Name: 改善肾去神经支配缓解血管紧张素II.诱导的高血压 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 了解肾去神经支配技术在小鼠高血压模型中的应用方法，该方法通过苯酚乙醇溶液处理肾动脉周围神经而不损伤血管。这一标准化方案为研究高血压和心肌肥厚的调控机制提供了可靠的实验基础。

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本工作得到国家自然科学基金（81770420）、上海市科学技术委员会（20140900600）、上海老年医学临床重点实验室（13dz2260700）、上海市市级临床重点专科（shslczdzk02801）以及复旦大学附属华山医院老年冠心病中心的支持。

所有动物实验操作均符合《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，2011年修订版）的相关伦理要求，并经复旦大学附属华山医院动物研究委员会批准。将14周龄雄性C57BL/6小鼠（28-30 g）随机分为四组：假手术组（Sham组）、假手术+Ang II组（Sham+Ang II组）、肾去神经术组（RDN组）、肾去神经术+Ang II组（RDN+Ang II组），每组n = 6。所有动物均饲养于温度控制在24 ± 1 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的特定封闭无病原环境中，可自由获取标准啮齿类动物饲料和饮水。
1. 手术区域的准备
<ol>
	<li>使用70%乙醇对操作台进行消毒。将加热垫温度调节至37 °C。</li>
	<li>确保所有手术器械在手术前已在121 °C下灭菌30分钟，或采用其他方法进行灭菌。本操作需要显微手术剪、两个精细直镊、两个精细弯镊、止血钳、无菌纱布和称量纸。</li>
</ol>
2. 血管紧张素II诱导的高血压
<ol>
	<li>在麻醉诱导前，立即给予 C57BL/6 小鼠美洛昔康（0.5 mg/kg，皮下注射）。随后，按照先前所述方法通过戊巴比妥钠注射进行麻醉20,21。如有需要，也可使用异氟烷。通过夹趾反射阴性确认麻醉深度。</li>
	<li>使用剃毛器去除背部毛发。在麻醉期间，将兽用眼膏涂抹于眼睛以防止干燥。</li>
	<li>将动物置于手术台上，呈背侧卧位。用聚维酮碘擦拭剃毛区域，随后用70%乙醇擦拭三次。</li>
	<li>使用无菌手术刀片，在耳后肩胛骨前方沿垂直于尾部方向做1 cm切口。</li>
	<li>使用无菌止血钳在皮下皮肤下制作一个皮下隧道，形成用于植入泵的囊袋22。轻柔地将装有血管紧张素II（1,000 ng/kg/min）的渗透泵插入囊袋中。确保留有足够的自由空间，以便缝合伤口时无需牵拉皮肤。</li>
	<li>使用间断的6-0薇乔缝线缝合肌肉，并使用间断的4-0尼龙缝线缝合皮肤。用聚维酮碘擦拭伤口部位。对照组动物进行相同手术，但植入等体积的生理盐水。</li>
	<li>将所有手术器械放入灭菌器中处理10秒，并在每次手术之间更换无菌手套。密切监测所有小鼠，直至其完全恢复。</li>
	<li>在术后第一周内每天至少两次密切观察小鼠伤口愈合情况，之后每天一次，观察内容包括红肿、肿胀和感染。若小鼠在血管紧张素II输注期间死亡，应立即进行解剖。</li>
	<li>在血管紧张素II输注前（基线）及之后每周，采用尾套体积描记法23在清醒小鼠中测量血压。确保血压测量实验在安静环境中进行，温度为22 ± 2 °C，且小鼠在实验开始前已在该环境中适应1小时。在基线血压测量前，至少连续5天对小鼠进行适应性训练23,24。</li>
</ol>
3. 双侧肾去神经支配
<ol>
	<li>在血管紧张素II（Ang II）灌注1周后，选择血压（BP）≥140/90 mmHg或收缩压/舒张压升高25%的小鼠。</li>
	<li>手术前记录动物体重，并选择体重不低于24 g的小鼠进行肾去神经手术。</li>
	<li>使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，并通过脚趾夹捏反射阴性确认麻醉深度。</li>
	<li>使用剃毛器去除腹部毛发。操作时应仔细彻底，以避免任何手术污染。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术台上，四肢用胶带固定。先用聚维酮碘消毒腹部皮肤，再用70%乙醇擦拭三次。</li>
	<li>使用手术刀片沿腹中线做一条长约2 cm的腹正中切口。用浸有37 °C生理盐水的纱布将肠管轻轻推开，暴露左侧肾动脉。使用弯头镊子仔细且钝性分离肾动脉周围的脂肪组织。（图1A-C）。</li>
	<li>使用无菌锋利剪刀将称量纸剪成与肾动脉大小相同的矩形。作为参考，可按照图1C中虚线所示尺寸进行裁剪。 
	注意：此步骤是手术中的关键环节，建议一次性多准备几片相同形状的称量纸，以保持一致性。</li>
	<li>将称量纸浸入10%苯酚/乙醇溶液中至少30秒。将其覆盖于左侧肾动脉表面并包裹血管，保持2分钟（图1D）。使用纱布保护周围组织，防止称量纸接触周围肾脏和肠管。 
	&#8203;注意：苯酚溶液在塑料管中稳定，但在玻璃小瓶中不稳定。因此，每次实验前必须新鲜配制18。</li>
	<li>对右侧肾动脉执行相同操作。假手术组使用浸有生理盐水的称量纸进行处理。</li>
	<li>将肌肉复位，并使用6-0 Vicryl缝线间断缝合腹膜。随后使用4-0尼龙缝线间断缝合皮肤。密切监测所有小鼠，直至其完全恢复。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>在切口处涂抹聚维酮碘，并将动物置于加热的电热毯上以恢复并进行术后监测。</li>
	<li>每天监测小鼠两次，评估是否存在红肿、疼痛或腹部感染。在肾去神经支配（RDN）手术前约1小时和术后24小时，为所有小鼠皮下注射美洛昔康（0.5 mg/kg）。</li>
</ol>

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<li>Esler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illusions+of+truths+in+the+Symplicity+HTN-3+trial%3A+generic+design+strengths+but+neuroscience+failings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Illusions of truths in the Symplicity HTN-3 trial: generic design strengths but neuroscience failings.</a> Journal of the American Society of Hypertension. 8 (8), 593-598 (2014).</li>
<li>Han, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+sustained-release+deoxycorticosterone+acetate-induced+hypertension+in+Bama+miniature+pigs+for+renal+sympathetic+nerve+denervation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Low-dose sustained-release deoxycorticosterone acetate-induced hypertension in Bama miniature pigs for renal sympathetic nerve denervation.</a> Journal of the American Society of Hypertension. 11 (5), 314-320 (2017).</li>
<li>Han, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+of+renal+denervation+as+assessed+by+optical+coherence+tomography%3A+pre-+and+post-procedure+comparison+with+multi-electrode+ablation+catheter+in+animal+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Hellenic+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The safety of renal denervation as assessed by optical coherence tomography: pre- and post-procedure comparison with multi-electrode ablation catheter in animal experiment.</a> Hellenic Journal of Cardiology. 61 (3), 190-196 (2020).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+stereotactic+radiotherapy+for+renal+denervation+in+a+swine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive stereotactic radiotherapy for renal denervation in a swine model.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (13), 1697-1709 (2019).</li>
</ol>

作者声明不存在任何利益冲突，无论是经济上的还是其他方面的。

自SYMPLICITY HTN-3试验得出阴性结果以来，肾去神经支配术（RDN）是否能够降低血压一直存在争议7,25。然而，已有多个临床试验和动物实验表明，RDN对高血压患者及动物具有积极且有效的作用9,10,11,12,13,14,15,16,17。在动物实验中，苯酚被用于破坏肾神经，但既往研究中关于消融的具体细节尚不明确...

高血压是全球主要的慢性心血管疾病。未控制的高血压可损害靶器官，导致心力衰竭、中风和慢性肾脏疾病1,2,3。在中国，高血压的患病率从1991年到2007年间从20%上升至31%。随着高血压诊断标准近期修订为130/80 mmHg，中国高血压成人患者人数可能翻倍4。高血压可通过药物控制，但约有20%的患者即使接受至少三种降压药物（包括一种利尿剂）治疗且剂量已达最大耐受剂量，仍无法控制血压，可能导致难治性高血压的发生5。
肾动脉去神经术（RDN）已被证明是治疗高血压的一种潜在方法。2009年，Krum 及其同事首次报道了使用 RDN 治疗难治性高血压的研究，发现经皮肾动脉消融可有效使患者血压持续降低6。然而，Symplicity 高血压 3（HTN-3）试验的失败阻碍了 RDN 的应用7，使 RDN 成为一种有争议的治疗方法。尽管如此，RDN 的前景尚未被排除。近期的临床试验，包括 RADIANCE-HTN SOLO、SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED 以及 SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal，已证实了 RDN 对高血压的疗效8,9,10,11,12。因此，需要开展更深入的机制研究，以探索 RDN 的作用效果。
本研究的总体目的是展示如何改进小鼠肾去神经术（RDN），以实现更简便且更稳定的手术操作。已有大量实验研究了多种RDN方法，例如血管内冷冻消融、体外超声以及在不同动物模型中局部应用化学物质或神经毒素13,14,15,16,17。利用苯酚进行化学消融所建立的RDN模型是一种成熟的实验模型，可用于研究交感神经激活在高血压发病机制中的作用。该模型通过使用棉签将10%苯酚/乙醇溶液作用于肾交感神经，造成其化学腐蚀而建立18。一方面，传统的RDN可能抑制肾交感神经活性，从而减少肾素分泌和钠重吸收，并增加肾血流量；另一方面，它还能抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统19。因此，RDN对高血压具有有益作用。然而，采用化学消融建立的RDN模型缺乏明确的消融标准和消融时间，其实验操作细节尚不清晰，且目前尚无相关技术报告。在本报告中，我们描述了一种在血管紧张素II（Ang II）诱导的C57BL/6小鼠高血压模型中，使用称量纸进行苯酚消融以建立RDN模型的手术方案。我们采用含苯酚的称量纸包裹肾动脉，并统一消融时间，有助于建立更具可重复性和可靠性的RDN模型。该实验模型旨在评估RDN对高血压的影响。

<table><tbody><tr><td>血管紧张素 II</td><td>Sangon Biotech</td><td>CAS:4474-91-3</td><td>用于构建高血压动物模型</td></tr><tr><td>酪氨酸羟化酶抗体</td><td>Abcam</td><td>ab137869</td><td>用于评估肾神经中酪氨酸羟化酶（TH）的表达水平</td></tr><tr><td>血压分析系统</td><td>Visitech Systems</td><td>BP-2000</td><td>用于测量小鼠血压</td></tr><tr><td>微型渗透压泵</td><td>DURECT Corporation</td><td>CA 95014</td><td>用于装载血管紧张素 II</td></tr><tr><td>去甲肾上腺素 ELISA 试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab287789</td><td>用于测定肾脏去甲肾上腺素水平</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Sangon Biotech</td><td>CAS:108-95-2</td><td>用于损毁肾交感神经</td></tr><tr><td>称量纸</td><td>Sangon Biotech</td><td>F512112</td><td>将称量纸浸入苯酚后用于损毁肾神经；https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

经血管内去肾交感神经术改善血管紧张素ii输注诱导的高血压

Improved Renal Denervation Mitigated Hypertension Induced by Angiotensin II Infusion

近年来，大量临床试验证实了肾交感神经消融术（RDN）对血压的益处。然而，RDN在高血压调控中的机制仍不明确。因此，建立一种更简便的小鼠RDN模型显得尤为重要。本研究中，将装有血管紧张素II的渗透微型泵植入14周龄的C57BL/6小鼠体内。微型渗透泵植入一周后，采用苯酚对小鼠双侧肾动脉实施改良的RDN手术。以年龄和性别匹配、注射生理盐水的小鼠作为假手术对照组。在基线期及之后每星期测量血压，持续21天。随后采集肾动脉、腹主动脉和心脏组织，进行H&amp;#38;E染色和Masson染色的组织学检查。本研究建立了一种简单、实用、可重复且标准化的RDN小鼠模型，该模型能够控制高血压并减轻心脏肥厚。该技术可在不损伤肾动脉的前提下消融外周肾交感神经。与以往模型相比，改良的RDN方法更有利于高血压病理生物学和病理生理学的研究。

统计学 
所有数据均以均值 ± 标准差表示。对于包含三个或更多条件的实验，采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Bonferroni 事后检验以比较各组之间差异。将 p 值小于或等于 0.05 视为具有统计学显著性。所有统计分析均使用商业软件完成。
肾去神经术后 Ang II 引起的血压升高受到抑制 
在 Ang II 输注后 1 周，观察到收缩压（SBP）显著升高。与假手术 + Ang II 组相比，肾去神经术 + Ang II 组在术后 21 天的 SBP 显著降低（143.50 ± 5.43 vs 196.67 ± 14.26 mmHg，p &lt; 0.01）。术后 2 周时，假手术组与肾去神经术组之间无显著差异（113.33 ± 9.35 vs 113.17 ± 8.47 mmHg，p &gt; 0.05）（图 2）。
肾去神经术（RDN）效果及肾动脉损伤的...

本文介绍了一种对由血管紧张素II输注诱导高血压的小鼠进行肾交感神经消融（RDN）的实验方案。该方法可重复、操作便捷，可用于研究RDN对高血压及心脏肥厚的调控机制。

经血管内去肾交感神经术改善血管紧张素II输注诱导的高血压

近年来，大量临床试验证实了肾交感神经消融术（RDN）在降低血压方面的益处。然而，……

肾交感神经消融术是高血压的一种潜在治疗方法，已通过多项临床试验得到证实。该技术可在不损伤肾动脉的情况下消融自由走行的肾神经。此外，该模型具有操作简便、关键性强、可重复且标准化的特点。本实验操作将由我实验室的技术员 Ming Wang 示范。首先使用 70% 乙醇对操作台进行消毒，然后将加热垫温度调节至 37 °C。手术前，将所有手术器械（包括显微剪刀、细直镊、细弯镊、止血钳、无菌纱布和称量纸）在 121 °C 下灭菌 30 分钟。麻醉一只14周龄的雄性C57BKL/6小鼠后，用剃毛器去除背部毛发，然后在眼睛上涂抹兽用软膏以防止干燥。将小鼠仰卧位固定于手术台上。先用聚维酮碘擦拭剃毛区域，随后用70%乙醇擦拭三次。使用无菌手术刀片，在前肢肩胛骨后方耳后处，垂直于尾部做一厘米长的切口。接着，使用无菌止血钳在皮下组织中穿过皮肤，形成皮下隧道，并创建一个用于放置泵的囊腔。轻柔地将装有血管紧张素II的渗透压泵插入该囊腔，确保留有足够空间，以便缝合伤口时不会牵拉皮肤。使用间断的6-0薇乔缝线缝合肌肉，并使用间断的4-0尼龙缝线缝合皮肤。然后用聚维碘酮擦拭并清洁伤口部位。将所有手术器械放入灭菌器中灭菌10秒，并在每次手术之间更换无菌手套。持续监测小鼠直至其完全恢复。在输注血管紧张素 II 的第一周内，每天至少密切观察伤口愈合情况两次，之后每天一次，观察内容包括红肿和感染等。若小鼠在输注血管紧张素 II 期间死亡，应立即进行解剖。在清醒小鼠中，使用尾套体积描记法于血管紧张素II输注前（基线）及之后每周测量血压。血管紧张素II输注一周后，选择血压升高的小鼠并记录其体重。选择体重不低于24克的小鼠进行肾去神经手术。接下来，使用剃毛器去除麻醉小鼠腹部的毛发，然后将小鼠置于手术台上，保持腹部朝上，用胶带固定四肢。先用聚维酮碘对腹部皮肤进行消毒，再用70%乙醇擦拭三次。在做一条两厘米长的腹正中线腹壁切口后，用浸有37摄氏度生理盐水的纱布将肠管向后推开，以暴露左侧肾动脉。使用弯头镊子仔细但钝性地分离肾动脉周围的脂肪组织。使用无菌的锋利剪刀，将称量纸剪成与肾动脉大小相同的矩形。一次性裁剪多张称量纸，以保持形状一致。将称量纸浸入10%苯酚乙醇溶液中至少30秒。覆盖左肾动脉表面，并用称量纸包裹血管两分钟。使用纱布保护周围组织，避免称重纸接触肾脏和肠道。对右侧肾动脉重复相同操作。术后将肌肉复位至初始位置，采用6-0 Vicryl缝线间断缝合腹膜，随后用4-0尼龙缝线间断缝合皮肤。持续监测所有小鼠直至完全恢复。在血管紧张素II输注后一周，观察到收缩压显著升高。与假手术血管紧张素II组相比，肾交感神经消融（RDN）联合血管紧张素II组在RDN术后21天表现出收缩压显著降低。在去肾交感神经术（RDN）操作后两周，假手术组与 RDN 组之间未观察到显著差异。此处展示了肾交感神经和肾动脉的苏木精-伊红染色结果。在四组中均未观察到肾动脉内膜层增厚现象。与假手术组相比，两种去肾交感神经（RDN）组均观察到细胞核碎裂和固缩，以及神经内膜组织的消化和肿胀。神经束的免疫组织化学结果显示，与假手术组相比，RDN组和RDN联合血管紧张素II组的酪氨酸羟化酶表达显著降低。在正常血压和高血压组中，去神经支配肾脏的肾皮质去甲肾上腺素含量均较有神经支配的肾脏显著减少。Masson染色显示各组间腹主动脉内膜中层无明显增厚。此处展示了不同组心肌的代表性图像。通过减少间质纤维化和心肌细胞大小，肾去神经术（RDN）治疗改善了血管紧张素II输注引起的心脏肥厚。操作过程中，除肾动脉外，切勿让苯酚接触周围组织，以免引起肠梗阻、腹腔感染及肾动脉狭窄。该方法可建立标准化的去肾交感神经模型，有助于研究调控高血压的机制。该技术的未来应用有望进一步拓展对高血压及心脏肥厚发生机制相关通路的认识。

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改善肾去神经支配缓解血管紧张素II.诱导的高血压

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