆盖膜，防止皮瓣在成像过程中滑动。将一根皮下留置导管插入背部皮肤下方，并连接至导管、注射器和泵。采用常规荧光显微镜确认皮瓣稳定且血流充足。对用 BODIPY 665676 标记的 EGFP cyto 或 EGFP 膜型小鼠进行常规共聚焦显微镜成像，并对用单丹磺酰戊烷标记的 EGFP 膜型小鼠以及用单丹磺酰戊烷标记的 tdTomato 膜型小鼠进行双光子显微镜成像。在 EGFP cyto 小鼠中，分泌性上皮细胞的细胞质被 EGFP 明显标记。同时，经BODIPY 665676染色的脂滴呈现为圆形荧光结构，尤其集中在顶端表面。延时成像分析显示，BODIPY 665676染色的脂滴以不同的速度从基底侧向顶端区域移动，并在运输过程中相互融合。在EGFP膜标记小鼠中，EGFP清晰显示了毛细血管和分泌性上皮细胞的细胞膜，而BODIPY染色的脂滴在整个细胞质中均可见。对表达EGFP膜蛋白或tdTomato膜蛋白的小鼠乳腺进行双光子显微成像，可更全面地观察腺体形态。通过二次谐波生成技术，在单丹磺酰戊烷通道中可观察到表面的胶原纤维。在腺实质 deeper 区域，分泌性上皮细胞的基底侧、侧方及顶膜质膜清晰可见，同时可见经单丹磺酰戊烷染色的脂滴。中央管腔在肺泡内部更为明显。红色荧光蛋白tdTomato在标记毛细血管内皮方面尤为有效，与EGFP cyto小鼠中的EGFP不同。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

乳腺活体亚细胞显微镜检查

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。...

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

活体显微成像是一种强大的工具，能够对活体动物中的多种生物学过程进行成像。本文介绍了一种详细的方法，用于对活体小鼠唾液腺中分泌颗粒等亚细胞结构动态进行成像。...

活体小鼠中表达荧光蛋白的亚细胞结构成像的活体显微镜技术

本文介绍了一种非侵入性地向小鼠乳腺导管递送水溶性试剂的实验方案。该方法通过将试剂局部注射至乳腺乳头，特异性地靶向乳腺导管。此技术可适用于多种化合物，包括siRNA、化疗药物和小分子化合物。...

乳腺导管内注射实现药物对小鼠乳腺的局部递送

本文所述的间接免疫荧光实验方案可用于检测和定位小鼠乳腺组织中的蛋白质。文中提供了完整的实验方法，包括乳腺组织样本的制备、免疫组织化学染色、荧光显微镜下组织切片的成像，以及图像的重建。...

小鼠乳腺组织冰冻切片的间接免疫荧光染色

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内...

延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

本文介绍了一种通过导管内注射将试剂局部递送至兔乳腺的技术。此外，我们还描述了一种利用高分辨率超声成像对造影剂进行可视化并确认递送效果的实验方案。...

向兔乳腺导管内递送

本文介绍了一种分离完整小鼠乳腺组织以研究细胞外基质（ECM）表达及导管形态的实验方案。从小鼠第4对腹部乳腺中获取8至10周龄未产雌性小鼠的乳腺组织，经中性缓冲甲醛固定后进行切片，并采用免疫组织化学方法对细胞外基质蛋白进行染色。...

完整小鼠乳腺腺体的分离及其细胞外基质表达与腺体形态学分析

本文介绍了一种利用光学透明硅胶窗进行长期活体成像的方法，该窗口可直接粘接于目标组织/器官及皮肤上。 与其他目前常用的方法相比，这些窗口成本更低且更具灵活性，且手术植入过程对动物造成的炎症反应和不适程度较轻。...

通过透明硅胶窗进行纵向活体成像

本方案描述了一种带有可更换盖板的新型乳腺成像窗（R.MIW）。植入R.MIW后，可通过活体显微镜对健康及病变乳腺组织在不同发育阶段进行长期、多日、细胞分辨率的成像观察。...

使用可更换盖板的乳腺成像窗进行纵向活体显微成像

本文所述的活体成像方法利用胶原蛋白的二次谐波生成以及代谢辅因子NAD(P)H的内源性荧光，对未标记的肿瘤微环境进行无创分割，将其划分为肿瘤、间质和血管等区域，从而实现对4D活体成像数据的深入分析。...

一种用于活体成像乳腺肿瘤微环境的无标记分割方法

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体内 通过乳腺导管内注射将基因递送至小鼠乳腺上皮细胞

学习使用激光扫描共聚焦和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的技术。该方法利用EGFP和BODIPY染料标记分泌上皮细胞和脂滴，实现高分辨率实时观察细胞动态，为乳腺发育生物学和疾病研究提供重要工具。

活体乳腺组织亚细胞显微成像

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