Name: 反向遗传学设计正义RNA病毒变异株 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 49 s
Description: 学习利用易错PCR技术构建丙型肝炎病毒全长突变RNA文库的无克隆方法。该方法可快速产生遗传多样性并在受控实验条件下筛选目标表型，为疫苗研发提供简便工具。

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本研究获得了印度政府生物技术部的资金支持（资助编号 BT/PR10906/MED/29/860/2014）。

注意：本实验所用的 JFH1 野生型（WT）毒株由日本国立感染症研究所的 Takaji Wakita 惠赠。人肝癌细胞系 Huh7.5 由洛克菲勒大学的 Charles Rice 惠赠。图 1 展示了本方法的示意图。
1. 利用易错PCR对JFH1进行全基因组替代突变
<ol>
	<li>为了进行表观突变PCR（ep-PCR），请准备四组实验的预混液，所用引物为J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' 和 J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC-3'（图1A），以及文中所述的反应组分 表1 不含pJFH1质粒模板（从JFH1株分离的质粒）。</li>
	<li>将主混合液分装至四个试管中，分别向各管加入100 ng、50 ng、25 ng和10 ng的模板，并将反应总体积调整至50 µL。采用如下循环条件： 表 2 扩增一个包含T7启动子和全长HCV基因组的9736碱基对（bp）片段（图2). 
	注意：ep-PCR 产物必须包含 T7 启动子序列，以促进后续操作 体外 病毒基因组的转录。因此，上游引物必须位于病毒cDNA克隆T7启动子的上游，下游引物序列应终止于病毒基因组3'端，以促进转录终止。在Taq DNA聚合酶生产商推荐的范围内优化ep-PCR反应的各个组分，以实现高产量扩增。除了调整模板用量外，使用不平衡的dNTP（特别是低浓度的dATP和/或dGTP）也可增加长度为6-8 kb病毒基因组的多样性3.</li>
	<li>通过加载等体积的PCR产物（5 µL）并使用0.8%基于Tris-乙酸-EDTA（TAE）的琼脂糖凝胶电泳，与已知量的1千碱基（kb）DNA ladders进行比较，估算ep-PCR产物的扩增情况11使用柱纯化试剂盒，按照制造商说明纯化产物。</li>
	<li>使用微量分光光度计在260 nm处测定吸光度，以估算纯化产物的浓度12如有需要，可真空浓缩ep-PCR产物，以获得浓度≥100 ng/µL的产物。 
	&#8203;注意：通过加载ep-PCR产物的两倍系列稀释液，并将其条带强度与已知量的1 kb DNA Ladder进行比较，可获得更准确的估算结果。</li>
</ol>
2. 病毒RNA合成
<ol>
	<li>设置一个40 µL反应体系，用4 U限制性内切酶消化5 µg克隆质粒pJFH1 XbaI 37 °C 下酶促反应 2 小时，随后进行柱层析纯化，并使用微量分光光度计在 260 nm 处测定吸光度12. 设置一个20 µL的反应体系 体外 使用市售的大规模RNA生产系统，按照制造商说明书对柱纯化的ep-PCR产物或克隆型pJFH1（WT）进行转录反应。</li>
	<li>在200 µL的微量离心管中，加入约1 µg纯化的ep-PCR产物（突变文库）或 XbaI 消化后的克隆质粒pJFH1、10 µL含核糖核苷酸的2x缓冲液以及2 µL T7酶混合物。混合所有组分后短暂离心。将反应体系在37 °C孵育45分钟，随后加入1 U无RNase的DNase酶，并在37 °C继续孵育30分钟（图1C).</li>
	<li>纯化 体外 使用RNA纯化试剂盒按照制造商说明书纯化合成的RNA，用40 µL无RNase和DNase的水洗脱，并利用微量分光光度计在260 nm处测定吸光度以估算纯化后RNA的浓度12根据需要分装（5 µg 或 2 µg），以避免反复冻融，并于 −80 °C 保存。取 2 µg RNA 进行 MOPS 变性 0.8% 琼脂糖凝胶电泳，以检测病毒转录本的完整性和大小。13 (图3).</li>
</ol>
3. 估计错误引发PCR产物（突变文库）中突变的比例
注意：在此步骤中，通过亚克隆第2步获得的产物，估算核苷酸发生突变的比例，以证明采用错误倾向PCR（ep-PCR）构建遗传异质性的优势，所用材料包括两个全基因组突变文库（ML50和ML25）以及克隆来源的pJFH1病毒RNA。本研究中突变比例的估算针对HCV NS5A基因进行，该基因同时也是本研究的表型读出基因（药物抗性）。
<ol>
	<li>按照制造商的建议，通过添加约 1 µg 第 2 步中合成的病毒 RNA、5 µM 反向引物 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' 以及 200 U 逆转录酶，配制 20 µL 的 cDNA 合成反应体系。</li>
	<li>以 cDNA 为模板，扩增包含完整 NS5A 基因的 2571 bp 片段。为此，配制一个总反应体积为 50 µL 的反应混合液，其中包含 0.5 µM 的 5272F 和 7848R 引物（终浓度；表 3）、1.5 mM MgCl2、&#160;1x PCR 缓冲液和 1 U 高保真 Taq 聚合酶，并按照 表 4 所述条件进行扩增循环。</li>
	<li>将扩增产物在 0.8% TAE 琼脂糖凝胶上电泳，以确认产物大小为 2571 bp，然后按照制造商说明使用柱纯化试剂盒纯化产物，用 40 µL 无菌水洗脱柱纯化产物。</li>
	<li>为在产物末端添加 3' A 突出端，向反应体系中加入 0.5 µM dATP 和 1 U 低保真 Taq DNA 聚合酶，并在含有 1x PCR 缓冲液和 1.5 mM MgCl2 （终浓度）的条件下，将全部 PCR 产物于 70 °C 孵育 30 分钟。随后按照制造商说明使用柱纯化试剂盒纯化该混合物。 
	注意：也可从第 1.4 步的凝胶中切下约 9.7 kb 的长片段产物，根据制造商说明使用市售的长片段 PCR 产物克隆试剂盒进行克隆，或使用 Illumina 平台对 ep-PCR 产物进行高通量测序2。</li>
	<li>配制连接反应体系：加入 5 µL 2x 连接缓冲液、50 ng T 载体 DNA、约 3 倍摩尔过量的第 3.4 步合成的插入 DNA、3 Weiss 单位 T4 DNA 连接酶以及无核酸酶水，总体积为 10 µL。室温孵育 3 小时后，加入 100 µL Escherichia coli DH5α 感受态细胞，并在 42 °C 热激 35 秒（图 1B）。</li>
	<li>加入 1 mL 无抗生素的 Luria-Bertani (LB) 培养基，37 °C 轻柔振荡培养 1 小时以恢复细胞生长。将菌液在 13,800 x g 条件下离心，弃去上清液，用 200 µL 新鲜 LB 培养基重悬菌体。</li>
	<li>取 100 µL 转化后的 E. coli DH5α 菌液涂布于含 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板，37 °C 培养 16 小时。挑选 25–30 个单菌落，分别接种于 5 mL 含 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中，37 °C 过夜培养以进行质粒小提。</li>
	<li>次日，按照制造商说明使用质粒纯化试剂盒提取质粒 DNA，并对所有菌落的 200 ng 提取质粒进行限制性内切酶消化反应，反应体系为 10 µL，包含 2 U EcoR1 和 1x 限制性缓冲液。</li>
	<li>将酶切反应体系于 37 °C 孵育 3 小时后，在 0.8% TAE 琼脂糖凝胶上电泳分离产物，以确认质粒 DNA 中的插入片段。</li>
	<li>使用 M13 正向引物、M13 反向引物、6208-SPF 和 6748-SPF 引物（表 3）对 25 个阳性克隆的质粒进行 Sanger 测序，以确定来源于文库及克隆质粒 pJFH1 的病毒 RNA 中突变的比例（以发生突变的核苷酸比例表示）（图 1B 和 图 4）。</li>
</ol>
4. Huh7.5 细胞系的病毒RNA转染
注意：使用无 RNase/DNase 的组织培养材料，并在 II 级生物安全柜中进行无菌操作。根据机构的生物安全指南，在推荐的生物安全防护设施中进行操作。
<ol>
	<li>在含有15 mL完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的T75 cm2组织培养瓶中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养Huh7.5细胞，培养基中添加10%（体积比）胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL；图1D）。</li>
	<li>当细胞融合度达到90%时，按1:3比例传代。用1×预热的磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）洗涤细胞。加入5 mL 1×胰蛋白酶-EDTA溶液，完全覆盖细胞层，轻轻摇动培养瓶，然后在37 °C下孵育5分钟。 
	注意：孵育时间可能有所不同；孵育至细胞层完全从培养瓶表面脱落为止。</li>
	<li>加入10 mL 1×预热的完全DMEM，通过反复吹打使细胞分散，将细胞悬液收集至15 mL或50 mL无菌离心管中。在室温下以252 × g&#160;离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于6 mL完全DMEM中，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育细胞。</li>
	<li>为持续维持未处理、转染或病毒感染的Huh7.5细胞，重复步骤4.2和步骤4.3。</li>
	<li>转染前一天，按照步骤4.1–4.3所述方法传代细胞，使用血细胞计数板计数活细胞数量，以每35 mm培养皿0.6 × 106的密度接种Huh7.5细胞于2 mL完全DMEM中，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育细胞。</li>
	<li>次日，制备转录本-脂质复合物。将10 µL转染试剂用50 µL最低必需培养基稀释，另取5 µg病毒转录本用50 µL最低必需培养基单独稀释。</li>
	<li>将两种混合物在室温下孵育10分钟，然后将其混合于一个无菌微量离心管中，继续在室温下孵育30分钟，以形成转录本-脂质复合物。</li>
	<li>细胞孵育16小时后，从培养皿中移除培养基，用预热的1× PBS洗涤细胞两次，加入1.5 mL最低必需培养基。缓慢将转录本-脂质复合物加入培养皿中，并用手轻轻摇动以确保复合物均匀分布。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2培养箱中孵育10小时。然后移除培养基，用1 mL预热的1× PBS洗涤转染后的细胞两次，再加入2 mL完全DMEM。</li>
</ol>
5. 病毒制备
<ol>
	<li>当转染的 Huh7.5 细胞达到 90% 汇合度时，每 2 天或 3 天传代一次。每次传代时收集病毒上清液，并于 −80 °C 保存以备后续分析。</li>
	<li>每次传代时，按照步骤 6.2 所述方法，使用焦点形成实验（FFA）监测病毒的扩散情况。持续收获病毒，直至病毒扩散范围达到转染细胞的 &#62;80%（图 1D）。 
	注意：在前几次传代中，以 1:1 的比例传代转染细胞，以拯救最大数量的病毒变异体。随着全基因组 MLs 中突变比例的增加，病毒扩散速度减慢，细胞活力下降2。</li>
</ol>
6. 病毒滴度的定量
<ol>
	<li>病毒RNA的定量
	<ol>
		<li>根据试剂盒制造商的说明，使用病毒RNA提取试剂盒从140 µL培养上清液中提取病毒RNA。</li>
		<li>根据商业qRT-PCR试剂盒的说明书，配制10 µL的qRT-PCR反应体系。使用正向引物R6-130-S17、反向引物R6-290-R19（终浓度均为0.2 µM）以及探针R9-148-S21FT（终浓度0.3 µM）对HCV RNA进行定量（表3）。设定反应程序为：48 °C孵育20分钟，95 °C预变性10分钟，随后进行45个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟）。 
		注意：探针5'端应标记荧光报告基团6-羧基荧光素（FAM），3'端应标记淬灭基团6-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）。</li>
		<li>在实时荧光定量PCR仪中运行反应。同时设置阴性对照，即使用模拟感染细胞的上清液提取的RNA以及无核酸酶水作为对照，以确保无交叉污染。</li>
		<li>平行建立标准曲线，使用已知拷贝数的HCV转录本进行10倍系列稀释（1 × 108 至 0拷贝），用于病毒RNA的定量。每个样本设三个重复（图1D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用50%组织培养感染剂量（TCID50）测定感染性病毒滴度
	<ol>
		<li>在接种病毒前约16小时，将6.5 × 103个Huh7.5细胞/孔接种于96孔板中，并在37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
		<li>在生物安全二级柜中，对收获的病毒液（在病毒扩散达到&#62;80%细胞时收集，如步骤5所述）进行10倍系列稀释（每步1 mL），稀释范围为1 × 10−1 至 1 × 10−6（共八个稀释度）。将稀释后的病毒液各取100 µL/孔（每稀释度设八个重复孔）加入Huh7.5细胞中，在37 °C、5% CO2&#160;条件下孵育3天。</li>
		<li>孵育3天后，每次用0.1 mL PBS洗涤感染细胞3次，随后用0.1 mL预冷甲醇在−20 °C固定并通透细胞20分钟。用1× PBS洗涤3次，再用PBS-T（1× PBS/0.1% [v/v] Tween-20）洗涤1次。</li>
		<li>去除PBS-T后，加入含0.2%脱脂奶粉的1%牛血清白蛋白（BSA）PBST溶液0.1 mL/孔，在室温封闭30分钟。吸去封闭液后，加入0.1 mL用1× PBS配制的3% H2O2处理细胞5分钟。</li>
		<li>再次用1× PBS洗涤2次，PBS-T洗涤1次，然后每孔加入50 µL抗NS5A单克隆抗体9E10 mAb（1:10000稀释，原液浓度1 mg/mL；由洛克菲勒大学Charles Rice惠赠），室温孵育1小时。孵育后用1× PBS洗涤3次，PBS-T洗涤1次。</li>
		<li>每孔加入50 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1:4000稀释），室温孵育30分钟，随后用0.1 mL 1× PBS洗涤去除未结合抗体。</li>
		<li>每孔加入30 µL DAB（3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐）显色底物，室温轻摇孵育10分钟。底物在孔底形成棕褐色沉淀，表明存在HCV NS5A抗原。吸去DAB溶液，用1× PBS洗涤2次，蒸馏水洗涤1次，最后每孔加入含0.03%叠氮化钠的PBS 100 µL。</li>
		<li>在倒置光学显微镜下使用10倍物镜观察各孔。统计阳性孔数量：若孔内存在一个或多个NS5A阳性细胞，则判为阳性；若无NS5A阳性细胞，则判为阴性。使用Reed和Muench法计算能使50%孔感染的终点稀释度（TCID50）14,15。TCID50对应稀释度的倒数即为单位体积内的病毒感染性滴度（空斑形成单位）。 
		&#8203;注意：不同突变文库的病毒感染性滴度可能存在差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 耐药性病毒变异株的筛选
<ol>
	<li>将NS5A抑制剂pibrentasvir（PIB）溶于100% DMSO中，配制成1 mM的储存液，再用完全DMEM稀释至10 nM的工作浓度。</li>
	<li>为测定PIB的50%有效浓度，以0.6 × 106/孔的密度将Huh7.5细胞接种于6孔板中，并在37 °C、5% CO2培养箱中孵育。细胞孵育16小时后，加入ML50或克隆型JFH1病毒感染剂量，使50%的细胞被感染；感染后12小时（h p.i.），用浓度范围为0.5–100 pM的PIB进行两倍系列稀释处理。孵育3天后，按步骤6.2的方法进行荧光灶检测（FFA），并定量荧光灶形成单位（FFU）。</li>
	<li>使用统计分析软件，根据FFU减少实验的数据绘制剂量-反应曲线。从S型曲线中获得50%有效浓度（EC50；图5）。 
	注意：有效浓度范围可能因药物类别、同类HCV抗病毒药物之间以及突变文库的不同而有所差异。</li>
	<li>实验中，将处于70%汇合度的 naïve Huh7.5细胞用ML50病毒（源自ML50 RNA的变异株）感染剂量感染12小时，使50%细胞被感染，然后在感染后24小时将感染的细胞转移至6孔板。</li>
	<li>细胞传代后16小时，向感染细胞中加入1× EC50浓度的PIB（47.3 pM）。此后每次传代均重复此操作，连续进行六次传代（共18天），随后进行三次无药传代周期，并按照步骤6.2所述方法通过FFA监测病毒扩散情况。根据培养面积按比例放大FFA试剂用量。每次传代时收集病毒上清液，并于−80 °C保存备用。 
	注意：在药物处理期间，若病毒扩散至超过50%的细胞，可定义为突破性感染（breakthrough）；在停药期间出现的病毒扩散可定义为病毒复发（viral relapse）16。</li>
	<li>在第18天时，按照步骤6.1.1所述方法从上清液中提取病毒RNA，然后按步骤3.1进行cDNA合成。使用5 µL经1:5稀释的cDNA及步骤3.2所述PCR组分扩增NS5A基因。随后按照步骤3.3–3.5，利用NS5A测序引物6186F、6862F和6460R（表3和表4）对6–8个阳性细菌质粒进行测序，以鉴定NS5A区的耐药突变。 
	注意：本研究中报告了在1× EC50 PIB处理过程中筛选出的病毒变异株中NS5A区域的氨基酸替换。该设计可排除NS5A以外的其他位点替换对PIB敏感性降低的影响。</li>
</ol>

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<li>Cadwell, R. C., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+genes+by+PCR+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Randomization of genes by PCR mutagenesis.</a> PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们详细介绍了一种简单且快速的荧光微卫星重复序列分析（FL-MRS）流程，该流程整合了错误倾向性PCR（ep-PCR）18 以及用于合成HCV全基因组文库的反向遗传学方法，这些文库可在细胞培养系统中用于产生具有复制能力的变异体，以筛选耐药表型。使用低保真度的Taq DNA聚合酶是ep-PCR的前提条件，可在全长病毒基因组的PCR扩增过程中引入碱基替换。我们测试了多种低保真度Taq&#160;DNA聚合酶，并发现Platinum Taq DNA聚合酶可产生约10 kb大小的ep-PCR产物，且产量较高（数据未显示）。我们建议使用固定的热循环次数，并通过调整模板输入量来控制全基因组文库中的突变比例。由于FL-MRS以错误的全基因组作为全长病毒RNA的模板，因此引物组的精心设计至关重要，以确保RNA合成反应生成特定长度的病毒转录本：（i）正向引物必须位于cDNA克隆T7启动子上游约50个核苷酸处，以促进T7聚合酶与ep-PCR产物的结合；（ii）反向引物序列必须终止于病毒基因组3'端，以利于转录过程中的终止脱离 体外 RNA合成
<p class="jove...

正向遗传筛选从感兴趣的病毒表型开始，随后通过测序其基因组并与原始毒株进行比较，尝试鉴定导致该表型的突变位点。相比之下，反向遗传筛选则是先在目标基因中引入随机突变，再观察所产生的表型1。在反向遗传学方法中，体外诱变（in vitro mutagenesis）是最常用的技术，用于构建变异体文库，进而筛选感兴趣的表型。目前已报道多种可用于RNA病毒全基因组随机诱变的遗传工具，包括易错PCR（ep-PCR）2,3、环状聚合酶延伸4以及Mu转座子插入诱变5,6,7。后两种方法产生的文库序列多样性有限，且容易引入较大的插入或缺失，这对病毒而言具有高度致死性，严重限制了感染性病毒变异体的获得。
易错PCR（ep-PCR）是一种广为人知且功能强大的诱变技术，广泛应用于蛋白质工程中，用于产生突变酶，以筛选具有理想特性的表型，例如增强的热稳定性、底物特异性和催化活性8,9,10。该技术操作简便，仅需常规设备，无需繁琐的操作步骤，使用市售试剂，且耗时短；此外，还能生成高质量的突变文库。
本文中，我们开发了一种全长突变RNA合成（FL-MRS）的新方法，通过整合表型错误倾向PCR（ep-PCR）与反向遗传学技术，实现丙型肝炎病毒（HCV）完整基因组的构建。ep-PCR可诱导全基因组范围的随机碱基替换突变。对于正义单链RNA病毒（[+]ssRNA），单个核苷酸的插入或缺失通常具有高度致死性；因此，基于PCR的碱基替换突变技术是构建具有较高存活率的大容量、多样性全长（+）ssRNA病毒基因组文库的首选方法。
全长突变逆转录病毒筛选（FL-MRS）是一种简单直接的方法，可通过精心设计的一组引物应用于任何基因组长度约为10 kb的正义链RNA病毒，该引物可结合病毒cDNA克隆。pJFH1是一种具有感染性的cDNA克隆，编码丙型肝炎病毒（HCV）2a基因型，能够重现病毒生命周期的全部步骤。通过采用FL-MRS方法，我们展示了可合成随机诱变的全长基因组文库（突变文库[MLs]），从而获得具有复制能力的JFH1变异体，且无需预先了解与这些突变相关的特性。在抗病毒药物作用下，部分病毒变异体迅速克服了药物压力，并表现出预期的表型改变。利用本文所述的实验方案，可生成大量病毒变异体，为研究（+）ssRNA病毒的进化提供了新的机会。

<table><tbody><tr><td>1 kb plus DNA 标准品&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Tarsons</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Tarsons</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿&amp;nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Tarsons</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Merck</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>MB080</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳装置</td><td>BioRad</td><td>1704406</td><td></td></tr><tr><td>II 级生物安全柜</td><td>ESCO</td><td>AC2 4S</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>HiMedia</td><td>MB083</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>BioRad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 克隆平板&amp;nbsp;</td><td>Tarson</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱&amp;nbsp;</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170R</td><td></td></tr><tr><td>Colibri 微体积分光光度计</td><td>Titertek-Berthold</td><td>11050140</td><td></td></tr><tr><td>DAB&amp;nbsp;底物&amp;nbsp;试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab94665</td><td></td></tr><tr><td>dATP 溶液</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液套装</td><td>NEB</td><td>N0446</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）&amp;nbsp;</td><td>SRL chemical</td><td>46791</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>HiMedia</td><td>MB058</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 四钠盐二水合物</td><td>HiMedia</td><td>GRM4918</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>甲醛&amp;nbsp;</td><td>Fishser Scientific</td><td>12755</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>ALPHA IMAGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，HRP 标记</td><td>Thermo Fisher</td><td>A16066</td><td></td></tr><tr><td>30% 过氧化氢</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nickon</td><td>&amp;nbsp;ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤&amp;nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>116680270</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>机械移液器套装</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>0.2–10 &amp;micro;l 微量吸头&amp;nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>521000</td><td></td></tr><tr><td>10–100 &amp;micro;l 微量吸头&amp;nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>200–1000 &amp;micro;l 微量吸头&amp;nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>521020</td><td></td></tr><tr><td>MOPS 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>GeNei</td><td>3601805001730</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 化学感受态&amp;nbsp;E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>E.coli DH5&amp;alpha;</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>1105-021</td><td>最低必需培养基</td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 管</td><td>Tarsons</td><td>510051</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy 载体系统</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>T 载体 DNA</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>HiMedia</td><td>TI1099</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&amp;nbsp;高保真 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Pibrentasvir</td><td>Cayman Chemical</td><td>27546</td><td></td></tr><tr><td>移液器控制器&amp;nbsp;</td><td>Gilson&amp;nbsp;</td><td>F110120</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>10966034</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>QIAamp 病毒 RNA 小量提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>病毒提取试剂盒</td></tr><tr><td>QIAprep Spin 小量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td>cokum 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>RNeasy 小量提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>RNA 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>25 ml 血清移液管</td><td>Thermo Fisher</td><td>170357N</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td>Thermo Fisher</td><td>170355N</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Thermo Fisher</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>单链 RNA 标准品 0.2–10 kb</td><td>Merck</td><td>R7020</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉&amp;nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M530</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 叠氮化钠溶液</td><td>Merck</td><td>8591</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td>逆转录酶</td></tr><tr><td>T100 梯度 PCR 仪</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T175 细胞培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>T25 细胞培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>950040</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMax Express 大规模 RNA 生产系统&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>&amp;nbsp;大规模 RNA 生产系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 细胞培养瓶&amp;nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>950050</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Genetix Biotech (Puregene)</td><td>PGM040</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT 一步法试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4392653</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT&amp;nbsp;一步法&amp;nbsp;试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>4392653</td><td>商用 qRT-PCR 试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TOPO-XL--2 完整 PCR 克隆试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>K8050-10</td><td>长片段 PCR 产物克隆试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>HiMedia</td><td>TC072</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>HiMedia</td><td>TCL007</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf, Concentrator Plus</td><td>100248</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td>GRANT</td><td>JBN-18</td><td></td></tr><tr><td>Xba1</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr></tbody></table>

利用反向遗传学构建正链rna病毒变异体

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

缺乏一种便捷的方法来迭代生成多样化的全长病毒变异体，阻碍了RNA病毒定向进化研究的进展。通过整合全长RNA基因组的易错PCR与反向遗传学技术，可诱导全基因组范围的随机替换突变。我们已开发出一种利用该技术合成多样化文库的方法，以鉴定具有特定表型的病毒突变体。该方法称为全长突变RNA合成法（FL-MRS），具有以下优势：（i）可通过高效的一次性易错PCR构建大规模文库；（ii）通过调节DNA聚合酶的保真度，可构建具有不同遗传多样性水平的文库组；（iii）生成的全长PCR产物可直接作为突变RNA合成的模板；（iv）可生成RNA，将其作为未筛选的输入池递送至宿主细胞，用于筛选具有目标表型的病毒突变体。我们通过反向遗传学方法发现，FL-MRS是一种可靠工具，可用于研究丙型肝炎病毒JFH1分离株生命周期各阶段的病毒定向进化。该技术似乎是一种不可替代的工具，可用于实施定向进化，以深入理解正链RNA病毒的适应性、复制机制、病毒基因在致病性及抗病毒耐药性中的作用。

可依据所述方案生成并筛选大量全长HCV变异体，以获得特定的耐药表型 图1全基因组突变文库使用克隆型pJFH1以递减的量（100–10 ng）合成，如图所示 图2. ep-PCR 产物（突变文库）的平均得率范围为 3.8–12.5 ng/µL. 图3 显示从克隆型 pJFH1 和代表性突变文库（ML50，使用 50 ng 克隆型 pJFH1 制备）合成的病毒转录本。克隆型 pJFH1 通过线性化处理 XbaI 消化，而ML50则直接用于 体外 转录反应。如图所示，在ep-PCR反应中，随着输入的pJFH1减少，突变文库（突变病毒RNA）中的突变比例增加。 图 4使用50 ng模板（克隆型pJFH1）合成的ML50每复制10,000个碱基对含有4个突变，而使用25 ng模板合成的ML25则含有9个突变。在克隆型pJFH1测序的核苷酸范围内未发现突变。与克隆型JFH1病毒...

本方案描述了一种通过结合使用易错PCR合成全长突变RNA和反向遗传学技术，在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法提供了一个表型筛选模型，可用于长达10 kb的正义链RNA病毒基因组研究。

利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

缺乏一种便捷的方法来迭代生成多种全长病毒变体，阻碍了RNA病毒定向进化的研究……

本文所述方案可用于生成随机诱变的全长RNA文库，适用于长度不超过10千碱基的单股正链RNA病毒基因组，并可在特定实验条件下筛选感兴趣的表型。该技术采用无需克隆的方法，短时间内即可构建具有不同遗传多样性的全长病毒RNA文库。该方法利用价格低廉且广泛可得的试剂合成文库。进行该实验操作的是来自沙夫·纳达尔大学生命科学系病毒学部的博士生 Shaheen Khan。首先，按照文本手稿中的描述，为四组实验配制含有正向和反向引物以及反应组分的主混合液（不包含 pJFH1 模板），进行末端聚合酶链式反应（ep-PCR）。将主混合液分装至四个试管中。将100纳克、50纳克、25纳克和10纳克的模板分别加入各个试管中，并将反应总体积调整至50微升。采用指定的循环条件扩增一段9736个碱基对的片段。通过上样5微升PCR产物，并与已知量的1千碱基DNA Ladder在0.8% TAE琼脂糖凝胶上进行电泳，以估算ep-PCR产物的扩增情况。使用柱纯化试剂盒纯化产物。通过测量260纳米处的吸光度来估算纯化产物的浓度。真空浓缩ep-PCR产物，使产物浓度达到或超过100纳克/微升。建立体外RNA合成反应，并在37摄氏度下孵育。然后使用柱纯化试剂盒纯化合成产物。按照制造商的建议，通过加入约1微克病毒RNA、5微摩尔的反向引物和200单位的逆转录酶，建立20微升的cDNA合成反应。使用cDNA，按照文稿中所述配制反应体系，并进行扩增循环。将扩增产物在0.8% TAE琼脂糖凝胶上电泳，以确认产物大小为2571个碱基对，然后采用先前展示的柱纯化试剂盒纯化产物。用40微升无菌水洗脱。为了添加3'端A突出端，加入0.5 µM dATP和1单位的低保真Taq DNA聚合酶，在70 °C下孵育整个PCR产物30分钟，同时加入1× PCR缓冲液和1.5 mM氯化镁。然后使用柱纯化试剂盒纯化该混合物。设置连接反应，并在室温下孵育3小时。然后向连接的 DNA 中加入 100 微升大肠杆菌 DH5-Alpha，将细胞在 42 摄氏度下热激 35 秒。向细胞悬液中加入 1 毫升 LB 培养基，并在 37 摄氏度下轻轻振荡培养 1 小时。在 13,800 RCF 下离心。弃去上清液，加入200微升新鲜LB培养基重悬。取100微升转化后的E.coli DH5-Alpha细胞涂布于含有50微克/毫升氨苄青霉素的LB平板上，37摄氏度培养16小时。挑取25至30个菌落进行小量提取，接种于5毫升含50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度过夜培养。第二天，使用商业试剂盒提取质粒，并对所有菌落的200纳克纯化质粒进行限制性酶切反应，反应体系为10微升，包含2单位EcoR1和1×限制性缓冲液。将酶切反应体系在37摄氏度孵育3小时后，将产物上样至0.8% TAE琼脂糖凝胶，以确认质粒DNA的插入情况。使用推荐的引物对25个阳性克隆的质粒进行Sanger测序。转染前一天，对细胞进行传代，并使用血细胞计数板计数活细胞数量。随后将人肝癌7.5细胞以2毫升完全DMEM培养基接种于35毫米培养皿中，在含5%二氧化碳的湿润培养箱中37摄氏度孵育16小时。次日，通过将10微升转染试剂稀释于50微升最低必需培养基中制备转录物-脂质复合物，同时将5微克病毒转录物单独稀释于50微升最低必需培养基中。将两种混合物在室温下孵育10分钟。然后将它们混合至一个无菌的微量离心管中，在室温下孵育30分钟。细胞孵育结束后，移除培养基，用预热的1× PBS洗涤细胞两次，并加入1.5毫升最低必需培养基。缓慢加入复合物，并轻轻晃动培养皿以确保均匀分布。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10小时，然后移除培养基。用一毫升预热的1× PBS洗涤转染细胞两次，加入两毫升完全DMEM培养基。使用病毒RNA提取试剂盒从140微升培养上清中提取病毒RNA。使用商业化的qRT-PCR试剂盒配制10微升的qRT-PCR反应体系。使用HCV RNA定量的正向引物、反向引物和探针。设定反应循环条件为：48摄氏度20分钟，95摄氏度10分钟，随后进行45个循环，每个循环包括95摄氏度15秒和60摄氏度1分钟。运行反应，并设置阴性对照。同时，使用已知拷贝数的HCV转录本进行10倍系列稀释，制作标准曲线，以定量病毒RNA。每个样本设三个重复。将人肝癌7.5细胞接种于96孔板中，在添加病毒前，于37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育约16小时。在生物安全二级柜中，对病毒进行10倍系列稀释。每孔加入100 µL稀释后的病毒以感染细胞，并在37°C、5% CO₂条件下孵育。三天后，用0.1 mL PBS洗涤感染细胞三次，并加入0.1 mL冰甲醇在-20°C下固定和通透细胞20分钟。用1×PBS洗涤各孔三次，再用PBST洗涤一次。移除PBST后，加入0.1毫升含0.2%脱脂奶粉的1% BSA PBST溶液，在室温下封闭细胞30分钟。移除封闭液后，加入0.1毫升用1×PBS配制的3%过氧化氢溶液，处理细胞5分钟。再次用 1X PBS 洗涤细胞两次，再用 1X PBST 洗涤一次。每孔加入 50 微升抗 NS5A 9E10 单克隆抗体，在室温下孵育一小时。用 1X PBS 将各孔洗涤三次，再用 PBST 洗涤一次。每孔加入 50 微升 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗，室温孵育 30 分钟，然后用 0.1 毫升 1× PBS 洗涤各孔以去除未结合的抗体。每孔加入 30 微升 DAB 溶液，室温下轻轻振荡孵育 10 分钟。移除 DAB 溶液，用 1× PBS 洗涤两次，再用蒸馏水洗涤一次。加入含有 0.03% 叠氮化钠的 100 微升 PBS。使用倒置光学显微镜和 10 倍物镜检查每个孔。计数阳性孔的数量。使用 Reed 和 Muench 计算器估算可感染 50% 孔的终点稀释度。将 NS5A 抑制剂 pibrentasvir 溶于 100% DMSO 中，配制成 1 毫摩尔浓度，再用完全 DMEM 稀释至 10 纳摩尔浓度。随后，用 ML50 病毒剂量感染 70% 汇合度的 naive Huh-7.5 细胞，持续 12 小时，感染后 24 小时将感染的细胞转移至 6 孔板中。细胞传代16小时后，向感染细胞中加入1X EC50的PIB。连续六次传代每次均进行此操作，随后进行三次无药传代周期，并使用焦点形成实验监测病毒扩散情况。每次传代时收集病毒上清液，并于-80摄氏度保存。在第18天从上清液和合成的cDNA中提取病毒RNA。使用五微升稀释后的cDNA扩增NS5A基因。然后利用NS5A测序引物对6至8个阳性细菌质粒进行测序，以确定NS5A的药物抗性突变。使用克隆质粒pJFH1以递减的量（从100至10纳克）合成了全基因组突变文库。ep-PCR产物的平均得率范围为每微升3.8至12.5纳克。突变文库中的突变比例随着ep-PCR反应中pJFH1投入量的减少而增加。使用50纳克模板合成的ML50每复制10,000个碱基对出现四个替换，而使用25纳克模板合成的ML25则含有九个替换。在克隆的pJFH1中，测序的核苷酸数量范围内未发现任何替换。与克隆的JFH1病毒相比，ML50病毒变异体对匹布伦赛韦的敏感性较低。在8个NS5A克隆中，4个具有D7V+F28C的组合，而V8A+F28C和F36L各出现在一个克隆中。这些突变位于NS5A的N端区域，该区域已知含有临床相关的NS5A耐药突变。ep-PCR中各组分的终浓度至关重要，尤其是模板量。缺少KB扩增子将显著降低ep-PCR产物的得率。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

反向遗传学设计正义RNA病毒变异株

本文描述了分离和鉴定RNA病毒RNA聚合酶保真性变异体所需的步骤，以及如何利用突变频率数据在组织培养中确认保真性的改变。...

RNA病毒保真性变异体的分离及病毒突变频率的表征

用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs...

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

诺如病毒是胃肠炎的主要病因之一，但针对其进行表征的分子技术仍相对较新。本文报道了两种不同的反向遗传学方法，可高效拯救小鼠诺如病毒（MNV），该病毒是此类病毒中唯一可在细胞培养中增殖的成员。...

反向遗传学介导的小鼠诺如病毒的感染性恢复

近年来，为了开发新的疫苗和治疗载体等应用，人们对新城疫病毒（NDV）进行了广泛研究。这些研究得以实现，得益于从cDNA中拯救重组病毒的技术，例如本文所描述的方法。...

从cDNA拯救重组新城疫病毒

本文介绍了一种构建感染性细菌人工染色体的实验方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组RNA的全长cDNA。该方案可用于构建其他正链RNA病毒的功能性cDNA，因此是研究病毒生物学的有力基因组学工具。...

细菌人工染色体：正链RNA病毒功能基因组学研究的工具

痘苗病毒（VV）已广泛应用于生物医学研究及人类健康改善。本文介绍一种利用CRISPR-Cas9系统对VV基因组进行编辑的简单且高效的方法。...

一种构建突变型痘苗病毒载体的简单高效方法

我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）的方法，以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案，这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。...

重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

通过质粒DNA拯救重组轮状病毒，为研究轮状病毒的复制机制、致病过程以及开发轮状病毒表达载体和疫苗提供了重要工具。本文介绍一种简化的反向遗传学方法，用于生成重组轮状病毒，包括表达荧光报告蛋白的病毒株。...

一种简化的反向遗传学方法用于拯救表达报告蛋白的重组轮状病毒

腺相关病毒肽展示文库的构建，以及通过条形码标记具有新特性的候选病毒，用于下一代腺相关病毒的创制与后续验证。...

通过腺相关病毒（AAV）衣壳变异体的改造、条形码标记与筛选分离下一代基因治疗载体

此处，我们详细说明该方法 S测序 P补骨脂素交联， L研究，并 S选出的 HSPLASH（通过测序进行RNA相互作用分析），可实现全基因组范围内分子内和分子间RNA-RNA相互作用的定位 体内SPLASH 可用于研究包括酵母、细菌和人类在内的生物体的 RNA...

利用生物素标记的补骨脂素全局绘制RNA-RNA相互作用

学习利用易错PCR技术构建丙型肝炎病毒全长突变RNA文库的无克隆方法。该方法可快速产生遗传多样性并在受控实验条件下筛选目标表型，为疫苗研发提供简便工具。

利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

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