通过高分辨率呼吸测量法评估坐骨神经的线粒体功能

该协议允许通过分离的线粒体进行包扎来评估神经内的线粒体功能，这是一个具有挑战性的过程，在含有有限数量的线粒体的小组织中。该技术提供了在原位分析保存的线粒体中同时分析线粒体功能的可能性，例如氧气消耗和ROS的产生。具有多种底物、抑制剂和解耦合器设计方案。

几种疾病共享线粒体功能，特别是由二型糖尿病或化疗引起的神经病变。在这些疾病中，线粒体氧化磷酸化的损害是决定疾病发展的唯一迹象。该方法提供了对神经生物学，生物化学和药理学的见解，研究了线粒体疾病机制，寻找治疗方法，例如线粒体助推器或改善的神经性疼痛。

首先，通过将2.1毫升MR缓冲液移液到每个腔室中来校准氧传感器。用塞子将其关闭，并将空气吸入腔室，直到形成气泡。在校准模式下在37摄氏度下搅拌一小时，直到每个质量的氧通量稳定下来。

使用HRR软件根据制造商的说明对极谱法氧传感器进行空气校准。对于组织制备，将坐骨神经放入培养皿中，有足够的TP缓冲液覆盖它。用镊子握住神经的一端，用另一对镊子水平拉出神经束。

首先，将显示的组织转移到含有一毫升TP缓冲液的小培养皿中以进行组织透化。为了开始透化，用镊子将组织转移到另一个含有一毫升TP缓冲液的培养皿中，每毫升含有50微克皂苷。将板放入微孔板振荡器中，轻轻搅拌30分钟。

然后，用镊子将组织转移到含有一毫升MR缓冲液的新鲜培养皿中，并使其轻轻搅拌10分钟。用镊子将组织转移到校准的HRR室中。用2.1毫升MR缓冲液填充HRR室。

将 Amplex 红和过氧化物酶加入最终浓度分别为 5 微摩尔和每毫升 2 个单位。然后，加入可渗透的坐骨神经。安装仪器的荧光传感器。

然后，关闭软件控制部分中的灯，然后单击连接到软件中的oxygraph"转到编辑方案"并插入组织重量。转到布局并选择每个单位样品的特定通量"选项。然后选择绘图以同时访问氧气消耗读数，并在需要时访问过氧化氢生产。

等待大约 10 分钟。注入两个脉冲的过氧化氢，每个脉冲的最终浓度为260微摩尔，用于校准腔室。注入20微升琥珀酸盐，一种线粒体复合物II底物，以激活线粒体电子传递系统。

加入20微升ADP以激活ATP合成。按顺序，加入5微升细胞色素c作为膜完整性的指示剂。用等分试样滴定每毫升少霉素0.2μg，直到没有观察到氧气消耗的进一步减少。

用等分试样滴定每升FCCP0.5微摩尔，线粒体解偶联剂，直到没有观察到氧气消耗的进一步增加。为了结束实验，注入两微升抗霉素A，做最终浓度为5毫摩尔并等待流量稳定下来。转到命令栏。

在软件中搜索多感官"。单击控制"然后按保存文件"并断开连接。打开保存的文件并选择每个质量托盘的氧通量，以获得实验耗氧结果。

通过按Shift加鼠标左键手动选择注射之间的窗口。转到标记，然后选择统计数据以可视化每次注射底物，抑制剂和解耦合器方案的结果。对于过氧化氢生产，请使用放大器斜率迹线执行相同的程序。

ATP合成酶活性促进的膜电位降低加速了氧气消耗。外源性细胞色素C的添加仅促进了对呼吸的最小刺激，证明了该制剂的线粒体外膜完整性。记录了绝对氧流量，仅观察到呼吸增加6.3%，表明组织制备质量良好。

在为电子传输系统提供燃料的不同基板存在下同时测量氧气消耗量和ROS产生量。添加丙酮酸盐和苹果酸盐用于线粒体复合物I增加了呼吸。进一步添加琥珀酸盐用于复合物II也会增加氧气消耗。

因此，可以测试其他基板。ROS的产生也增加了，表明氧气从电子传输系统中泄漏。在饱和浓度中添加二磷酸腺苷会增加氧气消耗，从而推动ATP的形成，并减少ROS的产生。

相比之下，寡核苷酸滴定法减少了氧气消耗并增加了ROS的产生。这表明渗透的坐骨神经可以复制线粒体生理学中的标准关系。FCCP和视黄酮的加入与预期的氧通量变化一致，证实了线粒体生理学和生物能量谱保留在透化的坐骨神经中。

最重要的一步是轻轻地准备组织切片，确保所有腔室开口都得到适当清洁。线粒体功能的改变可能是由于功能障碍或线粒体数量减少。因此，建议通过PCR进行合酶活性和线粒体DNA含量的确认。