探究缓解效应 Bacillus cereus 通过肠道微生物群调节治疗结肠炎

该方案可用于评估益生菌补充对健康的双向调节作用，并获得稳定且可重复的结果。为避免使用无菌小鼠作为益生菌受体时存在的一些实验室限制，本研究建立了采用伪无菌小鼠的替代性DSS诱导结肠炎模型。为探究益生菌在此技术中的有益作用，该方法为开发缓解慢性炎症相关疾病症状的新型治疗策略提供了良好前景。

首先，通过将氨苄青霉素、硫酸新霉素、甲硝唑和万古霉素溶解于饮用水中来配制抗生素混合液。完全溶解后，将溶液储存在 4 摄氏度条件下。将抗生素混合液放入饮水瓶中。

务必使用棕色瓶或将瓶子用铝箔包裹，以保护抗生素溶液免受光照。将瓶子放置在小鼠笼具上方。配制2.5%的葡聚糖硫酸钠溶液时，将2.5克DSS溶解于100毫升蒸馏水中。

将结肠炎模型小鼠组的饮用水更换为2.5% DSS溶液。为评估枯草芽孢杆菌（B cereus）缓解结肠炎的积极作用，将小鼠随机分为以下三组：对照组、DSS诱导的结肠炎模型组，以及DSS诱导后补充益生菌枯草芽孢杆菌（B cereus）组。为探究肠道菌群在调节枯草芽孢杆菌（B cereus）对DSS诱导结肠炎益生作用中的角色，将小鼠随机分为以下三组：ABX/对照组、ABX/DSS组，以及ABX/枯草芽孢杆菌（B cereus）联合DSS组。

在给予抗生素混合物后，记录小鼠的体重作为基线体重。立即用含2.5% DSS的饮用水溶液处理雄性C57BL/6小鼠，持续七天。准备八个1.5毫升微量离心管，每管加入900微升无菌生理盐水。

取100微升处于对数生长期的B. cereus，溶解于900微升无菌生理盐水中。使用试管对B. cereus进行系列稀释。将每个稀释度的40微升样品接种至相应标记有稀释比例的LB琼脂平板上。

每种稀释比例重复三次。将平板置于37°C恒温培养箱中培养16小时。选择菌落数约为20至70的平板进行计数。

在定量蜡样芽孢杆菌（B cereus）后，取含有1 × 10⁹ CFU的蜡样芽孢杆菌培养液1毫升，于8,000 ×g离心10分钟。随后用无菌水将菌体洗涤两次，每次在8,000 ×g下离心10分钟，并弃去上清液。最后用无菌生理盐水将浓缩的蜡样芽孢杆菌稀释至每200微升含2 × 10⁸ CFU的终浓度。

用移液器反复吹打以获得均匀分散的 B. cereus 悬液。用70%乙醇擦拭灌胃针外壁，确保给药剂量准确。固定小鼠时，用手抓住其尾部，将小鼠提起，并用操作者最后两根手指夹住尾根，同时牢固抓住背部松弛的皮肤。

将小鼠保持在垂直位置。然后小心轻柔地将灌胃针从口腔插入食道。给予蜡样芽孢杆菌（B. cereus）溶液，轻柔地拔出针头，并将小鼠放回笼中。

每天测量小鼠的体重，并立即将粪便样本收集到无菌离心管中。使用粪便隐血检测试纸检测粪便隐血。用棉签收集10毫克粪便样本。

将标本置于检测卡上，并在卡上涂抹成薄层。打开背面的翻盖，将显影剂覆盖于涂片上。将小鼠仰卧位固定于手术台上，切开腹腔。

手术分离整个结肠，并用尺子测量其长度。然后用装有预冷 PBS 的 5 毫升注射器轻轻冲洗结肠。脱蜡并水化结肠组织切片。

接下来，用苏木精和伊红对结肠组织切片进行染色。由两位独立的实验人员在光学显微镜下评估样本的组织学评分。苏木精和伊红染色显示，结肠炎模型小鼠的结肠组织出现隐窝丢失、杯状细胞损伤、炎性细胞浸润以及上皮层缺失。B. cereus 处理改善了DSS诱导的组织病理学损伤。

结肠炎小鼠的组织病理学评分显著高于对照组。然而，枯草芽孢杆菌组的组织病理学评分显著低于结肠炎小鼠。小鼠被随机分为三组，与ABX/对照组小鼠相比，ABX/DSS组小鼠的体重下降更明显，疾病活动指数（DAI）评分和组织病理学评分更高，结肠长度更短。

在 ABX/DSS 组与 ABX/B cereus 联合 DSS 组之间，体重减轻、结肠长度、疾病活动指数（DAI）评分以及组织病理学评分均无统计学差异。本研究结果间接表明，肠道微生物群在 B cereus 对结肠炎的积极作用中起着关键作用。其中最重要的步骤之一是通过灌胃法给予 Bacillus cereus，以建立小鼠结肠炎模型。

枯草芽孢杆菌的治疗消除了DSS诱导的结肠炎，这为后续研究益生菌治疗结肠炎奠定了基础。