Name: 高分辨率测量的气味驱动在果蝇幼虫的行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-03T21:20:00.000+00:00
Duration: 29 min 23 s
Description: 学习构建稳定可控的气味梯度方法，用于果蝇幼虫趋化性研究。该技术可实时追踪幼虫行为，筛选嗅觉缺陷，为神经科学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 T. Huber 和 T.P. Sakmar 的有益讨论。本工作获得了美国国立卫生研究院对 L.B.V. 的资助，以及比利时-美国教育基金会和雷夫森基金会对 M.L. 的资助。

1. 仪器与试剂
气味稀释：
<ul>
<li>石蜡油（Sigma，CAS号：8012-95-1）</li>
<li>尽可能高纯度的、可引诱黑腹果蝇幼虫的气味物质1。本视频文章中，使用乙酸异戊酯（Sigma，CAS号：123-92-2）对动物进行测试。</li>
<li>1.5 ml 带聚四氟乙烯盖的玻璃小瓶（Agilent Technologies）</li>
<li>数字电子天平，用于按重量精确配制稀释液</li>
</ul>
检测区域设置：
<ul>
<li>琼脂糖（Promega）</li>
<li>96孔微孔板盖（BD Falcon，目录号：353071）。我们的行为实验区域由三个堆叠的盖子组成。</li>
<li>单通道1-20 μl移液器或多通道移液器，用于将气味液滴加样至堆叠盖子的顶部盖子中。在建立多源检测实验时，我们使用Rainin公司的5-50 μl Pipet-Lite多通道移液器。</li>
</ul>
行为实验用果蝇幼虫的制备：
<ul>
<li>15% (w/w) 蔗糖溶液</li>
<li>普通培养皿（BD Falcon），用于清洗和储存幼虫</li>
<li>毛刷（4-5 mm 刷毛长度），用于操作和转移幼虫</li>
</ul>
幼虫运动的记录：
<ul>
<li>带有扁平头部的小型针，用于将幼虫转移至实验区域</li>
<li>镊子或画笔，用于记录后移除幼虫</li>
<li>配备均匀且不产热光源的照明平台，由Logan Electric公司生产的“Slim Edge”照明板</li>
<li>用于包围行为实验区域并控制光照条件的遮光柜</li>
<li>用于记录动物运动的视频追踪系统。我们使用的是Noldus（荷兰）公司的Ethovision软件</li>
<li>CCD摄像机及与Ethovision软件配套购买的帧捕获视频卡（EureCard Piccolo Basic）</li>
<li>温度计和湿度记录仪，用于监测行为测试期间的大气环境条件（可选）</li>
<li>Matlab（The Mathworks）用于自定义数据分析（可选）</li>
</ul>
2. 行为实验装置
行为实验装置由三个堆叠的96孔板盖组成。底部的孔板盖用于将系统其余部分与光源垫隔离，并减少实验区域内的对流。第二个孔板盖上覆盖有25 ml的3%琼脂糖凝胶，作为幼虫爬行的平台。顶部的孔板盖则用于承载气味液滴，这些液滴依靠表面张力保持悬浮状态。
将气味液滴直接用移液器加入96孔板盖的孔中。可使用单一或多种气味源，以生成具有明确且可验证分布特征的浓度梯度2。为检测幼虫的嗅觉缺失和趋化缺陷，我们建议采用以下两种检测方法。
2.1. 单一气味源实验：在孔#E7中放置一个单一气味液滴（标准96孔板参考系统）。
<ul>
<li>刺激物：10μl 溶于石蜡油中的气味物质</li>
<li>初始条件：将一条幼虫置于气味源下方（或其附近区域）</li>
<li>基本观察现象：对于具有吸引力的刺激物（例如乙酸异戊酯），野生型幼虫会聚集在气味源下方；而无嗅觉能力的个体或嗅觉功能受损的个体则会迅速离开液滴区域</li>
<li>单次实验持续时间：3 分钟。记录特定个体的运动轨迹，直至实验时间结束，或该个体一旦接触培养皿壁即终止记录</li>
<li>行为量化可能采用的指标：个体在以气味源为中心的小型圆形区域中停留的时间百分比；与气味源的平均距离；与气味源距离随时间的变化过程等</li>
</ul>
该检测方法可有效检测突变型幼虫的基本嗅觉缺失。也可用于可靠地确定特定气味的检测阈值2。
2.2. 多气味源实验
在顶盖的孔中放置多个气味液滴。在本视频文章中，我们在中央行E建立浓度梯度。总共在孔#E2、#E4、#E6、#E8、#E10和#E12中加入六个液滴（采用标准96孔板编号系统）。与培养皿和单一气味源实验相比，多气味源实验能够对在实验区域长度和宽度方向上形成的梯度几何形状进行定性控制。该实验方法已被用于表征果蝇幼虫趋化性2的感知机制。
<ul>
<li>刺激：将10μl气味液滴沿一行交替地置于各孔中。这种排列方式会在选定的行中心形成一个浓度梯度。为了在实验区域宽度方向上建立均匀的梯度，可使用多个气味源加载若干行。</li>
<li>初始条件：将单个幼虫放置于#E3和#E4孔之间的气味源下方。</li>
<li>基本表型：嗅觉缺失的幼虫从起点开始随机游走。对于具有吸引力的刺激物（例如乙酸异戊酯），具备嗅觉能力的个体将沿气味浓度升高的方向移动。动物沿气味轨迹上行的准确性与其感知和处理气味刺激的能力相关。迂回曲折的运动路径通常由感觉缺陷引起。当动物到达试验中最高浓度位置后，会停留在该区域附近。</li>
<li>单次试验持续时间：最长3分钟（更长的追踪时间容易引入噪声，因为幼虫会逐渐失去兴趣并最终离开梯度区域）。对于本视频文章中所示的梯度，对单个幼虫的运动记录持续至其到达最高浓度源附近（#E12孔）为止。一旦动物进入目标区域或接触实验区域的任一壁面，即停止记录。</li>
<li>行为量化可能采用的指标：动物停留在气味源直线区域下方的时间百分比（蓝色矩形区域）；相对于局部气味梯度方向的平均行进方向；综合趋化性评分，用于衡量动物沿气味源直线移动的整体趋势2。</li>
</ul>
3. 梯度曲线验证
在对幼虫进行特定梯度测试之前，确定该梯度随时间的稳定性至关重要。基于此，实验人员可确定每次试验的合适持续时间，以及在同一实验区域内可依次追踪的幼虫数量。为检测梯度的稳定性，我们开发了一种基于红外光谱法2的方法。该方法超出本实验方案的范围，此处不再详述。
4. 实验准备方案
4.1. 琼脂糖平板和气味稀释液的制备：
<ol>
<li>1. 将25 ml的3%琼脂糖倒入96孔板盖的平坦顶部；让琼脂糖冷却并凝固（约30分钟）。 重要提示：在倾倒琼脂糖之前，确保96孔板盖放置在平坦的表面上，因为凝固后的琼脂糖凝胶若存在倾斜可能会影响幼虫的行为。倾倒凝胶时，应去除表面形成的任何气泡。 </li>
<li>2. 使用电子天平将气味物质用石蜡油稀释至所需浓度，以准确称量每次稀释中石蜡油和气味物质的用量。</li>
</ol>
注意事项：当使用低气味浓度时，建议基于连续稀释制备一系列原液浓度。例如，从 1.0 M 溶液开始，进行 1:2 稀释得到 0.5 M 溶液。通过反复进行此操作，可获得符合几何级数的稀释系列：1.0 M、0.5 M、0.25 M、0.12 M、0.06 M、0.03 M、0.015 M。
重要提示：由于许多有机气味物质会与塑料发生反应，气味稀释液必须储存在带有聚四氟乙烯（Teflon）盖的玻璃小瓶中。理想情况下，应在每次实验前新鲜配制气味溶液，以减少不同实验间实际气味浓度的波动。使用高挥发性化学品时尤其如此。
4.2. 幼虫制备：
<ol>
<li>1. 用蒸馏水配制15%蔗糖溶液。 注意事项：15%蔗糖溶液的密度高于幼虫，可使幼虫浮至溶液表面。然而，未溶解的果蝇食物碎块密度大于该溶液，会迅速沉入底部。因此，使用该蔗糖溶液可有效分离幼虫与食物。蔗糖溶液易滋生生物污染物，若溶液变浑浊，可通过滤膜除菌以去除污染。 </li>
<li>获取装有6日龄幼虫或目标发育阶段幼虫的试管。 注意事项：我们所有的实验均使用6日龄幼虫（三龄发育阶段中期）；此发育阶段的幼虫体型足够大，便于我们的追踪软件检测，同时活动性较强。 </li>
<li>将蔗糖溶液倒入含有幼虫的食物试管中。</li>
<li>使用刮铲轻轻捣碎并溶解果蝇食物，以释放幼虫。释放出的幼虫将上浮至表面。</li>
<li>静置数分钟，待果蝇食物碎块沉入试管底部；随后将蔗糖溶液和幼虫倒入培养皿中。若需预先筛选幼虫，可通过滤膜过滤收集幼虫。然后可用毛笔将幼虫转移至培养皿中进行挑选。</li>
<li>在进行行为学测试前，将幼虫置于蔗糖溶液中约30分钟，使其适应溶液环境。由于幼虫似乎不摄食蔗糖，将处于饥饿状态，从而提高趋化行为表现。</li>
<li>行为学实验结束后，可将培养皿盖内盛水（或蔗糖溶液），作为废弃实验动物的暂存容器。</li>
</ol>
5. 行为记录实验方案
5.1. 实验区域设置：
<ol>
<li>1. 将气味液滴施加到新的96孔板盖的底面（带孔面）。 重要提示： 为避免不同气味及气味浓度之间的交叉污染，每次加样均须使用新的盖子。实验结束后，所有含有气味源的盖子均不重复使用。根据所使用的气味浓度范围，在封闭系统中，气味梯度仅能稳定维持10至20分钟。因此，必须尽量缩短梯度建立与行为实验正式开始之间的时间间隔。 </li>
<li>将盖子翻转，并叠放在另一个已涂布3%琼脂糖层的盖子上方。 重要提示： 翻转盖子时应小心操作，防止气味液滴扩散至相邻孔中。 </li>
<li>当顶部盖子翻转接触琼脂糖表面后，使气味扩散30秒，再引入幼虫。</li>
</ol>
5.2. 加载幼虫：
<ol>
<li>将含有气味液滴的顶盖轻轻抬起至足以放入幼虫的高度。</li>
<li>将幼虫从蔗糖溶液转移至琼脂糖层。动物的起始位置取决于所使用的检测方法： 在单气味源检测中，幼虫被释放于气味液滴正下方。 在多气味源检测中，幼虫被释放于孔位 #E3 与 #E4 之间。 重要提示：新引入的动物应保持一致的朝向。我们将动物朝向梯度方向放置，确保其身体和头部朝向最高浓度区域。若动物以与浓度梯度相反的方向引入，则会启动搜寻行为。我们认为，这一初始搜寻阶段会带来不必要的噪声。控制头部朝向可减少在探索行为期间接触实验区域侧壁的幼虫数量。该操作不会预先决定动物的运动方向，也不会显著增加无嗅觉能力的动物偶然沿气味线进行趋化运动的几率（即嗅觉测试中的假阳性结果）。 </li>
<li>重新盖上顶盖，并立即开始记录。 备注：健康的幼虫在进入实验区域后会立即开始爬行，通常在前10秒内可移动约1 cm。若实验人员启动记录较慢，则会丢失初始数据点。因此，建议实验人员在开展实验前熟练掌握用于启动记录的软件操作命令。 </li>
<li>让幼虫在记录期间自由活动（通常为3分钟）。 备注：若幼虫在3分钟结束前撞击实验区域侧壁或到达目标区域（如在梯度检测中），则提前终止记录。 </li>
<li>记录结束后，立即抬起顶盖，用镊子或画笔移除幼虫。将已追踪的动物置于含有水（或蔗糖溶液）的培养皿盖中。 重要提示：已记录的幼虫不得重复使用。盛水的培养皿盖仅用于在实验过程中方便地区分已记录与未记录的幼虫。 </li>
<li>若在同一实验装置中连续追踪多个幼虫，应立即加载下一只幼虫并按上述方法开始记录。 重要提示：在同一实验装置中进行的试验次数应基于浓度梯度的稳定性来确定，且应在开展任何行为实验前验证梯度的稳定性2。 </li>
<li>当所有计划在该实验装置中检测的幼虫均完成追踪并移出实验区域后，丢弃顶盖和琼脂糖层。中间盖板（即琼脂糖盖板）可重复使用。 备注：建议使用 Ethovision 的用户选择“背景减除”检测方法。</li>
</ol>
6. 视频文章中展示的示例实验
6.1. 使用 1.0 M 乙酸异戊酯进行单一气味源实验。
我们对十只 Or83b-/- 突变体和十只野生型（W1118）幼虫进行了盲法测试，每只幼虫均被分配了一个编号。进行轨迹记录的实验人员未获得任何关于每只动物基因型的信息。每次记录后，根据测试结果为每只幼虫指定一个预测表型：若在整个实验过程中观察到个体在气味源下方聚集，则归类为“嗅觉正常者”；若其运动轨迹迅速离开气味源周围区域，则归类为“无嗅觉反应者”。在记录完20只幼虫的行为后，将轨迹按表型进行分组，并将该分组结果与幼虫的实际基因型进行比对，发现所有表型指派均完全正确。
6.2. 利用乙酸异戊酯的指数梯度和线性梯度进行多气味源实验。
在本实验中，我们比较了野生型幼虫在直线梯度和指数梯度中趋化行为的表现。两种梯度均使用相同的最高浓度（0.5 M）建立，记录其趋化行为。如文章所述，指数梯度的气味源浓度范围为 0.015 至 0.5 M，而直线梯度的气味源浓度范围为 0.25 至 0.5 M（公差为 0.05 M 的等差数列）。
线性梯度代表了一种更具挑战性的趋化环境，因为其局部浓度差异恒定且相对较小，浓度范围较窄（0.25 M）。相比之下，指数梯度的浓度范围更大，且沿着路径的局部浓度差异逐渐增加。
每种梯度几何形状下记录了15条幼虫的运动轨迹，并将路径叠加在同一张图中。对两张图的直观观察显示，野生型幼虫能够稳定地沿梯度向上移动，但在线性梯度条件下蜿蜒程度更大。这表明，相比于线性形状，指数形状的梯度信号在沿梯度长度方向上能被更可靠地检测到。
6.3. 采用“屋顶”几何结构的乙酸异戊酯浓度梯度多气味源实验。
在此，我们验证了幼虫在气味梯度中对局部气味浓度变化敏感，而不仅仅是对气味的有无作出反应。通过施加以下浓度的气味液滴建立异戊醇梯度：0.06、0.12、0.25、0.5、0.25、0.12 M。所形成的梯度几何形状类似于一个在0.5 M处达到峰值的非对称“屋顶”。
幼虫被释放于0.06 M与0.12 M气味液滴之间。我们假设，若幼虫仅通过检测气味的存在来进行行为决策，则它们会沿着整个浓度梯度移动，而不会特别趋向于最高浓度区域。相反，若幼虫对局部浓度变化敏感，则它们会聚集在0.5 M液滴下方。实验记录了15只幼虫，发现经过短暂的探索期后，所有幼虫均聚集于较高浓度液滴下方。这表明果蝇幼虫能够计算局部气味浓度的变化，并据此调控其趋化行为。

<ol><li>Fishilevich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+behavior+mediated+by+single+larval+olfactory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila.</a> Curr Biol. 15, 2086-2096 (2005).</li>
<li>Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+olfactory+sensory+input+enhances+chemotaxis+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience+advance+online+publication%22%5BJournal%5D)">Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior.</a> Nature Neuroscience advance online publication. , (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

高分辨率测量果蝇幼虫的嗅觉驱动行为

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

果蝇幼虫的嗅觉反应传统上是在培养皿中进行研究，其中仅包含一个位于边缘的气味源。在这种行为范式中，实验者通常假设气味分子从源头快速扩散，进而在培养皿内形成稳定的浓度梯度。为了建立感觉输入与行为反应之间的定量关联，有必要对气味刺激条件进行更精确的表征。在本视频文章中，我们描述了一种新方法，可构建具有稳定且可控几何形态的气味梯度。我们简要展示了如何利用这些梯度筛选嗅觉缺陷（完全与部分失嗅），并研究趋化行为中更为细微的特征。

关键词：果蝇幼虫，嗅觉反应，气味梯度，趋化行为，失嗅，感觉输入，行为范式

在本视频文章中，我们介绍了一种构建具有稳定且可控几何形状的气味梯度的新方法。我们简要说明了如何利用这些梯度来筛查嗅觉缺陷（完全性与部分性嗅觉丧失），并研究趋化行为中更为细微的特征。

在传统的实验中，果蝇幼虫的嗅觉反应通常在培养皿中进行研究，其中仅包含一个位于边缘的气味源。在此行为学……

您好，我叫 Matt Lui，是洛克菲勒大学 Leslie Sal 实验室的一名博士后研究员。今天，我想向您介绍我们为研究幼虫趋化性所进行的实验。我们感兴趣的问题相当简单，实际上在此装置中已有所体现。我刚刚将一组果蝇幼虫转移到了琼脂表面。这种环境相当恶劣，动物们几乎处于饥饿状态。这些动物需要设法找到最近的食物来源，而这里有一些散发气味的香蕉，能够吸引幼虫。然而，这种环境并不适合研究趋化行为，因此第一个改进措施是用一种化学物质替代香蕉。这种化学物质是异戊酸酯，是香蕉中主要的香味成分之一。因此，我们使用这种人工香料可以更精确地控制嗅觉刺激。下一个改进是采用封闭环境，并以某种方式尽量防止气味分布的波动。这是我们实验室长期使用的检测方法。这是一个底部铺有琼脂表面的培养皿。琼脂非常适合幼虫进行趋化性实验，因为它能保持幼虫的湿润。在培养皿的两侧，各有一个由聚四氟乙烯（Teflon）制成的盖子。接下来，我们将在一侧加入乙酸异戊酯，另一侧则不添加任何物质。操作完成后，将培养皿盖上，静置一段时间，使气味分子扩散均匀，随后打开培养皿。在此处引入实验动物，让其自由活动一段时间。该实验基于以下假设：通过在培养皿的一侧引入趋化物，可在培养皿内快速建立一个相对稳定的浓度梯度，并在整个测试期间保持稳定。目前主要的问题在于，尚无人曾证实该浓度梯度确实在培养皿中形成。实际情况可能是，在加入趋化物后很快，趋化物在培养皿内即达到均匀分布，导致浓度梯度非常平缓；也有可能需要数分钟时间才能建立起有效的浓度梯度。这当然主要取决于所用气味剂的蒸气压。第二个问题与实验过程中所测量的内容有关。假设一个动物从此处（X位置）出发，三分钟后到达末端位置（红色X处）。此时有两种可能的方法。一种可行的方法是在一定时间后（例如三到五分钟）仅记录动物的最终位置。这样，您所获取的信息将仅包括起始位置和最终位置。而我们认为，有必要对动物随时间变化的行为进行高分辨率的记录。例如，动物可能从起始位置到最终位置几乎未移动，如图中所示；或者，它也可能在实验的大部分时间内频繁访问特奥多尔（theodor）周围的区域，然后在实验结束前返回原处。从这两种情况中得出的结论将截然不同。在一种情况下，动物可能并未对刺激产生反应，而在另一种情况下则明确产生了反应。我们试图实现的两项改进首先是控制实验区域内其他梯度的形状和稳定性。其次，实时追踪动物的行为，并保存所有这些信息。在接下来的视频中，Sylvia 将向您展示我们如何制备系列稀释液。我的名字是 S ti。我是VAs实验室的研究助理，负责材料lui的相关工作。今天我将向您展示如何为用于追踪动物的腔室系统准备材料。我们腔室系统的主要问题是使用了分散在空气中的气味物质。这意味着，例如，如果我们使用的琼脂平板不平整，实验之间可能会出现波动和浓度差异，从而给系统带来噪声。因此，我将向您展示一些小技巧，帮助尽量减少系统中的噪声。准备气味稀释液所需的材料包括一个玻璃瓶，如果使用的气味物质对光敏感，建议使用深色玻璃瓶，并准备一份您感兴趣气味物质的等分试样。用于制备此份样品的玻璃移液管以及合适的机械移液器辅助装置。然后是石蜡油移液管吸头、标准移液器操作员、用于稀释的小瓶。同样，这些器具需为玻璃材质，并最好为避光设计，此外还需要一台称重天平，以实现精确测量并减少实验间的干扰。由于气味物质具有高度挥发性，且其中一些具有毒性，因此操作需在通风橱内进行。修复气味稀释液的第一步是分装待稀释的气味物质。为了制备准确的稀释液并尽量减少实验间的差异，必须对所有物质进行称量。首先进行标记，准备配制1摩尔浓度的丁酸乙酯。第一步是准备石蜡油。石蜡油非常黏稠，因此需尽量减少移液器吸头浸入石蜡油的深度，仅需浸入足够吸取石蜡油且不产生气泡即可。然后最好将瓶子侧面多余的石蜡油擦拭干净。由于石蜡油具有黏性，再次强调，必须缓慢将其加入小瓶中。一旦将石蜡油用移液器加入瓶中后，不要立即丢弃吸头，因为吸头底部还会积聚更多液体。开始稀释前，最好先准备一张计算表，提前测量并记录好将要加入的石蜡油体积及其质量，同时对气味物质也进行相同的体积和质量测量。这样，你可以在天平上核对所需的所有石蜡油和气味物质是否已准确称量。如有必要，可继续添加石蜡油并重新称量，直至达到所需质量。一旦确定了正确的石蜡油重量，接下来只需按照相同的原则添加气味物质即可。现在，我将演示如何准备用于追踪的幼虫。我们通常使用六日龄的幼虫。这是因为幼虫在此时体型足够大，便于软件识别，同时仍具有较高的活动性。要判断幼虫是否因过龄而不适合用于追踪实验，只需观察是否有幼虫开始沿培养瓶壁爬升。若发现有幼虫爬壁，则表明其已过龄，活动性将显著下降。准备幼虫的第一步是将其浸入15%蔗糖溶液中。我们使用15%蔗糖的原因是幼虫会漂浮在该溶液中，而食物则会部分溶解于溶液中或沉到底部。加入的蔗糖溶液量应约为离瓶子或小瓶顶部略小于一英寸的距离。然后取一把刮铲。此时你已经可以看到幼虫浮了起来，轻轻插入培养基中，将埋在里面的幼虫挖出。轻轻搅动几下，使幼虫与培养基充分分离，随后静置几分钟。待培养基与幼虫充分分开后，取一个预先标记好的培养皿，将上清液倒入培养皿的边缘部分。保留培养皿的上盖，因为您将在此中加水，并用作已追踪幼虫的容器，以便区分哪些幼虫已追踪、哪些尚未追踪。现在您已将幼虫倒入培养皿中，需等待30分钟，使其适应蔗糖环境并达到饥饿状态。这意味着在幼虫适应的这30分钟内，它们在追踪装置中的行为会更加理想。此时可以开始准备用于追踪的培养板。这些是96孔板的盖子，可以单独购买。这是已经加热过的3%琼脂糖溶液。我们使用3%的琼脂，因为它可以防止幼虫钻入，同时又具有足够的密度，使其能够在培养基表面行走，并保持每个培养皿顶部的湿度。你需要用移液器加入25 mL的琼脂。注意尽量避免在凝胶中产生大气泡。将培养皿放置在平坦的表面上也非常重要，否则可能会形成倾斜的琼脂糖凝胶，从而影响幼虫的行为。琼脂糖凝胶凝固后，我们将培养皿叠放，并用保鲜膜包裹，以防止其干燥。这样可使培养皿保持良好状态，适用于连续数天的追踪观察。在本段视频中，我将向您介绍我们的行为学检测方法，该方法与我之前提到的培养皿检测法略有不同。您需要准备96孔板的盖子，以及含有琼脂层的盖子。该检测由三个堆叠在一起的盖子组成。第一个边缘为空，不包含任何物质，仅用于将系统与所放置的表面隔离开来。第二层包含 Diego agro 表面。在此，动物将被放置于该表面上，接下来我将向您展示如何将 theodor 引入培养板中。每次装载 theodor 时，务必使用一个全新且未使用过的盖子。这是为了防止不同实验之间的任何污染。您还需要进行其他稀释操作。我们通常不使用染料来加载theodor，但为了便于说明，这里我将使用染料。这是高浓度的theodor，而这个则是高度稀释的。我的目标是在一条线上建立一个浓度梯度。说出这句话时，我们希望浓度从左到右逐渐增加。为实现这一点，我将在冷凝环中按顺序放置若干滴液体，使其浓度逐步升高。我首先从最高浓度开始，将其置于最末端。必须将其均匀分散在环形区域中。现在我进行下一个浓度的操作，该浓度相比第一个稀释了两倍，并将其加入此环形区域中。所以这里没有，我共有六个液滴。第一个的浓度设为1，第二个的浓度为0.5，是第一个浓度的一半；第三个的浓度为0.25，依此类推。因此，我们在该直线上形成了一个几何级数。下一步是将盖子倒置在AAL表面，此时由于表面张力的作用，所有液滴均悬挂在盖子的内侧。我们设计了一种基于红外光谱的技术，用于测量板中所有组分的浓度。通过应用该技术，我们能够证明，如果在此处的除臭剂线沿长度方向形成一个几何级数，则沿板的长度方向和宽度方向，气味物质的浓度均呈指数级增加，如图所示。在气味物质线正下方，浓度分布呈现峰值。以下是该浓度梯度实际几何形状的示意图。如果考虑空气中气味分子的浓度，好消息是，我们能够证明该浓度梯度的几何形态至少在15分钟内保持稳定。在盖上顶部盖子后，我们等待30秒，以使浓度梯度充分建立，随后将动物放入实验区域。将动物从第三和第四位置之间的另一端线处引入，我们使用一根小针将幼虫从蔗糖溶液转移到琼脂表面。转移时，用针尖钩住幼虫头部周围将其捞起。迅速打开盖子，将幼虫放置在琼脂表面。然后关闭盖子。重要的是尽量缩短盖子打开的时间。接下来，记录动物的运动三到五分钟。开始进行实际记录。在此追踪设置中，我们使用一台连接到计算机的摄像头。所采用的图像追踪软件是Nordis公司的Aton Vision，用于采集动物运动的相关信息，并将其存储为数字文件。现在我们即将开始行为学实验。我们已准备好带有aro层的盖子，以及各梯度稀释液。Diego 在第一个盖子上卡住了。在加载 theodor 之前，对每个小瓶进行涡旋振荡非常重要。我们使用的稀释液从左到右依次为最低浓度到最高浓度。所有六个液滴将同时加样到平板上。为避免气味挥发，此处使用多通道移液器六通道吸头，从每个稀释样品中吸取10微升气味物质，并同时完成加样。加样后，将盖子倒置在琼脂表面。正如我之前向您展示的那样，过去30秒内，板上已形成浓度梯度。现在我将把一只动物引入迪亚戈表面。一旦动物被引入，我便开始记录。动物已在此处，其运动正在被追踪。如您所见，动物正沿着气味线行进，并朝向浓度梯度最高的位置移动。请记住，浓度从左到右呈指数形式递增。如您所见，运动方向在不断得到校正。相对于刺激物，该动物现已到达浓度梯度的最高浓度点，我们将其从培养皿中移出。随后将该动物丢弃至另一个培养皿中，以确保不会连续两次重复追踪同一个体。在引入新的幼虫并开始新的记录后，我们遵循以下规则进行追踪。一旦动物到达培养板上浓度最高的行（即此处所示的这一行），我们立即停止追踪。此外，如果动物触碰到容器壁，追踪也会中断，以避免任何干扰。我们首先解决的问题相当简单。我们想要了解的是，动物是否能在特定浓度下闻到某种气味。为了进行此类测试，我们通常采用单一气味源，而不是多个气味源。这使得您可以在改变泰多尔末端液滴浓度时拥有一种自由度。例如，此处为高浓度液滴，而此处为低浓度液滴。我们通常的做法是将动物放置在琼脂表面，正对泰多尔液滴的下方，观察该动物是否能够感知其存在并停留在其附近区域。现在，我想更深入地利用我们的检测方法。假设你有一个有序的液滴，并在此记录了多条轨迹，这些轨迹在此处叠加显示，共有三条。其中一条绿色轨迹由一个个体产生。您看到的这条橙色轨迹偏离中心较多，而这条粉色轨迹则代表动物明显围绕声源做环形运动。我们认为，关于轨迹的细节蕴含着大量信息。因此，我们将轨迹作为一系列位置数据导入 MATLAB，并在 MATLAB 中进行后续分析。此处为到源的距离，可能是时间的函数。对于之前显示的三条轨迹，您可以看到绿色轨迹，其始终保持在源附近；您还可以看到橙色轨迹，其表现出明显的噪声。然后可以看到这条紫色轨迹，有趣的是，该动物离开源头并保持一定距离，这可能对应于一个最适浓度。这里展示了10条无法感知气味的动物的运动轨迹示意图，这些是嗅觉缺陷的突变体，即三B突变体（three B mutants），属于非嗅觉感知个体。如您所见，所有这些轨迹表明，动物未能检测到气味源，直接离开了。与此形成鲜明对比的是，我们在此记录了白化动物连续的10条轨迹。这些动物当然具有嗅觉能力，如您所见，它们全部聚集在除臭剂源的正下方。上述20条轨迹实际上是在不知道动物身份的情况下采集的。这证明了我们检测方法的高效性和可靠性。为了确定某些突变体是否能够在此利用指数梯度感知气味，我们会生成多条运动轨迹，并希望了解这些动物追踪远端刺激物的能力如何。现在我将向您展示15条独立记录的运动轨迹，如您所见，动物在另一端线下的刺激引导下表现出色。接下来我们进行一个简单的对照实验。动物在指数梯度中沿直线运动，可能并非因为浓度变化，而是无论刺激浓度如何，只要存在刺激，动物就会沿直线前进。因此，为了证明它们实际上是在计算浓度或与浓度相关的参数，并利用该信息来引导其运动方向，我们设计了这种接近人字形屋顶结构的实验装置。幼虫像往常一样从此处引入，我们预期它们会沿线移动，经过某一点后检测到浓度下降，并返回该位置。本实验共对五只动物进行了测试。我们收集了运动轨迹，现在将它们叠加呈现在本幻灯片上。如您所见，动物从此处出发，沿直线移动，随后探索对应于最高浓度的区域，并主要停留在该区域。这强烈表明，它们能够利用单源检测法实时计算其他浓度。我们主要提出了一个关键问题：动物能否利用多源装置感知特定浓度的气味？这使我们在改变浓度梯度的形态方面具有更大的灵活性，并能够确定动物是否能够利用此类信息。我想通过一个简单的实验来说明这一概念。到目前为止，我们建立的浓度梯度在透镜上呈现指数型分布。现在的问题是，如果我们让浓度在透镜上以线性方式递增，从而对细胞施加更大的挑战，它们是否仍然能够找到并迁移至另一端的引导线？该图展示了两种类型的梯度。我们测试了紫色的指数梯度和绿色的线性梯度。这是线性梯度，我将写出通过稀释石蜡油得到的乙酸异戊酯的不同浓度。这是一个等差数列。我们建立了一个线性梯度，如您所见，其斜率与这里的指数梯度相比相当平缓，指数梯度的两端浓度同样为 0.5，但上升至 0.03。问题是，当 navi 面对如此平缓的梯度时，是否仍能进行趋化性响应？此处显示了在指数梯度和线性梯度中用于六个液滴的实际乙酸盐浓度。如图所示，尽管两种情况下最高浓度相同，但在线性梯度中，此处的最低浓度相对较高。我们使用线性梯度进行了实验，图中展示了野生型动物的15条运动轨迹，我们认为很明显这些动物能够检测到线性梯度并沿着去味剂的路径追随该信号。因此，我认为我们的观点已经很明确。在结束之前，我想简要谈一谈该追踪系统的未来发展方向。尽管该追踪系统能够实现许多有趣的应用，例如在较长时间内观察幼虫在较大空间范围内的复杂行为，但它仍存在一些局限性。例如，您受限于培养皿的尺寸，这限制了观察的时间长度以及可研究的复杂行为。因此，如果我们能够开发出一种系统，使得培养皿更大，或者完全不受培养皿边界的限制，将会非常理想。另一个问题是，目前我们所使用的软件难以同时追踪多只动物，因此无法实时观察群体行为。通过当前的实验装置，我们无法检测行为的另一个有趣方面，即幼虫在空间中的真实三维运动。在追踪动物行为时，您会发现，例如当它们接触到气味液滴时，可能会抬起头部，或摆动头部以探测浓度变化。目前我们的特定装置可能尚无法实现这一点，因此若能开发出支持此类观测的系统将非常有意义。

high-resolution-measurement-odor-driven-behavior-drosophila

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高分辨率测量的气味驱动在果蝇幼虫的行为

我们介绍一种已建立的技术，用于测量和分析活体黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila 嗅觉中枢对气味刺激反应的钙成像

果蝇具有复杂的嗅觉系统，能够区分数百种气味分子，并利用嗅觉来指导其行为决策。本视频介绍了四通道嗅觉仪检测法，这是一种研究果蝇嗅觉行为反应的方法。视频重点展示了如何处理待测果蝇，以及在实施检测过程中的关键步骤。...

四通道嗅觉仪检测：一种评估气味线索诱导反应的方法 果蝇

在本视频中，将一只活体 Drosophila...

电生理记录 黑腹果蝇 挥发性气味物质刺激下的感器反应

在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila...

一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

Drosophila的前足和喙部含有丰富的味觉感觉神经元。本文介绍一种利用钙成像技术检测活体果蝇前足和喙部感觉神经元在施加外源性味觉信息素后生理反应的方法。...

测量生理反应 果蝇 利用活体钙成像技术研究感觉神经元对脂质信息素的响应

自动化追踪系统Flywalk用于对黑腹果蝇（Drosophila...

使用 Flywalk 范式对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的嗅觉引导行为进行高分辨率定量分析

本文介绍了一种用于检测多达100只醋蝇（Drosophila...

通过计算机追踪检测的嗅觉行为 果蝇 四象限嗅觉仪中

本实验方案的总体目标是演示如何向对长链表皮信息素产生反应的Drosophila嗅觉受体神经元进行单感器记录时，递送低挥发性气味物质。...

电生理记录自 果蝇 对低挥发性气味物质产生反应的毛形感器

本方案分析导航行为 黑腹果蝇 幼虫在嗅觉神经元同时接受光遗传学刺激时的行为反应。使用波长为630...

追踪 果蝇 幼虫对嗅觉神经元光遗传学刺激的行为反应

本实验方案演示了从三龄幼虫阶段的果蝇幼虫中分离成虫盘的解剖技术。在解剖后，直接在显微镜载玻片上对组织进行固定，并展示去除翅、腿和眼成虫盘的方法，以便后续观察。...

解剖3龄黑腹果蝇幼虫的成虫盘

学习构建稳定可控的气味梯度方法，用于果蝇幼虫趋化性研究。该技术可实时追踪幼虫行为，筛选嗅觉缺陷，为神经科学研究提供可靠工具。

高分辨率测量果蝇幼虫的嗅觉驱动行为

探索更多视频