Name: 细胞外葡萄糖消耗作为细胞和组织离体葡萄糖摄取的间接测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学习细胞外葡萄糖消耗测定法，用于高通量筛选细胞和组织中的葡萄糖摄取动力学。该方法以3T3-L1小鼠成纤维细胞为模型，为糖尿病、癌症等代谢疾病的治疗发现提供重要工具。

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本项目得到了Ralph和Marian Falk医学研究催化剂奖以及Kathleen Kelly奖的支持。其他支持包括美国国家研究资源中心（UL1RR025755）和美国国家癌症研究所P30CA16058（OSUCCC）以及美国国立卫生研究院（NIH）医学研究路线图计划。本内容仅由作者负责，不代表国家研究资源中心或美国国立卫生研究院的官方观点。

动物实验已获得俄亥俄州立大学（OSU，方案编号 2007A0262-R4）机构动物护理与使用委员会的批准。
注意：所有操作必须在II级生物安全柜中进行，且风机应保持开启，灯光关闭。
1. 材料准备
注意：所有材料均列于材料表中。
<ol>
	<li>在 II 级生物安全柜中，根据表 1配制培养基 1、离心用培养基 2，以及荧光标记的 2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖（2-NBDG 或 FD-葡萄糖）的储存液和工作液。实验过程中需避光操作，可通过关闭生物安全柜内所有光源来保护 FD-葡萄糖免受光照。</li>
	<li>使用即用型细胞培养试剂：胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲液（PBS）以及无葡萄糖且无酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（下文简称无葡萄糖 DMEM）。</li>
	<li>使用 20 mL 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液。 
	&#8203;注意：在以下部分中，将在有或无胰岛素刺激的 3T3-L1 成纤维细胞中，比较不同剂量 FD-葡萄糖的胞外耗竭与胞内摄取情况（图 2）。</li>
</ol>
2. 3T3-L1 细胞培养与维持
<ol>
	<li>将3T3-L1小鼠成纤维细胞以每20 mL培养基1中稀释1 × 106个细胞的密度接种于两块96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，并在加样过程中通过混匀确保悬液均匀。将细胞置于37 °C培养箱（5% CO2、95%湿度）中培养48小时，期间不更换培养基，直至细胞融合度达到约70%–80%。</li>
	<li>继续在相同培养基中培养细胞，使其保持融合状态并进行饥饿处理，培养时间为48小时。根据所需的饥饿分解代谢状态，可将培养时间调整为24–72小时。</li>
</ol>
3. 3T3-L1 细胞的饥饿处理
<ol>
	<li>从96孔板的细胞中倾去培养基，用无菌纸巾吸去残留液体。</li>
	<li>每孔加入100 μL PBS清洗一次，再用无菌纸巾吸去残留液体。</li>
	<li>每孔加入100 μL无葡萄糖DMEM培养基，孵育40分钟。根据细胞类型、刺激条件和所需的饥饿程度调整孵育时间。 
	&#8203;注意：孵育时间可能需要根据季节进行优化。</li>
</ol>
4. 不同浓度荧光素标记葡萄糖溶液的制备
注意：图2中的实验检测了在有胰岛素刺激和无胰岛素刺激条件下的细胞外和细胞间介质。
<ol>
	<li>每种刺激条件使用八个重复（即一个96孔板中的一整行）。因此，每种刺激条件需准备1 mL溶液（具体见表2及下文说明）。</li>
	<li>使用一个96孔板设置八种不含胰岛素的刺激条件：分别含2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL的FD-葡萄糖，以及0 μg/mL（不含FD-葡萄糖的对照）。</li>
	<li>使用另一个96孔板设置八种含胰岛素（终浓度为10 μg/mL）的刺激条件：分别含2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL的FD-葡萄糖，以及0 μg/mL（不含FD-葡萄糖的对照）。</li>
	<li>为配制刺激条件，取1 μL的5 mg/mL FD-葡萄糖工作液（见表1），加入999 μL无葡萄糖DMEM培养基中，得到1 mL工作储备液（1:1000稀释，终浓度为5 μg/mL）。
	<ol>
		<li>使用该工作储备液，在生物安全柜避光条件下，立即在2 mL离心管中依次进行1:2000、1:5000、1:10,000、1:25,000、1:50,000和1:100,000稀释，以获得终浓度分别为2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL和0.05 μg/mL的FD-葡萄糖溶液（见表2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤4.4，并向上述各条件中分别加入1 μL胰岛素（10 mg/mL，终浓度）。 
	&#8203;注意：这些样品中胰岛素的终浓度为10 μg/mL = 1.7 nmol/mL。为确保充分混匀，应在加入其他溶液前先将胰岛素加入各离心管中。</li>
</ol>
5. 处理饥饿处理的3T3-L1细胞
<ol>
	<li>孵育40分钟后，从96孔板的每个孔中倾倒出无葡萄糖的DMEM，并用无菌纸巾吸去残留液体。</li>
	<li>将上述不同处理条件的溶液分别取100 μL（每孔）加入到两块96孔板中某一列的各孔中，同一处理条件的溶液分别取100 μL（每孔）加入到同一行的各孔中（共八个重复）。标记使用胰岛素和未使用胰岛素的培养板。对照孔中仅加入无葡萄糖的DMEM（n = 8）。</li>
	<li>将培养板置于细胞培养箱中避光孵育40分钟（37 °C，5% CO2，95%湿度）。</li>
</ol>
6. 刺激后3T3-L1细胞的细胞外和细胞间测量
<ol>
	<li>细胞刺激40分钟后，将两块培养板中的刺激液转移至新的96孔板中，保持相同的实验布局。</li>
	<li>将原有含细胞的刺激96孔板中残留的溶液倾弃于无菌纸巾上。</li>
	<li>可选步骤：用PBS洗涤细胞。移除PBS后，将残留液体倾弃于无菌纸巾上。</li>
	<li>向每个孔中加入100 μL RIPA裂解缓冲液。可选步骤：向RIPA缓冲液中添加蛋白酶抑制剂以保护蛋白质。将含有RIPA缓冲液的培养板置于摇床上孵育30分钟。</li>
	<li>使用酶标仪（材料表），分别在激发（Ex）485 nm和发射（Em）535 nm波长下检测荧光，首先测定含有胞外FD-葡萄糖的培养基，然后在30分钟孵育结束后测定RIPA裂解细胞的培养板（见步骤6.4）。</li>
</ol>
7. 基于蛋白质的细胞内葡萄糖摄取归一化
注意：细胞内FD-葡萄糖的摄取量取决于细胞数量。细胞裂解液中的蛋白水平与细胞数量成正比，因此可将每个孔中的细胞内FD-葡萄糖水平归一化至该孔中的细胞数量。
<ol>
	<li>根据制造商说明书进行BCA蛋白测定（参见材料表）。定量每个含有RIPA裂解细胞的孔中的蛋白浓度。</li>
	<li>使用10 μL RIPA匀浆液，在96孔板中每个样本设三个复孔，以提高蛋白浓度测定的准确性。</li>
	<li>基于与样品在同一96孔板上分析的蛋白标准品（0、10、20、30、40、50和60 μg/mL蛋白）定量蛋白浓度。</li>
	<li>在562 nm处测定吸光度，并根据蛋白标准品所得线性回归公式计算每个样本的蛋白浓度。</li>
	<li>通过每个孔的荧光值/蛋白浓度对细胞内FD-葡萄糖水平进行归一化处理。细胞外FD-葡萄糖消耗量无需归一化。</li>
	<li>可选：使用对照样本的平均基线值进行额外归一化处理（设为100%）。</li>
</ol>
8. 离体 器官中细胞外FD葡萄糖消耗量的测定
<ol>
	<li>在器官解剖前，对小鼠进行促进葡萄糖代谢的化合物预处理，步骤如下。</li>
	<li>使用9周龄的雄性Lepob小鼠（n = 11）。实验前所有小鼠均饲喂常规饲料。</li>
	<li>将小鼠随机分为三组，进行腹腔内（i.p.）注射。
	<ol>
		<li>对照组Lepob小鼠注射0.1 mL无菌PBS（n = 4）。</li>
		<li>胰岛素处理组Lepob小鼠注射含每克体重12 IU人胰岛素的无菌PBS 0.1 mL（n = 3）。</li>
		<li>AAC2处理组Lepob小鼠注射含每克体重0.1 nmol AAC2的无菌PBS 0.1 mL（n = 4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射15分钟后，通过吸入5%异氟烷麻醉小鼠，并对麻醉动物进行心脏穿刺取血以放血处死26。</li>
	<li>解剖每只小鼠的内脏附睾白色脂肪组织（200 mg）、肝脏（200 mg）和全脑。组织操作应在II级生物安全柜中进行。</li>
	<li>在II级生物安全柜中避光条件下，用无葡萄糖DMEM配制FD-葡萄糖（0.29 mM）工作液。</li>
	<li>使用酶标仪在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测定FD-葡萄糖工作液（0.29 mM）的荧光强度。</li>
	<li>将收获的组织/器官置于含PBS的6孔板中孵育1分钟。每种组织或器官应在独立孔中处理。</li>
	<li>1分钟后，将每种组织置于无菌纸巾上以吸除PBS。随后将组织/器官转移至另一6孔板中，每孔含4,000 µL无葡萄糖DMEM，孵育2分钟。</li>
	<li>2分钟后，取出组织并转移至新的6孔板中，每孔含0.29 mM FD-葡萄糖工作溶液1 mL。将含有组织的6孔板置于37 °C、5% CO2和95%湿度条件下孵育。</li>
	<li>在孵育0、10、20、30、40、60、90和120分钟时，从每个孔中收集100 µL FD-葡萄糖工作液，用于分析细胞外FD-葡萄糖消耗的动力学。收集前后均需震荡混匀。</li>
	<li>将100 µL FD-葡萄糖工作液转移至96孔板中，使用酶标仪在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测定荧光强度。</li>
	<li>将各时间点的荧光值相对于0分钟（设为100%）进行归一化处理，以表示每只动物各器官的数据（图3）。</li>
</ol>

<ol><li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568(2021).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19%3F+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+Metabolic+Syndrome%3A+Clinical+Research+%26+Review%22%5BJournal%5D)">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556(2021).</li>
<li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of%3A+%282S%2C4R%29-4-%5B%2818%29F%5DFluoroglutamine%2C+%5B%2811%29C%5DMethionine%2C+and+2-Deoxy-2-%5B%2818%29F%5DFluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET%2FCT+systems+imaging+rat+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358(2021).</li>
<li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li>
<li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia%3A+Implications+for+function%2C+growth%2C+and+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959(2020).</li>
<li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574(2021).</li>
<li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications%3A+The+signals+at+the+intersection+of+exercise%2C+glucose+uptake%2C+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+report+on+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li>
<li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental%2Flifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131(2017).</li>
<li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275(2020).</li>
<li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE%3A+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li>
<li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes%3A+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li>
<li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+signatures+underlying+inflammation%3A+an+interplay+of+nutrition%2C+physical+activity%2C+metabolic+diseases%2C+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218(2021).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839(2020).</li>
<li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li>
<li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+%28glucose+transporter+1%29+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117(2020).</li>
<li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697(2020).</li>
<li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li>
<li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+PET+imaging+with+%5B%2818%29F%5DFDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li>
<li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li>
<li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266(2007).</li>
<li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat%2C+decreases+resistin%2C+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198(2016).</li>
<li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li>
<li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).</li>
<li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li>
<li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li>
<li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET%2FCT+in+normal+organs%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140(2018).</li>
<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li>
<li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docosahexaenoic+acid%2C+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li>
<li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li>
<li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+adaptation+by+Na%28%2B%29-dependent+transporters+and+ACE2%3A+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460(2020).</li>
<li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification%3A+comparison+with+other+cell+quantification+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515(2021).</li>
<li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+clamp+technique%3A+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li>
</ol>

作者无任何问题需要披露，且不存在利益冲突。

在细胞培养中，细胞外FD-葡萄糖消耗量与标准化的细胞内葡萄糖摄取量的直接比较显示出高度相关性，提示细胞外FD-葡萄糖消耗可作为评估葡萄糖摄取的替代指标。细胞外FD-葡萄糖的检测可使用较宽范围的FD-葡萄糖浓度，其中0.5–2.5 μg FD-葡萄糖/mL似乎为最佳范围。与细胞内FD-葡萄糖摄取不同，细胞外FD-葡萄糖检测无需对细胞数量或蛋白浓度进行归一化处理。&#160;细胞外FD-葡萄糖检测的预期局限性在于，活性氧诱导剂以及组织外植体中微量血液可能淬灭荧光信号，从而影响检测结果。其他影响荧光的环境因素（如光照）也应予以考虑。在使用多个组织外植体时，较长的操作时间可能损害组织活力及葡萄糖代谢，这可能是另一项限制因素。切除的组织需保持较小的尺寸范围（50–300 mg），以确保葡萄糖能够渗透至组织内部。由多名操作者同时处理组织可缩短操作时间。尽管我们未直接测量组织外植体内部的葡萄糖摄取，但既往在培养组织外植体中的累积观察表明，这些组织可在含葡萄糖的培养基中存活长达17天，但其功能会逐渐丧失33。本实验方案中，外植体的短时间孵育可实现对相对功能正常组织中葡萄糖代谢的监测。在具有复杂细胞结构的组...

随着多种依赖葡萄糖代谢的疾病呈流行性增长，对葡萄糖摄取进行测量的需求也日益增加。退行性代谢性疾病、神经与认知障碍1、炎症2和感染性疾病3、癌症4,5以及衰老6等疾病的潜在机制均依赖于葡萄糖代谢以获取能量及其储存、合成代谢过程、蛋白质和基因修饰、信号传导、基因调控以及核酸的合成与复制7,8,9。糖尿病（DM）直接与葡萄糖摄取调节功能障碍相关。DM 是一组慢性疾病谱系，包括1型、2型和3型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年发病型成人糖尿病以及其他由环境和/或遗传因素引起的糖尿病类型。2016年，世界卫生组织（WHO）首次发布的《全球糖尿病报告》显示，患有最常见类型DM的成年人数量自1980年以来几乎增长了近四倍，达到4.22亿人10，且过去几十年来DM患者人数呈指数级上升。仅在2019年，估计有150万人的死亡直接归因于DM10。这一显著增长主要归因于2型DM的增加及其驱动因素，包括超重和肥胖10。COVID-19大流行揭示出DM患者的死亡率较普通人群高出一倍，提示葡萄糖代谢在免疫防御中具有深远但尚未充分理解的作用3。预防、早期诊断和治疗DM、肥胖症及其他相关疾病，需要优化对不同组织葡萄糖摄取的测量方法，并识别影响葡萄糖摄取的环境11、营养12、内分泌13、遗传14和表观遗传15因素。
在研究中，细胞内和/或组织对葡萄糖的摄取通常通过荧光标记的葡萄糖（FD-葡萄糖）在体外in vitro16,17,18 和体内 in vivo19 进行测定。相较于使用放射性标记葡萄糖20、分析型质谱分析21、代谢组学22、核磁共振技术23 以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）5,24 等更为精确的方法，FD-葡萄糖已成为更受青睐的技术。与FD-葡萄糖摄取不同，需要更多生物样本的分析方法可能涉及多步骤的样品制备、昂贵的仪器设备以及复杂的数据分析过程。在细胞培养中对FD-葡萄糖摄取进行有效且低成本的检测已被用于概念验证实验，但可能需要通过其他方法进一步验证。
FD-葡萄糖用于葡萄糖摄取研究的基础在于其相较于内源性葡萄糖代谢速率较低25。然而，内源性葡萄糖和FD-葡萄糖均会在所有细胞区室之间动态分布，参与合成代谢、分解代谢及信号传导过程。FD-葡萄糖的区室化分布及其随时间变化的代谢过程25会干扰荧光检测结果，成为该方法在高通量筛选、动力学分析、三维细胞培养、共培养以及组织外植体实验中应用的主要限制因素。本文提供的数据表明，FD-葡萄糖在细胞外的消耗量与其细胞内摄取量之间存在高度相关性，提示可通过检测细胞外FD-葡萄糖的减少来间接反映细胞内葡萄糖的摄取情况。该细胞外葡萄糖消耗的检测方法已被用于验证经胰岛素及一种实验性药物处理的小鼠在不同组织间葡萄糖摄取的差异，从而证明了该方法的可行性18。
本方案描述了在3T3-L1细胞中进行FD-葡萄糖摄取的胞内和胞外（图1）测定。方案第1-7节介绍了细胞培养与生长48小时；细胞饥饿、刺激及胞外基础水平测定；以及刺激后胞外FD-葡萄糖、胞内FD-葡萄糖和蛋白的测定。方案第8节描述了在存在或不存在胰岛素及&#160;氨基酸化合物2（AAC2，其他文献中已有描述）的条件下，对从ob/ob小鼠分离的组织进行FD-葡萄糖胞外摄取的ex vivo测定18。

<table><tbody><tr><td>3T3-L1 小鼠成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>CL-173</td><td>细胞系</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353227</td><td>塑料器皿</td></tr><tr><td>B6.V-Lepob/J 雄性小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>货号 000632</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 模块化多功能微孔板读板仪 (Fisher Scientific, US)</td><td>Fisher Scientific, US</td><td>&amp;nbsp;B-SHT</td><td>设备</td></tr><tr><td>牛血清</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>161790-060</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>小牛血清</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>26010-066</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Forma</td><td>Series II Water Jacket</td><td>设备</td></tr><tr><td>饲料（小鼠/大鼠饲料，辐照处理）</td><td>Envigo</td><td>Teklad LM-485</td><td>饲料</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma LifeScience</td><td>D2650-100mL</td><td>试剂</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;11965-092</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500mL</td><td>试剂</td></tr><tr><td>荧光标记 2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>72987-1MG</td><td>检测</td></tr><tr><td>无葡萄糖且无酚红的 DMEM 培养基</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>A14430-01</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>人胰岛素 10 mg/mL</td><td>MilliporeSigma, 货号 91077C</td><td>货号 91077C</td><td>试剂</td></tr><tr><td>异氟烷，5%</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 (P/S)</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DA537-500 mL</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Pierce 二辛可宁酸 (BCA) 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>货号 N23225</td><td>检测</td></tr><tr><td>放射免疫沉淀分析裂解缓冲液</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24948</td><td>检测</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;25300-054</td><td>细胞培养</td></tr></tbody></table>

细胞和组织离体外环境中葡萄糖摄取的间接检测方法：细胞外葡萄糖耗竭法 ex vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

糖尿病在全球范围内的持续流行增加了人们对影响葡萄糖摄取的环境、营养、内分泌、遗传和表观遗传因素的识别需求。体外检测细胞对荧光标记葡萄糖（FD-葡萄糖）的摄取，或体内成像葡萄糖消耗组织，通常采用细胞内荧光测定这一广泛使用的方法。该检测方法用于评估在特定时间点的葡萄糖摄取情况。细胞内分析的前提是，FD-葡萄糖的代谢速度慢于内源性葡萄糖，后者参与分解代谢、合成代谢反应及信号传导过程。然而，动态的葡萄糖代谢也会改变葡萄糖的摄取机制，因此需要针对不同因素进行葡萄糖摄取的动力学测定。本文介绍了一种测量细胞和组织离体条件下胞外FD-葡萄糖消耗的方法，并验证了其与细胞内FD-葡萄糖摄取的相关性。胞外葡萄糖消耗方法可能适用于高通量的动力学和剂量依赖性研究，以及识别具有血糖调节活性的化合物及其组织特异性效应。

在3T3-L1前脂肪细胞中，检测了不同浓度FD-葡萄糖在有或无胰岛素刺激条件下细胞内摄取及细胞外葡萄糖消耗的情况（图 2）。图 2A 显示，细胞内FD-葡萄糖的摄取呈剂量依赖性增加，且在胰岛素存在时显著增强。相同细胞中细胞外FD-葡萄糖水平的相应降低如 图 2B 所示，经胰岛素刺激后，细胞外FD-葡萄糖水平显著低于未加胰岛素的样本。在有或无胰岛素的样本中，细胞内FD-葡萄糖的摄取与细胞外FD-葡萄糖的消耗呈剂量依赖性的相关关系（图 2C）。因此，细胞外FD-葡萄糖的消耗可与细胞内FD-葡萄糖摄取以相当的准确性（R2 = 0.99，P &lt; 0.001）反映葡萄糖摄取的变化。
接下来，建立了一种实验体系，用于验证在经典及实验性葡萄糖摄取诱导剂刺激下，不同组织中细胞外FD-葡萄糖摄取在动力学研究中的应用<strong cla...

荧光标记葡萄糖的细胞外耗竭与葡萄糖摄取相关，可用于离体器官和细胞培养中葡萄糖摄取的高通量筛选。

细胞和组织离体外环境中葡萄糖摄取的间接检测方法：细胞外葡萄糖耗竭法 Ex Vivo

全球范围内持续蔓延的糖尿病流行病加剧了人们对环境、营养、内分泌、遗传和表观遗传等因素识别的需求……

葡萄糖摄取是理解健康与疾病的关键。由于葡萄糖在人体的代谢和结构需求中发挥核心作用，同时在调控过程中也具有重要作用。细胞外葡萄糖的测定使得能够建立高通量检测方法，用于研究不同遗传背景下细胞、组织和器官在营养物质或药物刺激下葡萄糖摄取的动力学。该检测方法对于发现治疗糖尿病、癌症、中枢神经系统退行性疾病、肥胖症以及所有与葡萄糖和代谢相关疾病的药物和营养疗法具有重要价值。该检测需要根据不同的组织和细胞培养物的代谢特性，调整饥饿和刺激的时间。将3T3-L1小鼠成纤维细胞以每20毫升培养基1中稀释至10的6次方个细胞的密度，接种于296孔板中进行培养。每孔接种100微升细胞悬液，接种过程中需混匀以保持细胞悬液的均一性。将细胞在37摄氏度培养箱中培养48小时，期间不更换培养基，直至细胞融合度达到约70%至80%。继续在相同培养基中培养细胞48小时，以维持细胞的融合状态并使其处于饥饿状态。根据所需的禁食分解代谢状态，将孵育时间调整为24至72小时。从96孔板的细胞中倾去培养基，用无菌纸巾吸除残留液体。用每孔 100 微升的 PBS 清洗 96 孔板，并用无菌纸巾吸去残留液体。每孔加入 100 微升无葡萄糖的 DMEM，孵育 40 分钟。根据细胞类型、刺激条件及所需的饥饿程度调整孵育时间。每种模拟条件下使用八个重复样本，因此每种模拟条件需准备一毫升溶液。共设置七种不含胰岛素的模拟条件。在96孔板中加入终浓度分别为2.5微克/毫升、1微克/毫升、0.5微克/毫升、0.2微克/毫升、0.1微克/毫升、0.05微克/毫升和0毫克/毫升的FD葡萄糖。使用七种含胰岛素的刺激条件。在另一块96孔板中加入终浓度分别为2.5微克/毫升、1微克/毫升、0.5微克/毫升、0.2微克/毫升、0.1微克/毫升、0.05微克/毫升和0微克/毫升的FD葡萄糖。为准备刺激条件，取一微升浓度为每毫升五毫克的FD葡萄糖工作液，与999微升无葡萄糖DMEM混合，配制总体积为一毫升的工作储备液。使用该工作储备液，在生物安全柜内避光条件下，实验前立即配制2毫升离心管中的FD葡萄糖稀释系列：1比2000、1比5000、1比10000、1比25000、1比50000和1比100000，使其终浓度分别为每毫升2.5微克、每毫升1微克、每毫升0.5微克、每毫升0.2微克、每毫升0.1微克和每毫升0.05微克。向每种条件中加入一微升胰岛素。孵育40分钟后，从96孔板的每个孔中倾倒出无葡萄糖的DMEM，并用无菌纸巾吸去残留液体。将之前所述不同处理条件的溶液分别取100微升加入到一列各孔中，同时在同一处理条件下，将100微升溶液加入到两块96孔板中同一行的各孔内。标记使用不同条件的培养板，分别设置含胰岛素和不含胰岛素的组别。在对照孔中仅加入无葡萄糖的DMEM培养基。将培养板置于细胞培养箱中，避光孵育40分钟。细胞刺激40分钟后，

extracellular-glucose-depletion-as-an-indirect-measure-glucose-uptake

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科研

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生物化学

细胞外葡萄糖消耗作为细胞和组织离体葡萄糖摄取的间接测量

体外葡萄糖消耗检测：一种基于荧光法通过测定细胞外葡萄糖消耗量来定量细胞葡萄糖摄取的方法

在本视频中，我们演示一种离体（ex...

小鼠器官离体葡萄糖摄取评估的替代测量技术：细胞外荧光葡萄糖类似物消耗量测定

我们在此介绍一种准确、可重复且便捷的生化方法，用于糖原的滴定...

糖原的生化滴定 体外

单核细胞是人类先天免疫系统的重要组成部分，在活化时依赖糖酵解代谢。本文介绍一种流式细胞术方案，用于检测新鲜全血中总单核细胞及单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取能力。...

一种简单的流式细胞术方法用于检测全血中单核细胞亚群的葡萄糖摄取及葡萄糖转运蛋白表达

本研究描述了一种利用 18F-FDG 与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）成像结合动力学建模，用于定量分析 体内实时摄取 18F-FDG...

使用18F-FDG 微型PET/CT测定葡萄糖代谢动力学

在此方法中，培养人原代肌细胞 体外 以获得分化的肌管细胞并测量葡萄糖摄取率。我们提供了一种详细方案，用于在基础状态和胰岛素刺激状态下，利用放射性标记的[3[3H]...

葡萄糖摄取测量及对胰岛素刺激的反应在 体外 培养的人原代肌管细胞

本技术描述了利用细胞外通量分析仪对小鼠离体视网膜组织的耗氧量和细胞外酸化速率进行实时记录的方法。...

利用细胞外通量分析法测量离体视网膜组织中的能量代谢

肌肉葡萄糖摄取的完整调控对维持机体葡萄糖稳态至关重要。本方案介绍了在分离并孵育的成熟骨骼肌中，评估胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取方法，用于阐明各种生理干预对机体葡萄糖代谢的影响。...

小鼠分离并孵育的成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取测定

测量葡萄糖摄取 果蝇 TDP-43蛋白病变模型

脂肪细胞中的甘油三酯脂肪分解是一种重要的代谢过程，可释放出游离脂肪酸和甘油。本文提供了一种详细的实验方案，用于检测脂肪细胞的基础脂肪分解和刺激诱导的脂肪分解。 离体...

测量脂解速率 离体 小鼠脂肪组织及分化后的原代前脂肪细胞 体外

视网膜中的多种细胞类型，包括内皮细胞、神经元和胶质细胞，均表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs），以介导葡萄糖进入细胞。使用 离体...

测量葡萄糖类似物6-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-6-脱氧葡萄糖在完整小鼠神经视网膜中的摄取

关键词：葡萄糖摄取, 6-NBDG, 神经视网膜, 小鼠, 荧光成像, 代谢活性, 视网膜组织, 活体检测

学习细胞外葡萄糖消耗测定法，用于高通量筛选细胞和组织中的葡萄糖摄取动力学。该方法以3T3-L1小鼠成纤维细胞为模型，为糖尿病、癌症等代谢疾病的治疗发现提供重要工具。

细胞和组织离体外环境中葡萄糖摄取的间接检测方法：细胞外葡萄糖耗竭法 Ex Vivo

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