从人脐带组织中生成间充质干细胞及其向骨骼肌谱系的分化

我们描述了从人脐带组织中分离间充质干细胞的实验方案，以及一种将其高效诱导分化为骨骼肌系细胞的可靠方法。该技术使我们能够分离出具有高活力和耐热性的间充质干细胞，且极少或几乎不含有内皮来源细胞的污染，并可有效诱导这些细胞向肌源性方向分化。脐带的扭转以及黏液状质地使其处理较为困难。

我们展示了如何处理脐带，避免刮除华通胶，并从细胞群体中排除内皮细胞。在分娩时收集脐带组织后，将脐带组织从收集管转移至一个10平方厘米的经组织培养处理的培养皿中，并用新鲜的PBS彻底清洗组织。为避免脐带扭转并处理其黏液状表面，用一只手握住一对镊子将组织固定住。

使用手术刀沿脐带组织的纵轴垂直切割，得到两个半圆柱形的组织块。此时观察脐动脉和脐静脉。使用手术刀沿单一方向从表面刮除血管，并用 PBS 冲洗脐带组织，以去除与组织相关的所有残留血液。

将每半段脐带组织切碎成0.5立方厘米大小的碎片。将碎片以腔面朝下放置于培养皿中，并将培养皿短暂孵育10分钟。孵育结束后，沿含有脐带组织的培养皿侧壁轻轻加入20毫升含MEM Alpha改良培养基。

确保外植体未从原有位置移位，并加入过量培养基以补偿组织外植体在孵育过程中吸收的部分。然后将培养皿放入培养箱中培养三天。孵育结束后，向培养物中添加新鲜培养基，并在操作培养皿时确保培养物免受震动及外植体移动的影响。

一周后，使用无菌镊子逐个取出组织碎片，并使用适当的生物危害袋将其丢弃。保留原有培养基，并加入10毫升新鲜生长培养基。每四天更换一次培养基，直至单个克隆达到70%融合度。按照文稿中所述方法对细胞进行染色后，通过流式细胞术分析标记的细胞，并确定CD105 CD90阳性以及CD105 CD73阳性细胞的百分比。

分别分析 CD105 阳性及 CD34 CD45 阴性细胞。用含 0.01% 胶原蛋白和 20 微克/毫升层粘连蛋白的 PBS 溶液包被组织培养板，在室温下置于摇床上孵育至少 4 小时。孵育结束后，去除胶原溶液，用 PBS 洗涤培养板，然后在生长培养基中以每平方厘米 10,000 个细胞的密度接种 uMSCs。

当细胞达到70%融合度时，吸除生长培养基，并用PBS冲洗培养板两次。为确定成肌过程的动力学，每隔一天向培养物中加入M1培养基，并分别在第2天、第4至5天、第6至7天以及第10至14天检测uMSCs中pax7、MyoD、myogenin和肌球蛋白重链的表达情况。uMSCs表达CD105和CD90，不表达造血细胞标志物CD34和CD45。

uMSCs 还表达 uMSCs 标记物 CD73，呈阳性，表明 uMSCs 表达多种关键标记物。在添加 M1 后的前两天内，uMSCs 显示出 Pax7 的表达，随后在添加 M1 后的前四天内出现 MyoD 的表达。细胞在分化第六天表达肌生成素蛋白，随后在诱导分化第 10 天至第 14 天之间表达肌球蛋白重链。

与未分化的脐带间充质干细胞（uMSCs）相比，在成肌分化诱导后，有970个基因表达上调。与脐带血来源的uMSCs相比，脐带组织来源的uMSCs中上调的成肌相关基因更多。脐带组织和脐带血来源的uMSCs均显示与细胞骨架蛋白相关的基因表达上调，这些基因涉及肌动蛋白结合和肌节组装、与收缩功能相关的转运蛋白、肌肉质量维持、钙信号传导以及酶功能。

在无菌条件下采集组织并维持无菌培养。脐带应用70%乙醇进行表面擦拭，并尽快处理。许多再生疗法需要来自早期传代的大数量细胞。

它还可作为模型来模拟整个干燥环境，并反映出生后的代谢过程。