高分辨率测量果蝇幼虫的嗅觉驱动行为

大家好，我是 Matt Lui。我在洛克菲勒大学 Leslie Sal 的实验室担任博士后研究员。今天，我想向大家介绍我们为研究幼虫趋化性所进行的实验。

我们感兴趣的问题相当简单，实际上在此装置中已有所体现。我刚刚将一组果蝇幼虫转移到了琼脂表面。

这种环境相当恶劣，动物们几乎处于饥饿状态。这些动物需要设法找到最近的食物来源，而这里有一些散发气味的香蕉，能够吸引幼虫。然而，这种环境并不适合研究趋化行为，因此第一个改进措施是用一种化学物质替代香蕉。

这种化学物质是异戊酸酯，是香蕉中占主导地位的香味成分之一。因此，我们使用这种人工香精，可以更精确地控制嗅觉刺激。下一个改进是采用封闭环境，并尽量防止气味分布的波动。

这是我们实验室长期使用的检测方法。这是一个底部铺有琼脂表面的培养皿。琼脂非常适合幼虫进行趋化性实验，因为它能保持幼虫的湿润。

在培养皿的两侧，各有一个由聚四氟乙烯（Teflon）制成的盖子。接下来，我们将在其中一侧加入乙酸异戊酯，另一侧则不添加任何物质。操作完成后，将培养皿盖上，静置一段时间，使气味分子充分扩散，随后打开培养皿。在此处引入实验动物，让其自由活动一段时间。

该实验基于以下假设：通过在培养皿的一侧加入趋化物，可在培养皿内快速形成浓度梯度，并在测试期间保持稳定。然而主要问题在于，迄今为止尚无人证实该浓度梯度确实在培养皿中存在。实际情况可能是，在加入趋化物后很快，趋化物在培养皿内即达到均匀分布，导致浓度梯度非常平缓；也有可能需要数分钟时间才能建立起有效的浓度梯度。

这当然主要取决于所用气味剂的蒸气压。第二个问题与实验过程中所测量的内容有关。假设一个动物从这里出发，即X位置，三分钟后到达末端位置，即红色X处。此时存在两种可能的方法。

一种可行的方法是仅记录动物在特定时间段（如三或五分钟）后的最终位置。这样，您所获取的信息将仅限于起始位置和最终位置。而我们认为，随时间推移对动物行为进行高分辨率的记录非常重要。例如，动物可能几乎从未从起始位置移动到最终位置，如图中所示；也可能在实验的大部分时间内频繁访问了围绕 theodor 的区域，然后在实验结束前返回原位。

从这两种情况中得出的结论将截然不同。在一种情况下，动物可能并未对刺激产生反应，而在另一种情况下则明确产生了反应。我们试图实现的两个改进，首先是控制实验区域内其他梯度的形状和稳定性。

其次，实时追踪动物的行为，并保存所有这些信息。在接下来的环节中，Sylvia 将向您展示我们如何制备系列稀释液。我的名字是 S ti。

我是VAs实验室的研究助理，负责材料lui的相关工作。今天我将向您展示如何为用于追踪动物的腔室系统准备材料。我们腔室系统的主要问题是使用了分散在空气中的气味物质。

这意味着，例如，如果我们使用的培养板不平整，实验之间可能会出现波动和浓度差异，从而给系统带来噪声。因此，我将向您展示一些小技巧，帮助您尽量减少系统中的噪声。准备气味稀释液所需的材料包括一个玻璃瓶，如果使用的气味物质对光敏感，建议使用棕色玻璃瓶，并准备您感兴趣气味物质的适量分装样品。

用于制备此分装液的玻璃移液管及合适的机械移液器辅助工具。然后是石蜡油移液管吸头、标准移液管架以及用于稀释的小瓶。这些器具同样需要为玻璃材质，最好为避光材质，另需配备一台称量天平，以实现精确测量并减少实验间的干扰。

由于气味物质具有高度挥发性，且其中一些具有毒性，因此操作需在通风橱内进行。修复气味稀释液的第一步是分装待稀释的气味物质。为了制备准确的稀释液并尽量减少实验间的差异，必须对所有物质进行称量。

首先进行标记，将配制浓度为1摩尔的丁酸乙酯。第一步是准备石蜡油。石蜡油非常黏稠，因此需尽量减少移液器吸头浸入石蜡油的深度，仅需浸入足够吸取石蜡油且不产生气泡即可。

然后最好将瓶子侧面多余的石蜡油擦拭干净。由于石蜡油具有黏性，再次强调，必须缓慢将其加入小瓶中。一旦将石蜡油移液至瓶中后，请勿立即丢弃吸头，因为吸头底部还会积聚更多液体。

开始稀释前，最好先准备一张计算表，提前量好将要加入的石蜡油体积及其质量，同时对气味物质也进行相同的体积和质量测量。这样你就可以在天平上核对所需全部石蜡油和气味物质的质量。如有必要，可继续添加石蜡油并重新称量，直至达到准确质量。

一旦确定了正确的石蜡油重量，接下来只需按照相同的原则添加气味剂即可。现在，我将演示如何准备用于追踪的幼虫。

我们通常使用六日龄的幼虫。这是因为幼虫在此时已足够大，便于软件轻松识别，同时仍具有较高的活动性。要判断幼虫是否因过老而不适合用于追踪，只需观察是否有幼虫开始沿培养皿壁向上爬行。若出现爬壁现象，则表明幼虫已过老，其活动能力将显著下降。

准备幼虫的第一步是将其浸入15%蔗糖溶液中。我们使用15%蔗糖的原因是幼虫会漂浮在该溶液中，而食物则会部分溶解于其中或沉到底部。加入的蔗糖溶液量应足够多，大约距离瓶子或小瓶顶部略小于一英寸处为宜。

然后取一把刮铲。此时你已经可以看到幼虫浮了起来，轻轻插入培养基中，将藏在培养基内的个体挖出，轻轻搅动以使幼虫与培养基充分分离，随后静置几分钟。待培养基与幼虫充分分开后，取一个预先标记好的培养皿，将上清液倒入培养皿的边缘部分。

保留培养皿的上盖，因为您将在此盖中加入水，用作已追踪幼虫的容器，以便区分哪些幼虫已追踪、哪些尚未追踪。现在您已将幼虫倒入培养皿中，需等待30分钟，使其适应蔗糖环境并达到饥饿状态。这意味着在幼虫适应的这30分钟内，它们在追踪装置中的行为表现会更好。

此时可以开始准备用于追踪的培养板。这些是96孔板的盖子，可以单独购买。这是一份已经加热过的3%琼脂糖溶液。

我们使用3%的琼脂，因为它可以防止幼虫钻入，同时又具有足够的密度，使幼虫能够在上面行走，并保持每个培养皿顶部的湿润环境。你需要用移液器加入25 mL的琼脂。重要的是要尽量避免在凝胶中产生大气泡。

将培养皿放置在平坦的表面上也非常重要，否则可能会形成倾斜的琼脂糖凝胶，从而影响幼虫的行为。琼脂糖凝胶凝固后，我们将培养皿叠放，并用保鲜膜包裹，以防止其干燥。这样可使培养皿保持良好状态，适用于连续数天的追踪观察。

在本视频中，我将向您介绍我们的行为学检测方法，该方法与我之前提到的培养皿检测法略有不同。您需要准备96孔板的盖子，以及含有琼脂层的盖子。该检测由三个堆叠在一起的盖子组成。

第一个边缘不含任何物质，为空，仅用于将系统与所放置的表面隔离开来。第二层含有Diego agro表面。在此，动物将被放置于该表面上，接下来我将向您展示如何将theodor引入到培养板中。

每次装载 theodor 时，务必使用新鲜且全新的盖子。这是为了防止不同实验之间的任何污染。您还需要进行其他稀释操作。

我们通常不使用染料来加载theodor，但为了便于说明，这里我将使用染料。这是高浓度的theodor，而这个则是高度稀释的，我的目标是在一条线上形成浓度梯度。

说出这句话时，我们希望浓度从左到右逐渐增加。为实现这一效果，我将在冷凝环中按顺序放置若干滴浓度递增的溶液。我首先从最高浓度开始，将其置于最末端。

必须将其均匀分散在环内。现在我进行下一个浓度的操作，该浓度相比第一个稀释了两倍，并将其加入此环中。所以这里没有，我共有六个液滴。

第一个的浓度设为1，第二个的浓度为0.5，是第一个浓度的一半；第三个的浓度为0.25，以此类推。

因此，我们在该直线上形成了一个几何级数。下一步是将盖子倒置在AAL表面，此时由于表面张力的作用，所有液滴均悬挂在盖子的内侧。我们设计了一种基于红外光谱的技术，用于测量板中所有组分的浓度。

通过应用该技术，我们能够证明，如果在此处的除臭剂线沿几何级数分布，则在板的长度方向上，气味剂的浓度会呈指数级增加，如图所示，同时在板的宽度方向上也呈现相应分布。在气味剂线正下方，我们观察到一个浓度峰值的分布曲线。以下是该浓度梯度实际几何形态的示意图。

如果考虑空气中theodor的浓度，好消息是，我们能够证明其梯度几何结构至少在15分钟内保持稳定。在盖上顶部盖子后，我们等待30秒，以使浓度梯度充分建立，随后将动物放入实验区域。

将动物从第三和第四位置之间的另一端线引入，我们使用一根小针将幼虫从蔗糖溶液转移到琼脂表面。转移时，用针尖钩住幼虫头部周围将其捞起。迅速打开盖子，将幼虫放置在琼脂表面。

然后关闭盖子。尽量缩短盖子打开的时间非常重要。接下来，记录动物的运动三到五分钟。

开始进行实际记录。通过此跟踪装置，我们使用一台与计算机相连的摄像头。所采用的图像跟踪软件为Nordis公司开发的Aton Vision，用于采集动物运动的相关信息，并将其存储为数字文件。

现在我们即将开始行为学实验。我们已准备好带有aro层的盖子，以及各梯度稀释液。

Diego 被第一个盖子卡住了。在加入 theodor 之前，对每个小瓶进行涡旋振荡非常重要。我们使用的稀释液从左到右依次为浓度最低到最高。

所有六个液滴将同时加样到平板上。为避免气味挥发，此处使用多通道移液器六通道吸头，从每个稀释样品中吸取10微升气味物质，并同时完成加样。加样后，将盖子倒置在琼脂表面。

正如我之前向您展示的那样，过去30秒内，平板上已形成浓度梯度。现在我将把一只动物引入迪亚戈表面。一旦动物被引入，我便开始记录。

动物已在此处，其运动正在被追踪。如您所见，动物正沿着气味线行进，并朝向浓度梯度最高的位置移动。请记住，浓度从左到右呈指数形式递增。

如您所见，运动方向在不断得到校正。相对于刺激物，该动物现已到达浓度梯度的最高浓度点，我们将其从培养皿中移除。随后将其丢弃至另一个培养皿中，以确保不会连续两次重复追踪同一个体。

在引入新的幼虫并开始新的记录后，我们遵循以下追踪规则：一旦幼虫到达培养板上浓度最高的那一行（即此处所示的这一行）即停止追踪。此外，若幼虫触碰到培养板壁，则追踪将被中断，以避免任何干扰。

我们首先解决的问题相当基础：我们想要了解动物是否能在特定浓度下嗅到某种气味。为了进行此类测试，我们通常采用单一气味源，而不是多个气味源。

这使得您可以在改变泰多尔末端液滴浓度时拥有一种自由度。例如，此处为高浓度液滴，而此处为低浓度液滴。我们通常的做法是将动物放置在琼脂表面，正对泰多尔液滴的下方，观察该动物是否能够感知其存在并停留在其附近区域。

现在，我想对我们的检测方法进行更深入的应用。假设你有一个有序的液滴，并在此记录了多条轨迹，这些轨迹在此处叠加显示，共有三条。其中，有一条绿色轨迹是由一个个体生成的。

您看到的这条橙色轨迹偏向外围，而这条粉红色轨迹则代表动物明显围绕源点做环形运动。我们认为，关于轨迹的细节中蕴含着大量信息。因此，我们将轨迹作为一系列位置数据导入 MATLAB，并在 MATLAB 中进行后续分析。

此处的距离是到源点的距离，可能是时间的函数。对于之前显示的三条轨迹，您可以看到绿色轨迹，它始终非常接近源点；您还可以看到橙色轨迹，其表现出明显更多的噪声。

然后可以看到这条紫色轨迹，有趣的是，该动物离开源头并保持一定距离，这可能对应于一个最适浓度。这里展示了10条无法感知气味的动物的运动轨迹示意图，这些是突变体，即三B突变体，属于非嗅觉型。

如您所见，所有这些轨迹表明，动物未能检测到气味源，直接离开了。与此形成鲜明对比的是，我们在此记录了白化动物连续的10条轨迹。这些动物当然具有嗅觉能力，如您所见，它们全部聚集在除臭剂源的正下方。

这20条轨迹实际上是在未知动物身份的情况下获得的。这证明了我们检测方法的高效性和可靠性。为了确定某些突变体是否能够在此利用指数梯度感知气味，我们会生成多条运动轨迹，并希望了解这些动物追踪另一端刺激物的能力如何。

现在，我将向您展示15条分别记录的运动轨迹。如您所见，动物在另一端线下的刺激引导下表现出色，能够很好地跟随刺激移动。接下来，我们希望进行一个简单的对照实验。很可能动物在指数梯度中沿直线移动，是因为存在某种刺激，而与刺激浓度无关，即动物只是简单地沿直线前进。

因此，为了证明它们实际上是在计算浓度或与浓度相关的某种信息，并利用该信息来引导其运动，我们设计了这种接近人字形屋顶结构的实验装置。幼虫像往常一样从此处引入，我们预期它们会沿线移动，经过某一点后检测到浓度下降，并返回该位置。本实验共对五只动物进行了测试。

我们收集了运动轨迹，现在将它们叠加呈现在本幻灯片上。如您所见，动物从此处出发，沿直线移动，随后探索对应于最高浓度的区域，并主要停留在该区域。这强烈表明，它们能够利用单源检测法实时计算其他浓度。

我们主要提出了一个关键问题：动物能否利用多源装置感知特定浓度的气味？这使我们在改变浓度梯度的形态方面具有更大的灵活性，并能进一步确定动物是否能够利用此类信息。

我想通过一个简单的实验来说明这一概念。到目前为止，我们建立的浓度梯度在透镜上呈现指数形状。现在的问题是，如果我们让浓度在透镜上以线性方式增加，从而对细胞施加更大的挑战，它们是否仍然能够找到并迁移到另一端的终点线？

该图展示了两种类型的梯度。我们测试了紫色的指数梯度和绿色的线性梯度。这是线性梯度，我将写出通过稀释石蜡油得到的乙酸异戊酯的不同浓度。

这是一个等差数列。我们建立了一个线性梯度，如您所见，其斜率与这里的指数梯度相比相当平缓，指数梯度的两端浓度同样为0.5，但上升至0.03。问题是，当面对如此平缓的梯度时，细胞能否对化学趋向性刺激产生响应？

此处显示了在指数梯度和线性梯度中用于六个液滴的实际乙酸盐浓度。如图所示，尽管两种情况下最高浓度相同，但在线性梯度中，此处的最低浓度相对较高。我们使用线性梯度进行实验，图中展示了野生型动物的15条运动轨迹，我们认为很明显这些动物能够检测到线性梯度，并沿着去味剂的线条追随该信号。

因此，我认为我们的观点已经很明确。在结束之前，我想简要谈谈该追踪系统的未来发展方向。尽管该追踪系统能够实现许多有趣的实验应用，例如在较长时间内观察幼虫的复杂行为，但它仍存在一些局限性。

例如，您受限于培养皿的尺寸，这限制了观察的时间长度以及可研究的复杂行为。因此，如果我们能够开发出一种系统，使得培养皿更大，或者完全不受培养皿边界的限制，将会非常理想。另一个问题是，目前我们所使用的软件难以同时追踪多只动物，因此无法实时观察群体行为。

通过当前的实验装置，我们无法检测行为的另一个有趣方面，即幼虫在空间中的真实三维运动。在追踪动物行为时，您会发现，例如当它们接触到气味液滴时，可能会抬起头部，或摆动头部以探测浓度变化。目前我们的特定装置可能尚无法实现这一点，因此若能开发出支持此类观测的系统将非常有意义。