Name: 从人脐带组织中生成间充质干细胞及其分化为骨骼肌谱系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习从人脐带组织中分离高活性间充质干细胞并分化为骨骼肌谱系的方法。该技术可有效减少内皮细胞污染，为再生医学研究提供可靠的细胞来源和应用方案。

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感谢 Ojas Tikoo 先生在拍摄和视频制作方面提供的帮助。我们还感谢 GARBH-Ini（印度生物技术部跨学科先进研究与出生结局研究组）在古鲁格拉姆市民医院的工作人员、护士和高级研究官员，以及 Pallavi Kshetrapal 博士在后勤方面提供的协助。本研究得到了印度生物技术部授予 Suchitra Gopinath 的资助（项目编号：BT/09/IYBA/2015；BT/PR29599/PFN/20/1393/2018）。

本研究使用脐带组织已获得干细胞研究机构委员会（IC-SCR）、转化健康科学与技术研究所机构伦理委员会（IEC-THSTI）、哈里亚纳邦古鲁格拉姆市民医院机构伦理委员会以及THSTI机构生物安全委员会的批准。人脐带组织样本采集自足月分娩时的新生儿脐带。已从受试者处获得知情书面同意。所有方法均严格按照相关指南和法规进行。
1. 从脐带组织中分离间充质干细胞
<ol>
	<li>在样本送达时，剪取至少 5 cm 的脐带组织，最好靠近胎盘端，并用 70% 乙醇擦拭脐带外表面进行消毒。将脐带组织依次从一个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的 50 mL 收集管转移至另一个含有相同溶液的收集管中。在 1 小时内将标有受试者姓名的收集管置于冰上运送至实验室。 
	注意：对于较大规模的研究，建议对样本进行条形码标记，以便在整个研究过程中追踪样本。重要的是，所有操作人体组织的人员均应接种完整的乙型肝炎疫苗。</li>
	<li>在实验室中，于生物安全二级（BSL-2）操作台内开启紫外灯照射 25 分钟，以对将要使用的已灭菌器械和移液器进行消毒。</li>
	<li>将脐带组织从收集管转移至一个 10 cm2 的组织培养处理培养皿中，该培养皿内含有添加了 5 g/L 葡萄糖、50 µg/mL 庆大霉素、2.5 µg/mL 两性霉素 B、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 PBS 溶液（示意图见 图 1）。</li>
	<li>使用手术刀沿脐带的纵轴垂直切开，得到两个半圆柱形的组织块。由于脐带存在扭转及黏液状表面，可用另一只手握持的镊子将组织固定住。</li>
	<li>此时观察脐动脉和脐静脉，并使用手术刀沿单一方向从表面刮除这些血管。再次用 PBS 冲洗脐带组织，以去除所有与组织相关的残留血液。确保刮除操作轻柔，以维持血管周围华通胶（WJ）中细胞的完整性。</li>
	<li>将每半个脐带组织切成约 0.5 cm3 大小的碎片，并将碎片的腔面朝下放置于培养皿中。将培养皿短暂置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 10 分钟。</li>
	<li>孵育后，向含有脐带组织碎片的培养皿中加入 20 mL 培养基，培养基成分为不含 L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷的 MEM α 修改培养基，添加 15% 胎牛血清（未经热灭活）和 50 µg/mL 庆大霉素。沿培养皿壁缓慢加入培养基，避免组织外植块移位。加入过量培养基以补偿组织外植块在孵育过程中吸收的部分。</li>
	<li>孵育 3 天后，向培养物中补充新鲜培养基。操作培养皿时应确保培养物免受震动，防止外植块移动。</li>
	<li>1 周后，使用无菌镊子逐一取出组织碎片，并使用适当的生物危害袋丢弃。保留原有培养基，并加入 10 mL 新鲜生长培养基。此后每 4 天更换一次生长培养基，直至单个细胞集落达到 70% 汇合度。 
	注意：细胞在培养皿中的分布可能不均匀，会出现多个独立增殖的细胞集落，需随时间推移监测其汇合情况。通常在一个月内，一个 10 cm2 培养皿可产生足够数量的细胞，可用于传代至新的培养皿。</li>
	<li>使用胰蛋白酶/EDTA 溶液（1× 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 溶于 Hanks 平衡盐溶液 [HBSS]）消化贴壁细胞。在 25 °C 下以 470 × g 离心 5 分钟，收集细胞悬液，弃上清，将细胞沉淀重悬于生长培养基中。</li>
</ol>
2. uMSCs 的免疫表型分析与扩增
<ol>
	<li>当贴壁细胞达到50%-60%融合度且充分铺展后，进行免疫表型分析。不要在完全融合的培养物上进行间充质干细胞（MSC）标志物分析，因为这往往会导致关键MSC标志物的下调。</li>
	<li>消化后，将细胞悬液以1 × 106 个细胞/mL的浓度分配至FACS管中（每管1 × 105 个细胞），并联合使用适当的荧光染料标记抗体（均为1:50稀释）进行染色：未染色对照；CD105 + CD90；CD105 + CD73；CD105；CD90；CD73；CD34 + CD45（共用荧光染料）；每种荧光染料对应的同型对照。在流式细胞仪上至少记录10,000个事件用于后续分析。 
	注意：由于各表面标志物分别单独检测，无需对细胞亚群进行设门。</li>
	<li>除上述标志物外，还需确认从不同脐带组织样本建立的尿源性间充质干细胞（uMSC）系中阳性与阴性表面标志物的表达情况（表1）。</li>
	<li>通过流式细胞术分析标记后的细胞，确定CD105+CD90+ 和 CD105+CD73+ 细胞的百分比，并分别分析CD105+ 及 CD34−CD45− 细胞。</li>
</ol>
3. uMSCs 向骨骼肌的分化
<ol>
	<li>用 PBS 中含 0.01% 胶原和 20 µg/mL 层粘连蛋白的溶液包被组织培养板，在室温下包被至少 4 小时。</li>
	<li>以 10,000 个细胞/cm2 的密度将 uMSCs 接种于生长培养基中。</li>
	<li>当细胞融合度达到 70% 时，吸除生长培养基，用 PBS 洗涤细胞 2 次。向 uMSCs 中加入成肌分化培养基（M1），其成分为 DMEM + 5% 马血清 + 0.1 µM 地塞米松 + 50 µM 氢化可的松。为确定成肌分化进程的动力学，每隔一天向培养物中添加一次 M1 培养基。</li>
	<li>为确定成肌分化进程的动力学，在接种后第 2 天、第 4–5 天、第 6–7 天以及第 10–14 天分别检测 uMSCs 中 Pax7、MyoD、Myogenin 和 MyHC 的表达情况。</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

关键步骤 
本方案中的一个关键步骤是从组织获取到整个扩增期间，在无菌条件下进行组织采集并维持无菌培养。在采集脐带时，必须确保脐带不接触任何非无菌表面，并在将其收集至含有抗生素的 PBS 管之前，用 70% 乙醇对外表面进行擦拭。从脐带采集到组织处理以分离脐带间充质干细胞（uMSC）之间的时间应尽可能缩短。如果需要将组织从采集地点运输至实验室，必须注意将组织保存在含有抗生素的缓冲液中，并置于冰上运输。
方法的改进与故障排除 
本实验方案中诱导尿源性间充质干细胞（uMSCs）成肌分化的关键改进在于使用0.01% I型胶原蛋白和20 µg/mL 层粘连蛋白包被培养皿。我们观察到，在M1培养基存在的情况下，当细胞黏附条件得到调控时，uMSCs的成肌分化进程得以增强。是否使用其他更高效但价格较高的基质（如Matrigel）可进一步优化本方案，仍有待验证。不同样本之间的产量差异可能导致某些组织获得的细胞数量较低。在此情况下，建议采集更长的脐带组织，其长度应&#62;5 cm。有少数文献报道使用10 cm长的...

人类脐带被认为含有丰富的间充质干细胞，这些细胞因其强大的增殖和分化能力、免疫调节特性以及生成三个胚层来源细胞的潜能，目前正在被广泛探索用于再生医学治疗1。脐带组织包含多个区室，如脐带血、脐静脉内皮下层以及华通胶（Wharton's jelly, WJ），而华通胶本身又可分为三个界限不清的区域——血管周围区、血管间区以及羊膜下层或脐带内衬（cord lining, CL）2。尽管间充质干细胞（uMSCs）可从上述各个区域分离获得，并普遍表达关键的间充质干细胞标志物，但目前尚不清楚这些区室是否含有相同的uMSC群体，或在分化潜能方面存在差异3。因此，uMSC的分离方案需要在分离方式和区域定位上更加精确，对分化潜能进行系统而严谨的表征，并最终实现对脐带不同区室来源细胞的比较分析。
在此背景下，少数研究已揭示了脐带不同部位间uMSC增殖潜能和分化潜能的差异。其中，对来自脐带外层（CL）和华通胶（WJ）区域分离的uMSC进行的比较分析显示，CL来源的uMSC具有更高的增殖潜能3,4。另一项研究发现，在增殖实验中，WJ来源的uMSC表现优于血管周围细胞（HUCPV）5。在比较脐带血来源的uMSC与无血管污染的脐带组织来源uMSC时，报道了两种来源细胞在关键MSC标志物表达上的差异，以及脐带组织来源uMSC增殖速率的提高6。
在众多研究中，主要探讨了尿源性间充质干细胞（uMSCs）向中胚层谱系组织（如成骨、成脂和成软骨谱系）的分化潜能，但极少有研究提供关于肌源性分化的详细实验方案、后续表征方法，以及不同脐带组织区室间的比较分析。在此背景下，我们建立了一种可靠的肌肉分化方案，并观察到来源于脐带组织的uMSCs在肌源性分化能力方面优于脐带血来源的细胞6。本文详细描述了一步一步的操作流程，包括从完整脐带组织（去除与血管系统相关的细胞）中分离uMSCs、细胞鉴定及其向肌源性谱系分化的全过程。

<table><tbody><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>抗生素溶液 100倍液，内毒素检测合格（每毫升含10,000 U青霉素和10 mg链霉素，溶于0.9%生理盐水）</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>抗GAPDH抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>抗MyHC抗体（My32）</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>抗MyoD抗体（5.8A）</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>抗肌细胞生成素抗体（克隆F5D）</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>抗Pax7抗体</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC标记小鼠抗人CD90克隆5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II 或 FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，来自巴西</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td>不得进行热灭活</td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人CD106克隆51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人CD14克隆M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人CD31克隆WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人CD34克隆581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人CD45克隆HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人CD49D克隆9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人CD90克隆5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人HLA-A,B,C克隆G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记小鼠抗人IgG克隆G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo软件</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM α改良培养基，不含L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷</td><td>Hyclone</td><td>SH30568.FS</td><td>uMSCs的基础培养基</td></tr><tr><td>PE标记小鼠抗人CD105克隆266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE标记小鼠抗人CD44克隆515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE标记小鼠抗人CD49E克隆llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE标记小鼠抗人IgG克隆G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7标记小鼠抗人CD73克隆AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH=7.4</td><td>HiMedia</td><td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA溶液（1×，含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的Hanks平衡盐溶液（HBSS））</td><td>HiMedia</td><td>TCL049-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

从人脐带组织中生成间充质干细胞及其向骨骼肌谱系的分化

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

间充质干细胞治疗潜力的探索依赖于其分离的难易程度、分化能力以及来源的可靠性与稳定性。本文介绍了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞（uMSCs）的逐步操作流程，包括其免疫表型鉴定及多代培养过程中的扩增方法。该方法无需酶消化，因此uMSCs的存活率较高。此外，通过去除包括脐动脉和脐静脉在内的血管结构，可有效避免内皮来源细胞的污染。流式细胞术分析显示，分离获得的uMSCs为CD45−CD34−，表明不存在造血谱系来源的细胞。重要的是，这些细胞表达关键的表面标志物CD105、CD90和CD73。在成功建立细胞系后，本文进一步描述了一种高效诱导uMSCs向骨骼肌谱系分化的实验方法。对分化后uMSCs的成肌过程进行详细分析发现，在分化的初始阶段，uMSCs表达成肌前体细胞标志物Pax7，随后表达MyoD和Myf5，最终表达终末分化标志物肌球蛋白重链（MyHC）。

从脐带组织中成功分离uMSCs的关键在于 &gt;95%，远高于全脐带血的低成功率。成功分离出uMSCs后，FACS分析显示所有细胞均为CD34−CD45−CD105+CD90+然而，在比较分析中，从脐带血中分离出的uMSCs表现出异质性群体，其中一部分细胞表达CD34+CD45+CD105+ （约15%）。此外，双阳性CD105+CD90+ 数量较少（约5%）(补充图 S1）。这导致脐带血来源的uMSCs成肌分化水平降低，因为成肌作用的诱导需要CD105和CD90的共同表达。uMSCs还表达所列的标记物 表1. 若脐带血来源的uMSCs存在污染，则也会出现CD34+CD45+ 细胞。这会导致成肌分化铺板时出现错误的细胞计数。一种表明 &gt;90%的细胞同时表达CD105和CD90，表明uMSCs尚未定向分化为任何中胚层谱系，仍保...

我们描述了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞并将其诱导分化为骨骼肌谱系的实验方案。

探索间充质干细胞的治疗潜力取决于其分离的难易程度、分化能力以及……

我们描述了从人脐带组织中分离间充质干细胞的实验方案，以及一种将其高效诱导分化为骨骼肌系细胞的可靠方法。该技术使我们能够分离出具有高活力和耐热性的间充质干细胞，且极少或几乎不含有内皮来源细胞的污染，并可有效诱导这些细胞向肌源性方向分化。脐带的扭转以及黏液状质地使其处理较为困难。我们展示了如何处理脐带，避免刮除华通胶，并从细胞群体中排除内皮细胞。在分娩时收集脐带组织后，将脐带组织从收集管转移至一个10平方厘米的经组织培养处理的培养皿中，并用新鲜的PBS彻底清洗组织。为避免脐带扭转并处理其黏液状表面，用一只手握住一对镊子将组织固定住。使用手术刀沿脐带组织的纵轴垂直切割，得到两个半圆柱形的组织块。此时观察脐动脉和脐静脉。使用手术刀沿单一方向从表面刮除血管，并用 PBS 冲洗脐带组织，以去除与组织相关的所有残留血液。将每半段脐带组织切碎成0.5立方厘米大小的碎片。将碎片以腔面朝下放置于培养皿中，并将培养皿短暂孵育10分钟。孵育结束后，沿含有脐带组织的培养皿侧壁轻轻加入20毫升含MEM Alpha改良培养基。确保外植体未从原有位置移位，并加入过量培养基以补偿组织外植体在孵育过程中吸收的部分。然后将培养皿放入培养箱中培养三天。孵育结束后，向培养物中添加新鲜培养基，并在操作培养皿时确保培养物免受震动及外植体移动的影响。一周后，使用无菌镊子逐个取出组织碎片，并使用适当的生物危害袋将其丢弃。保留原有培养基，并加入10毫升新鲜生长培养基。每四天更换一次培养基，直至单个克隆达到70%融合度。按照文稿中所述方法对细胞进行染色后，通过流式细胞术分析标记的细胞，并确定CD105 CD90阳性以及CD105 CD73阳性细胞的百分比。分别分析 CD105 阳性及 CD34 CD45 阴性细胞。用含 0.01% 胶原蛋白和 20 微克/毫升层粘连蛋白的 PBS 溶液包被组织培养板，在室温下置于摇床上孵育至少 4 小时。孵育结束后，去除胶原溶液，用 PBS 洗涤培养板，然后在生长培养基中以每平方厘米 10,000 个细胞的密度接种 uMSCs。当细胞达到70%融合度时，吸除生长培养基，并用PBS冲洗培养板两次。为确定成肌过程的动力学，每隔一天向培养物中加入M1培养基，并分别在第2天、第4至5天、第6至7天以及第10至14天检测uMSCs中pax7、MyoD、myogenin和肌球蛋白重链的表达情况。uMSCs表达CD105和CD90，不表达造血细胞标志物CD34和CD45。uMSCs 还表达 uMSCs 标记物 CD73，呈阳性，表明 uMSCs 表达多种关键标记物。在添加 M1 后的前两天内，uMSCs 显示出 Pax7 的表达，随后在添加 M1 后的前四天内出现 MyoD 的表达。细胞在分化第六天表达肌生成素蛋白，随后在诱导分化第 10 天至第 14 天之间表达肌球蛋白重链。与未分化的脐带间充质干细胞（uMSCs）相比，在成肌分化诱导后，有970个基因表达上调。与脐带血来源的uMSCs相比，脐带组织来源的uMSCs中上调的成肌相关基因更多。脐带组织和脐带血来源的uMSCs均显示与细胞骨架蛋白相关的基因表达上调，这些基因涉及肌动蛋白结合和肌节组装、与收缩功能相关的转运蛋白、肌肉质量维持、钙信号传导以及酶功能。在无菌条件下采集组织并维持无菌培养。脐带应用70%乙醇进行表面擦拭，并尽快处理。许多再生疗法需要来自早期传代的大数量细胞。它还可作为模型来模拟整个干燥环境，并反映出生后的代谢过程。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从人脐带组织中生成间充质干细胞及其分化为骨骼肌谱系

本方案描述了在不使用动物血清的情况下，分离并随后扩增间充质基质细胞和内皮集落形成细胞，以生成用于实验性移植的自体配对细胞。...

人脐带来源的间充质基质细胞（MSCs）和内皮集落形成祖细胞（ECFCs）的分离及无动物血清扩增

根据细胞贴壁速度从肌肉骨骼软组织中分离成体干细胞。...

从软性肌肉骨骼组织中分离干细胞

人类骨骼肌中的血管含有多种多能前体细胞群体，非常适合用于再生医学应用。该分离方法可同时从血管的三个结构层中分别纯化出三种多能前体细胞群体：来自内膜的肌源性内皮细胞、来自中膜的周细胞以及来自外膜的外膜细胞。...

从人骨骼肌中分离血管来源的多能前体细胞

本文介绍一种基于表观遗传重编程的实验方案，可将人类胚胎干细胞（hESCs）定向诱导为均一的骨骼肌前体细胞群体；在允许性培养条件下，这些前体细胞可形成具有收缩功能的三维肌纤维簇（肌球体），从而重现人类骨骼肌的生物学特征。...

通过表观遗传重编程由人胚胎干细胞生成肌球体

本文介绍一种从人脐带（UC）和胎儿胎盘样本中分离出脐带内层（CL）、华通胶（WJ）、脐带-胎盘连接处（CPJ）以及胎儿胎盘（FP）的实验方案，用于通过组织块培养法分离和鉴定间充质基质细胞（MSCs）。...

人脐带和胎儿胎盘间充质基质细胞的分离与鉴定

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文提出了一种从脐带血单个核细胞来源的人诱导性多能干细胞进行软骨细胞分化的方法。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞形成软骨细胞样细胞团

人脐带（UC）可在早产、足月及过期分娩的围产期获得。本方案中，我们描述了从妊娠19-40周的胎儿/婴儿脐带中分离和鉴定脐带来源的间充质干细胞（UC-MSCs）的方法。...

早产儿与足月儿来源的人脐带间充质干细胞的分离与鉴定

我们提出了一种实验方案，用于诱导多能干细胞来源的角质形成细胞和成纤维细胞的分化，并利用这些角质形成细胞和成纤维细胞构建三维皮肤类器官。该方案包含建立人源化小鼠模型的额外步骤。本文所介绍的技术将有助于推动皮肤科领域的研究进展。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞生成三维皮肤类器官

本方案描述并比较了两种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为间充质基质细胞（MSCs）的代表性方法。单层培养法具有成本较低、操作简便以及更易实现成骨分化的优点；拟胚体（EBs）法的特点是耗时较短。...

人诱导性多能干细胞向间充质基质细胞分化的两种代表性方法的比较

学习从人脐带组织中分离高活性间充质干细胞并分化为骨骼肌谱系的方法。该技术可有效减少内皮细胞污染，为再生医学研究提供可靠的细胞来源和应用方案。

从人脐带组织中生成间充质干细胞及其向骨骼肌谱系的分化

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