通过剪切力进行的集成力谱学

本方案提供了一种高通量技术，用于研究DNA与配体之间的分子间结合。该技术在大规模生物分子结构研究中已展现出高通量优势。其通过将单个分子的机械化学性质转化为分子集合体的性质来实现这一目标。

我认为这是一个非常重要的进步性实验，但其中存在几个关键步骤。例如，显微镜、匀浆器和反应管的对齐。为了准确追踪荧光变化，这三个部件必须完美对齐。

首先在安装台上组装匀浆器和显微镜。佩戴护目镜后，打开荧光显微镜，然后调节匀浆器，确保激发光束穿过匀浆器分散尖端的中心。接着准备一个高度为5厘米、横截面为1.5厘米×1.5厘米的平底反应室，并确保所选的反应室材料不产生荧光，以降低背景信号。

随后，将反应室固定在荧光显微镜的样品台上，并调整反应室位置以固定匀浆器的分散尖端，确保尖端略高于反应室底部表面。接着，共同调节匀浆器与反应室的垂直位置，使显微镜的焦点对准分散尖端的表面。然后调节分散尖端的水平位置，确保检测区域位于转子与定子之间。

根据实验中使用的荧光染料，开启相应的荧光通道。在进行高速剪切实验之前，先使用去离子水以低剪切速度测试剪切效果。首先，按照论文所述方法，在去离子水中制备一段人端粒i-凸起DNA，该DNA两端分别标记有荧光染料和淬灭剂。

接下来，将DNA用pH 5.5或pH 7.4的30毫摩尔MES缓冲液稀释至5微摩尔。向DNA溶液中加入配体L2H24OTD，浓度范围为0至60微摩尔，轻轻混匀，避光孵育10分钟，以折叠形成i-motif结构。使用荧光显微镜检测并尽量降低充满去离子水的反应室的背景荧光强度，检测时避免剪切。

然后使用软件设置CCD相机的参数，曝光时间为0.5秒，CCD灵敏度为1 600，记录时间为20分钟。使用长移液器将DNA溶液加入空的且洁净的反应室中，并用黑色盒子覆盖反应室。随后启动均质机，在9 724每秒至97 245每秒范围内的选定剪切速率下进行剪切20分钟，同时打开CCD相机以记录数据。

实验结束后，取下反应室并用去离子水清洗。准备 i-motif DNA 和去离子水。随后，将 10 µM 的 i-motif DNA 与 300 µL 含 150 µM 氯化铜和 300 µM 抗坏血酸的 30 mM Tris 缓冲液混合，孵育 10 分钟，以折叠形成 i-motif 结构。

接下来，使用超滤装置在14,300 × g的离心力下对溶液进行超滤。每次过滤后，用含有300 µM抗坏血酸的30 mM Tris缓冲液将溶液体积补充至约500 µL。收集残留溶液后，加入含有300 µM抗坏血酸的30 mM Tris缓冲液，并加入20 µM CalFluor 488 Azide、20 µM HPG和10 µM TBTA，调节终体积为300 µL。添加试剂后，将溶液转移至暗室中。

然后，在剪切实验开始前，使用显微镜检查并尽量降低充满去离子水的反应室的背景荧光强度。接下来，用长移液管将DNA溶液加入空的反应室中，然后开启CCD相机，以每秒63、209的剪切速率启动均质器剪切，持续20分钟。实验结束后，取下反应室，并用去离子水清洗。

在pH值为5.5的MES缓冲液中，i-motif DNA的荧光强度随着剪切速率从每秒9,724增加到每秒97,245而增强。然而，当相同的i-motif DNA在MES缓冲液中以每秒63,209的速率进行剪切时，荧光强度并未增强，因为在pH 7.4条件下该DNA无法折叠形成i-motif结构。进一步评估了在剪切流动条件下DNA i-motif分子与配体的结合情况，结果显示，随着配体浓度的增加，荧光强度的增幅变得不再明显。

测定了配体与i-motif相互作用的解离常数，结果为34微摩尔。铜离子螯合的i-motif在63,209每秒的剪切速率下解折叠，释放出的铜离子触发了荧光点击反应，导致荧光强度随时间增加。首先，确保检测区域设置在转子与定子之间。

其次，检查并尽量降低荧光背景。最后，在进行点击反应之前，务必对反应体系进行过滤。该方法为探索各类聚合物的机械强度、折叠与去折叠过程提供了重要途径。

可能是其他DNA结构、蛋白质或其他聚合物，以及它们与其他类型分子的相互作用。正如所述，还可利用此方法研究多种其他大分子。