利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

本文所述方案可用于生成随机诱变的全长RNA文库，适用于长度不超过10千碱基的单股正链RNA病毒基因组，并可在特定实验条件下筛选感兴趣的表型。该技术采用无需克隆的方法，短时间内即可构建具有不同遗传多样性的全长病毒RNA文库。该方法利用价格低廉且广泛可得的试剂合成文库。

进行该实验操作的是来自沙夫·纳达尔大学生命科学系病毒学部的博士生 Shaheen Khan。首先，按照文本手稿中的描述，为四组实验配制含有正向和反向引物以及反应组分的主混合液（不包含 pJFH1 模板），进行末端聚合酶链式反应（ep-PCR）。将主混合液分装至四个试管中。

将100纳克、50纳克、25纳克和10纳克的模板分别加入各个试管中，并将反应总体积调整至50微升。采用指定的循环条件扩增一段9736个碱基对的片段。通过上样5微升PCR产物，并与已知量的1千碱基DNA Ladder在0.8% TAE琼脂糖凝胶上进行电泳，以估算ep-PCR产物的扩增情况。

使用柱纯化试剂盒纯化产物。通过测量260纳米处的吸光度来估算纯化产物的浓度。真空浓缩ep-PCR产物，使产物浓度达到或超过100纳克/微升。

建立体外RNA合成反应，并在37摄氏度下孵育。然后使用柱纯化试剂盒纯化合成产物。按照制造商的建议，通过加入约1微克病毒RNA、5微摩尔的反向引物和200单位的逆转录酶，建立20微升的cDNA合成反应。

使用cDNA，按照文稿中所述配制反应体系，并进行扩增循环。将扩增产物在0.8% TAE琼脂糖凝胶上电泳，以确认产物大小为2571个碱基对，然后采用先前展示的柱纯化试剂盒纯化产物。用40微升无菌水洗脱。

为了添加3'端A突出端，加入0.5 µM dATP和1单位的低保真Taq DNA聚合酶，在70 °C下孵育整个PCR产物30分钟，同时加入1× PCR缓冲液和1.5 mM氯化镁。然后使用柱纯化试剂盒纯化该混合物。设置连接反应，并在室温下孵育3小时。

然后向连接的 DNA 中加入 100 微升大肠杆菌 DH5-Alpha，将细胞在 42 摄氏度下热激 35 秒。向细胞悬液中加入 1 毫升 LB 培养基，并在 37 摄氏度下轻轻振荡培养 1 小时。在 13,800 RCF 下离心。

弃去上清液，加入200微升新鲜LB培养基重悬。取100微升转化后的E.coli DH5-Alpha细胞涂布于含有50微克/毫升氨苄青霉素的LB平板上，37摄氏度培养16小时。挑取25至30个菌落进行小量提取，接种于5毫升含50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度过夜培养。

第二天，使用商业试剂盒提取质粒，并对所有菌落的200纳克纯化质粒进行限制性酶切反应，反应体系为10微升，包含2单位EcoR1和1×限制性缓冲液。将酶切反应体系在37摄氏度孵育3小时后，将产物上样至0.8% TAE琼脂糖凝胶，以确认质粒DNA的插入情况。使用推荐的引物对25个阳性克隆的质粒进行Sanger测序。

转染前一天，对细胞进行传代，并使用血细胞计数板计数活细胞数量。随后将人肝癌7.5细胞以2毫升完全DMEM培养基接种于35毫米培养皿中，在含5%二氧化碳的湿润培养箱中37摄氏度孵育16小时。次日，通过将10微升转染试剂稀释于50微升最低必需培养基中制备转录物-脂质复合物，同时将5微克病毒转录物单独稀释于50微升最低必需培养基中。

将两种混合物在室温下孵育10分钟。然后将它们混合至一个无菌的微量离心管中，在室温下孵育30分钟。细胞孵育结束后，移除培养基，用预热的1× PBS洗涤细胞两次，并加入1.5毫升最低必需培养基。

缓慢加入复合物，并轻轻晃动培养皿以确保均匀分布。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10小时，然后移除培养基。

用一毫升预热的1× PBS洗涤转染细胞两次，加入两毫升完全DMEM培养基。使用病毒RNA提取试剂盒从140微升培养上清中提取病毒RNA。使用商业化的qRT-PCR试剂盒配制10微升的qRT-PCR反应体系。

使用HCV RNA定量的正向引物、反向引物和探针。设定反应循环条件为：48摄氏度20分钟，95摄氏度10分钟，随后进行45个循环，每个循环包括95摄氏度15秒和60摄氏度1分钟。运行反应，并设置阴性对照。

同时，使用已知拷贝数的HCV转录本进行10倍系列稀释，制作标准曲线，以定量病毒RNA。每个样本设三个重复。将人肝癌7.5细胞接种于96孔板中，在添加病毒前，于37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育约16小时。

在生物安全二级柜中，对病毒进行10倍系列稀释。每孔加入100 µL稀释后的病毒以感染细胞，并在37°C、5% CO₂条件下孵育。三天后，用0.1 mL PBS洗涤感染细胞三次，并加入0.1 mL冰甲醇在-20°C下固定和通透细胞20分钟。

用1×PBS洗涤各孔三次，再用PBST洗涤一次。移除PBST后，加入0.1毫升含0.2%脱脂奶粉的1% BSA PBST溶液，在室温下封闭细胞30分钟。移除封闭液后，加入0.1毫升用1×PBS配制的3%过氧化氢溶液，处理细胞5分钟。

再次用 1X PBS 洗涤细胞两次，再用 1X PBST 洗涤一次。每孔加入 50 微升抗 NS5A 9E10 单克隆抗体，在室温下孵育一小时。用 1X PBS 将各孔洗涤三次，再用 PBST 洗涤一次。

每孔加入 50 微升 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗，室温孵育 30 分钟，然后用 0.1 毫升 1× PBS 洗涤各孔以去除未结合的抗体。每孔加入 30 微升 DAB 溶液，室温下轻轻振荡孵育 10 分钟。移除 DAB 溶液，用 1× PBS 洗涤两次，再用蒸馏水洗涤一次。

加入含有 0.03% 叠氮化钠的 100 微升 PBS。使用倒置光学显微镜和 10 倍物镜检查每个孔。计数阳性孔的数量。

使用 Reed 和 Muench 计算器估算可感染 50% 孔的终点稀释度。将 NS5A 抑制剂 pibrentasvir 溶于 100% DMSO 中，配制成 1 毫摩尔浓度，再用完全 DMEM 稀释至 10 纳摩尔浓度。随后，用 ML50 病毒剂量感染 70% 汇合度的 naive Huh-7.5 细胞，持续 12 小时，感染后 24 小时将感染的细胞转移至 6 孔板中。

细胞传代16小时后，向感染细胞中加入1X EC50的PIB。连续六次传代每次均进行此操作，随后进行三次无药传代周期，并使用焦点形成实验监测病毒扩散情况。每次传代时收集病毒上清液，并于-80摄氏度保存。

在第18天从上清液和合成的cDNA中提取病毒RNA。使用五微升稀释后的cDNA扩增NS5A基因。然后利用NS5A测序引物对6至8个阳性细菌质粒进行测序，以确定NS5A的药物抗性突变。

使用克隆质粒pJFH1以递减的量（从100至10纳克）合成了全基因组突变文库。ep-PCR产物的平均得率范围为每微升3.8至12.5纳克。突变文库中的突变比例随着ep-PCR反应中pJFH1投入量的减少而增加。

使用50纳克模板合成的ML50每复制10,000个碱基对出现四个替换，而使用25纳克模板合成的ML25则含有九个替换。在克隆的pJFH1中，测序的核苷酸数量范围内未发现任何替换。与克隆的JFH1病毒相比，ML50病毒变异体对匹布伦赛韦的敏感性较低。

在8个NS5A克隆中，4个具有D7V+F28C的组合，而V8A+F28C和F36L各出现在一个克隆中。这些突变位于NS5A的N端区域，该区域已知含有临床相关的NS5A耐药突变。ep-PCR中各组分的终浓度至关重要，尤其是模板量。

缺少KB扩增子将显著降低ep-PCR产物的得率。