从人脐带组织中生成间充质干细胞及其分化为骨骼肌谱系

我们描述了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞并将其分化为骨骼肌谱系的方案。

我们描述了从人类脐带组织中分离间充质干细胞的方案，以及将它们分化为骨骼肌谱系的可靠方法。该技术使我们能够分离具有高活力和热量的间充质干细胞，内皮来源的细胞几乎没有污染，并在这些疾病中有效地诱导肌源分化。脐带扭转和粘液样稠度使脐带难以处理。

我们展示了如何处理脐带，不刮掉沃顿果冻，并将内皮细胞排除在人群中。在交货时收集脐带组织后，将脐带组织块从收集管转移到10平方厘米的组织培养处理皿中，并用新鲜的PBS彻底清洗组织。为了护理脐带扭转和粘液表面，用一只手拿着一对镊子固定组织。

使用手术刀，沿着其纵向通道垂直切开脐带组织，以获得两个半圆柱形的碎片。此时，观察脐动脉和静脉。使用手术刀，从表面向一个方向刮掉血管，然后冲洗PBS中的脐带组织，以除去与组织相关的所有残留血液。

将每半部分脐带组织切成 0.5 立方厘米大小的碎片。将碎片使腔面朝下放在培养皿上，并将培养皿短暂孵育10分钟。在孵育结束时，沿着含有脐带组织的培养皿的侧面轻轻地加入20毫升含有MEM Alpha修饰的培养基。

确保外植体不会从其方向上移出，并添加多余的培养基以考虑组织外植体在孵育过程中将吸收的一部分。然后将培养皿放入培养箱中三天。孵育结束后，将新鲜培养基加入培养物中，并确保培养物在处理菜肴时免受冲击和外植体移动。

一周后，使用无菌镊子单独取出组织碎片，并使用适当的生物危害袋将其丢弃以进行处理。保留现有培养基，加入10毫升新鲜生长培养基。每四天更换一次生长培养基，直到单个菌落达到70%的汇合度，按照手稿所述对细胞进行染色后，通过流式细胞术分析标记的细胞，并确定CD105 CD90阳性细胞和CD105 CD73阳性细胞的百分比。

分别分析CD105阳性和CD34 CD45阴性细胞。在PBS中用0.01%胶原蛋白和20微克每毫升层粘连蛋白涂覆组织培养板，并将其置于摇臂上室温下至少四小时。孵育后，除去胶原蛋白并用PBS洗涤板，然后在生长培养基中以每平方厘米密度10， 000个细胞接种uMSCs。

一旦细胞达到70%汇合度，吸取生长培养基，并用PBS冲洗培养板两次。为了确定肌源性进展的动力学，每隔一天向培养物中加入M1培养基，并分别在两天，四至五天，六至七天和十至十四天分析uMSCs的pax7，MyoD，肌源蛋白和肌球蛋白重链的表达。uMSCs显示CD105和CD90的表达，并且不表达造血标志物CD34和CD45。

uMSCs对uMSCs标记CD73的表达也呈阳性，表明uMSCs表达多个关键标记。uMSCs在添加M1的前两天内显示出pax7的表达，然后在M1添加的前四天内显示出MyoD表达。细胞在分化6天时表达肌原蛋白，随后在10天至14天之间表达肌球蛋白重链诱导分化。

与未分化的uMSCs相比，970个基因响应于肌源分化的诱导而上调。与脐带血衍生的uMSCs相比，脐带组织衍生的uMSCs中有更多的肌源性基因上调。脐带组织和脐带血均显示与细胞骨架蛋白相关的基因上调，与肌动蛋白结合和肌瘤组装相关，转运蛋白与收缩功能，肌肉质量维持，钙信号传导和酶功能相关。

在无菌条件下收集组织并保持无菌培养。脐带应用70%乙醇从外部扫描并尽快处理。许多再生疗法需要来自早期传代的大量细胞。

它也可以用作模拟整个干燥环境并反映产后代谢的模型。