Name: הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: למד את פרוטוקול SCoPE2 לפרוטאומיקה חד-תאית בתאי יונקים באמצעות ספקטרומטריית מסה ותיוג איזוברי. שיטה זו מאפשרת כימות אלפי חלבונים מבודדים ללא נוגדנים וחושפת הטרוגניות פרוטאומית מוסתרת באנליזות גוש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לפרס תוכנית NSF I-Corps לסתיו 2021 (אתר אוניברסיטת נורת'איסטרן) שמימן פרסום זה.

<ol><li>Symmons, O., Raj, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27259209/">What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism.</a> Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).</li>
<li>Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33351222/">Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics.</a> The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).</li>
<li>Levy, E., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30072488/">Single cell protein analysis for systems biology.</a> Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).</li>
<li>Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+analyses+of+cancer+cells%3A+toward+elucidating+the+molecular+mechanisms+of+clonal+evolution+and+drug+resistance+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition.</a> Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22(2021).</li>
<li>Shaffer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+cell+variability+and+drug-induced+reprogramming+as+a+mode+of+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance.</a> Nature. 555 (7695), 274(2018).</li>
<li>Pan, D., Jia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single-cell+multi-omics+in+dissecting+cancer+cell+plasticity+and+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024(2021).</li>
<li>Segerstolpe, Å, et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27667667/">Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).</li>
<li>Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+single-cell+analysis+provides+new+insights+into+heterogeneity+and+plasticity+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).</li>
<li>Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+single+cell+rna+sequencing+into+the+immunology+of+type+1+diabetes-+cell+phenotypes+and+antigen+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity.</a> Frontiers in Immunology. 12, 751701(2021).</li>
<li>Baron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+map+of+the+human+and+mouse+pancreas+reveals+inter-+and+intra-cell+population+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure.</a> Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).</li>
<li>Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28481885/">Post-transcriptional regulation across human tissues.</a> PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535(2017).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpicking+the+proteome+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unpicking the proteome in single cells.</a> Science. 367 (6477), 512-513 (2020).</li>
<li>Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29945450/">Transformative opportunities for single-cell proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34986167/">Learning from natural variation across the proteomes of single cells.</a> PLoS Biology. , (2021).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+single+cell+proteomics+forward+with+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Driving single cell proteomics forward with innovation.</a> Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).</li>
<li>Specht, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+and+transcriptomic+analysis+of+macrophage+heterogeneity+using+SCoPE2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2.</a> Genome Biology. 22 (1), 50(2021).</li>
<li>Petelski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-cell+proteomics+using+SCoPE2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8683604/">Scaling up single-cell proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179(2022).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+single-cell+proteomics+workflow+identifies%3E+1000+protein+groups+per+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell.</a> Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).</li>
<li>Lombard-Banek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+subcellular+mass+spectrometry+enables+proteo-metabolomic+single-cell+systems+biology+in+a+chordate+embryo+developing+to+a+normally+behaving+tadpole+%28X.+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis).</a> Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).</li>
<li>Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+accuracy+and+depth+of+protein+quantification+in+experiments+using+isobaric+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biology. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1">Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics.</a> BioRxiv. , at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1.abstract (2018).</li>
<li>Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+resolving+proteomes+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Towards resolving proteomes in single cells.</a> Nature Methods. 18 (8), 856(2021).</li>
<li>Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-MS%3A+Data-driven+optimization+of+mass+spectrometry+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods.</a> Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).</li>
<li>Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DART-ID+increases+single-cell+proteome+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">DART-ID increases single-cell proteome coverage.</a> PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082(2019).</li>
<li>Cheung, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+carrier+proteome+limit+for+single-cell+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics.</a> Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v4.article-info">Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v1.abstract (2021).</li>
<li>Vanderaa, C., Gatto, L. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14789450.2021.1988571">Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

אחד המפתחות להכנה מוצלחת וניתוח של תאים בודדים על ידי SCoPE2 הוא הכנת המוביל וערוצי ההתייחסות. גודל הנשא המוצע הוא 100 עד 200 תאים; עם זאת, ניתן לקבוע את מספר התאים הדרושים לניסוי חד-תאי מסוים על סמך עקרונות כפי שנדונו במקום אחר21. עבור הגודל המוצע, יש צורך בלפחות ~11,275 תאים לכל צלחת של 384 בארות, מה שמאפשר הפניה של 200 תאים ו-5 תאים בכל קבוצה. זה יכול להיות יתרון לבודד יותר תאים אם אוכלוסיות התאים הרצויות אינן גורם מגביל, פשוט יש חומר נוסף במקרה של טעויות (כפי שנעשה בפרוטוקול זה, בידוד 22,000 תאים במקום 11,275 תאים). יש להכין את כמות הנשא וההתייחסות הדרושה למספר הצלחות הרצויות באצווה אחת כדי למזער כל וריאציה בין אצווה לאצווה שיכולה לגרום לזיהוי פפטידים או לכימות להיות שונים בין אצוות.
לפני בידוד תאים בודדים לתוך בארות של צלחת 384 באר, חשוב לשקול את העיצוב של פריסת צלחת. בתוך כל צלחת 384-well, מומלץ ליישם הן בקרות חיוביות ושליליות. בקרות שליליות הן בארות שבהן לא מוסיפים תאים אלא עוברים את אותן תוספות והליכים מגיבים כמו בארות חד-תאיות. בקרות חיוביות הן בארות שבהן מוסיפים תאים מדוללים ל-2-5 תאים/μL במקום תאים בודדים. זה חשוב במיוחד ליישום כאשר שיטות בידוד של תאים בודדים אינן מאומתות היטב. כל צלחת של 384 בארות צריכה באופן אידיאלי לכלול התפלגות אקראית של תאים בודדים ופקדים (למשל, לא לכלול פקדים שליליים או חיוביים בשורה אחת בלבד). לכל צלחת צריכה להיות חלוקה שווה של כל אוכלוסיות התאים המעניינות, במקום לבודד סוג תא אחד בצלחת אחת וסוג תא שני בצלחת שנייה. זה ימנע קשירת אפקטים אצווה עם סוגי תאים של עניין. בנוסף, אם יש צורך ביותר מצלחת אחת של 384 בארות לניתוח, מומלץ לבודד תאים בפגישה אחת, ולא לפזר את שלב הבידוד על פני מספר ימים, במידת האפשר.
ליזיס של תאים בודדים ושל נשא/ייחוס מתרחש במים באמצעות מחזור חום קפוא23. הצפי הוא שרוב הפרוטאזות עברו דנטורציה במהלך שלב זה. טריפסין מתווסף מיד לאחר שלב הדנטורציה בריכוז גבוה, בסדרי גודל רבים יותר בריכוז אפילו מאשר אפילו הפרוטאזות התאיות הנפוצות ביותר. על ידי פעולה המונית, רוב המוצרים של פעילות פרוטאז יהיה בשל טריפסין.
הפחתה/אלקילציה של שאריות ציסטאין אינה מבוצעת בפרוטוקול זה לפני עיכול טריפסין. פפטידים המכילים ציסטאין מייצגים כ-10% מהפפטידים הטריפטיים מהפרוטאום האנושי. אנו רואים פחות פפטידים המכילים ציסטאין בגישה ללא הפחתה/אלקילציה. בשלבים אלה נעשה שימוש בריאגנטים שאינם תואמים לתיוג על-ידי TMT (כימיה של אסטר NHS) מיד לאחר העיכול.
באסטרטגיית תיוג TMT זו, המוביל וההפניות מסומנים ב- 126 ו- 127N, בהתאמה, בעוד שתאים בודדים ובארות בקרה מסומנים ב- 128C עד 135N. שתי התוויות לאחר ההתייחסות, 127C ו- 128N, אינן משמשות בשל זיהום צולב איזוטופי הנובע מהמוביל ותעלות הייחוס, שברור שהן הרבה יותר נפוצות בחומר פפטידי מאשר התאים הבודדים. בסך הכל, ישנם 12 ערוצי TMT לכל קבוצה שניתן להשתמש בהם לתיוג תאים בודדים או בארות בקרה עם TMTpro-16plex, או 14 ערוצי TMT לכל קבוצה עם TMTpro-18plex.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול לביצוע מדידות פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות פרוטוקול זה כוללים הכנת הנשא, בידוד של תא בודד, תזה, עיכול, תיוג ברקוד ופרמטרים מתאימים של ספקטרומטריית מסות. צעדים אלה פורטו במסמך זה ופורטו בהרחבה במקומות אחרים 17,21,25. לכל שלב יש עלילה מתאימה או קבוצה של מגרשים ב- DO-MS המאפשרים בקרת איכות קלה. לדוגמה, במקרה של יצירה מוצלחת של המוביל, חלקות המתארות את מספר הפפטידים שזוהו, יעילות הסימון ואחוז שיעור הטעות מאפשרים אימות של הכנתו המוצלחת. דוחות DO-MS מייצגים כלולים בפרסום זה וניתן לראותם http://scope2.slavovlab.net/ לנתונים המקוריים16. דוחות DO-MS אלה מאפשרים להעריך אופטימיזציה של השיטה בכיוונים שטרם נחקרו על ידי המחברים, כגון מעברי צבע ארוכים יותר של LC, אנזימי עיכול שונים או ברקודים כימיים חלופיים.
נכון לעכשיו, הניתוח הסדרתי של פפטידים על ידי אלגוריתמי רכישה תלויי נתונים מגביל את מספר הפפטידים שניתן לנתח בריצת LC באורך סביר. זאת, בין היתר, בשל זמני המילוי הארוכים יותר הנדרשים לרכישה מוצלחת של מספיק יונים לכימות אמין של תאים בודדים21. מגבלה מובנית לשימוש בנשא היא היעדר הערכה ישירה של יעילות העיכול והתיוג של התאים הבודדים. נכון לעכשיו, אחד הפתרונות למגבלה זו הוא ביצוע בקרת איכות על דגימה גדולה יותר המעובדת לצד התאים הבודדים.
הצענו מספר הזדמנויות לשיפור פרוטאומיקה חד-תאית, כגון בניית ספקטרומטרים של מסה באמצעות אנלייזרים מרובים. השיטה הנוכחית מאפשרת כימות של אלפי חלבונים מתאי יונקים בודדים במהירות של כ-100 תאים ביום עם ריאגנטים וציוד זמינים מסחרית. SCoPE2, הדור השני של גישת SCoPE-MS, השתפר משמעותית מקודמו ביחס למספר התאים הניתנים לניתוח ליחידת זמן, מספר החלבונים הניתנים לניתוח ליחידת זמן, הזמן הדרוש להכנת הדגימה, נגישות הריאגנטים והציוד, והעלות הכוללת של הכנה וניתוח לתא בודד. חלבונים הקשורים לממברנה נגישים באמצעות תזה של חום קפוא ועיכול פרוטאזות, כפי שמוצג בהשוואה ל- urea lysis23. השיטה מזהה חלבונים רבים מהשליש העליון של הפרוטאום ביחס לשפע16. אם הפרוטאופורם המתוקן נמצא בשליש העליון של הפרוטאום, והפפטיד המתוקן מקובל לניתוח ספקטרומטריית מסות (מיינן היטב, יש לו הבדל מסה מפפטיד ללא שינוי), סביר יותר להניח שהוא יהיה מקובל על פרוטוקול זה. שיטה זו עשויה להיות מיושמת באופן פורה במערכות ביולוגיות שבהן יש הטרוגניות משמעותית בין תאים, כגון בהתמיינות, סנסנציה או תגובות אימונולוגיות (כלומר, פאגוציטוזה).

אנליזה חד-תאית נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור את רמת ההטרוגניות במערכות ביולוגיות שאחרת לא ניתן היה להבחין בה על ידי מדידות בתפזורת 1,2,3. למגוון תאי כזה יכולות להיות השלכות תפקודיות שיכולות לקדם את ההבנה של תהליכים ביולוגיים אינטגרליים, החל מעמידות לטיפול בתאים סרטניים 4,5,6 ועד להטרוגניות בין תאים בסוכרת 7,8,9,10. מחקרים רבים התמקדו במדידת חומצות גרעין בתאים בודדים, על ידי מדידת רמות גנטיות או שעתוק ואפשרו סיווג של סוגי תאים ומצבים. עם זאת, התקדמות כזו במרחב חומצות הגרעין אינה יכולה למלא את פער הידע של ויסות11 שלאחר שעתוק, מה שמניע את הצורך במדידות חלבונים בעלות תפוקה גבוהה דומה בתאים בודדים12,13,14,15.
פיתחנו את SCoPE216,17 כדי לענות על הדרישה לפרוטאומיקה חד-תאית קפדנית וחזקה של מערכות יונקים. זוהי שיטה מרובבת, המאפשרת תפוקה מוגברת על ידי תיוג וניתוח תאים רבים במקביל18, בניגוד ל-mthods נטולי תוויות המנתחים תא אחד בכל פעם19,20. מתודולוגיית הכנת הדגימה, גישת ספקטרומטריית המסות ושלבי ניתוח הנתונים הבאים מאפשרים כימות מדויק של מאות עד אלפי חלבונים לתא בודד. שיטה זו מאפשרת ניתוח ספקטרומטריית מסה של תאים בודדים באמצעות הנשא האיזוברי21, דגימה קטנה בתפזורת של תאים (בדרך כלל 25-200) הדומה ביולוגית לאוכלוסיית התאים הבודדים המעניינת. חומר נשא זה מוכפל בקבוצה עם ערוץ ייחוס של אותו חומר ותאים בודדים באמצעות שימוש בתגי מסה טנדם (תוויות TMT). תעלת הנשא מפחיתה את אובדן הדגימה לאזורי פנים ומספקת את שברי עמוד השדרה של היונים לזיהוי פפטידי מוצלח. ערוץ הייחוס, אשר מוכן בתפזורת ולאחר מכן מדולל עד 5-10 תאים מקבילים עבור כל קבוצה של תא בודד, מסייע לשלוט על השתנות טכנית בניתוח. באופן ספציפי, ההתייחסות מאפשרת נורמליזציה של השתנות הנגרמת על ידי השפעות הקשורות ל- LC-MS/MS, כגון דגימת יונים ויעילות יינון. בדרך כלל, תעלות הייחוס והתעלות המובילות נעשות מאותה אוכלוסיית תאים.
פרוטוקול הכנה לדוגמה זה הוא שיטת דור שני הנשענת על SCoPE-MS22 על ידי שיפורים סינרגטיים מרובים. השיפורים כוללים שיטת תזה תאית המונעת ניקוי דגימה, שהוא שלב נפוץ בתכשירי פרוטאומיקה לטרשת נפוצה. הוא משתמש ב-mPOP (הכנת דגימת פרוטאומית מינימלית)23, שהיא שיטת הקפאה של חום. שיטה זו אפשרה תסיסה של תאים בודדים בנפחים קטנים יותר ובלוחות מרובי תאים במקום בבקבוקונים, מה שאפשר קצב תפוקה ואוטומציה גבוהים יותר על ידי מחזורים תרמיים. בסך הכל, שיטה זו הורידה את העלות לתא בודד והגדילה את הדיוק הכמותי בהשוואה ל- SCoPE-MS 16,24.
פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין תאים בודדים לניתוח פרוטאומי, כולל כיצד להכין את הנשא ואת ערוצי הייחוס באמצעות תוויות איזובריות TMTpro 18-plex. תאים של יונקים שנמצאים בתרחיף חד-תאי ושניתן לבודד אותם לצלחות של 384 בארות הם ככל הנראה מקובלים על פרוטוקול זה. כמו כן נכללות תוצאות מייצגות של ערכות מוצלחות של תאים בודדים, המציגות מספר חלקות בקרת איכות שנוצרו על ידי אפליקציית R Shiny, DO-MS25. כלי תוכנה אחרים שפורסמו26,27 והנחיות ניסיוניות 17,21 שיפרו את אימוץ פרוטוקול זה. אנו מקווים שמדריך חזותי זה יסייע עוד יותר לחוקרים לבצע ניסויים בפרוטאומיקה חד-תאית.

<table><tbody><tr><td>צלחת 384 בארות, צלחת PCR סטנדרטית</td> יש להשתמש בלוחות פוליפרופילן <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1384</td>, <td>במידת הצורך להחליף. אם מוחלף, יש להעריך את רמות הזיהום הפולימרי הפוטנציאלי מצלחות אחרות לפני הכנת SCoPE2.</td></tr><tr><td>אצטוניטריל (להכנת חוצצים), Optima LC-MS/MS grade</td><td>Fisher</td><td>Scientific A955-1</td><td>אצטוניטריל זה משמש לכל חוצץ, כלומר 50% אצטוניטריל המשמש למעבר דרך בארות לאחר שעבר דרך המוביל והתייחסות בעת שילוב ערכות SCoPE2. זהירות: אצטוניטריל הוא נוזל דליק. זה יכול לגרות את העור, העיניים, דרכי הנשימה ומערכת העצבים המרכזית. הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי. ידית מתחת למכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>אצטוניטריל (להכנת TMT), נטול מים, 99.8%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>271004-100 מ"ל</td><td>אצטוניטריל זה משמש להשעיית תוויות TMT בריכוז היצרן. אזהרה: אצטוניטריל הוא נוזל דליק. זה יכול לגרות את העור, העיניים, דרכי הנשימה ומערכת העצבים המרכזית. הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי. ידית מתחת למכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>רדיד צלחת PCR דביק</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>מכסי בורג בקבוקון Autosampler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C5000-51B</td><td></td></tr><tr><td>ספינר בקבוקון Autosampler (כלומר myFuge 5)</td> <td>MTC Bio</td><td>C2595</td><td>לדגם זה אין בקרת מהירות. הוא פשוט משמש לאיסוף נוזלים בתחתית בקבוקוני הדגימה האוטומטית.</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני בורג זכוכית שקופים, 9 מ"מ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60180-509</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית, פירס, LC-MS/MS כיתה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td>זהירות: חומצה פורמית היא נוזל דליק. זה יכול לגרום לנזק חמור לעיניים או לכוויות בעור. הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי. יש לטפל באזור מאוורר היטב.</td></tr><tr><td>תוספות דגימה אוטומטית מזכוכית, 9 מ"מ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4010-630</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקסילאמין (HA), 50% משקל/נפח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>467804-50 מ"ל</td><td>אזהרה: הידרוקסילאמין עלול לגרום לגירוי בעור. הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי.</td></tr><tr><td>שבבי Mantis microfluidic, שבבי 3PFE בנפח נמוך</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVPR2</td><td>שבבים אלה מיועדים לשימוש עם מטפל הנוזלים Mantis microfluidics להפצת תמיסות אורגניות. ניתן להשתמש בהם כדי לחלק תוויות TMT.</td></tr><tr><td>שבבי מיקרופלואידיקה של גמל שלמה, שבבי סיליקון בנפח נמוך</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVS12</td><td>שבבים אלה מיועדים לשימוש עם מטפל הנוזלים של Mantis microfluidics כדי להוציא תמיסות מימיות. לא ניתן להשתמש בהם כדי לחלק תוויות TMT.</td></tr><tr>ניתן להחליף <td>מטפל נוזלי מיקרופלואידי גמל שלמה</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>מטפל נוזלים. עם זאת, חשוב לבדוק האם המערכת תואמת ל-100% אצטוניטריל (כמו במקרה של תוויות TMT), וכי המערכת אינה מכניסה זיהום פולימרי או סוג אחר של זיהום לדגימות.</td></tr><tr><td>מתאם צלחת PCR של גמל שלמה עם פינים חרוטיים רחבים לטיפול אוטומטי בצלחות</td><td>Formulatrix</td><td>232400</td><td></td></tr><tr><td>MassPREP תערובת פפטידים</td><td>Waters</td><td>186002337</td><td>תערובת של תשעה פפטידים לא טריפטיים</td></tr><tr><td>ספינר צינור PCR (כלומר, מיקרוצנטריפוגה של 16 מקומות לצינורות של 0.2 מ"ל)</td> <td>USA Scientific</td><td>2621-0016</td><td>לדגם זה אין בקרת מהירות. הוא פשוט משמש לאיסוף נוזלים בתחתית הצינורות.</td></tr><tr><td>צינורות PCR: TempAssure 0.2 מ"ל PCR 8 צינורות רצועות</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td>אם מוחלפים, יש להעריך את רמות הזיהום הפולימרי הפוטנציאלי מצלחות אחרות לפני הכנת SCoPE2.</td></tr>מי <tr><td>מלח עם חוצץ פוספט (PBS), פי 10, pH 7.4, ללא RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>ספינר צלחת (כלומר, מיקרוצנטריפוגה של PlateFuge)</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Model C2000</td><td>לדגם זה אין בקרת מהירות. הוא פשוט משמש לאיסוף נוזלים בתחתית הבארות.</td></tr><tr><td>Thermal Cycler (כלומר, C1000 Touch עם מודול 384 בארות)</td> <td>Biorad</td><td>1851138</td><td></td></tr><tr><td>TMTpro 16plex סט ריאגנטים תווית, 1 x 5 מ"ג</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A44520</td><td></td></tr><tr><td>טריאתילאמוניום ביקרבונט (TEAB), 1 M, pH 8.5</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T7408100ML</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין זהב ספקטרומטריית מסה בדרגה</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>זהו טריפסין בעל טוהר גבוה מאוד. ריאגנטים אחרים של טריפסין יכולים להשתנות ברמות הטוהר שלהם. רמת הטוהר חשובה להשגת תוצאות חיוביות של SCoPE2. אזהרה: טריפסין עלול לגרום לגירוי בעור, בדרכי הנשימה ובעיניים. הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי. ידית מתחת למכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>מערבולת (מערבל מערבולת אנלוגי)</td><td>VWR</td><td>דגם 58816-121</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור אמבט מים (כלומר, מנקה קולי 2.8 ליטר עם טיימר דיגיטלי)</td><td>VWR</td><td>97043964</td><td></td></tr><tr><td>מים, Optima LC-MS/MS כיתה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>W6-1</td><td>כל הפתרונות שצריך לדלל או לייצר מומלץ להכין עם מים בדרגת ספקטרומטריית מסה. כל דילול ו/או תערובות מאסטר צריכות להיות טריות. זיהום הנובע ממים בדרגה נמוכה יותר יכול להשפיע לרעה על זיהוי פפטידים ואיכות הנתונים של תא בודד.</td></tr></tbody></table>

הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי

Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier

ניתוח פרוטאומיקה חד-תאית דורש שיטות רגישות, מדויקות מבחינה כמותית, נגישות וחזקות. כדי לעמוד בדרישות אלה, פרוטוקול פרוטאומיקה חד-תאית (SCoPE2) פותח כשיטת דור שני לכימות מאות עד אלפי חלבונים מדגימות מוגבלות, עד לרמה של תא בודד. ניסויים בשיטה זו השיגו כימות של יותר מ-3,000 חלבונים על פני 1,500 תאי יונקים בודדים (500-1,000 חלבונים לתא) ב-10 ימים של זמן ספקטרומטר מסה. SCoPE2 ממנף מחזור הקפאה של חום עבור תזה של תאים, מייתר את הצורך בניקוי של תאים בודדים וכתוצאה מכך מפחית את אובדן הדגימה, תוך זירוז הכנת הדגימה ופישוט האוטומציה שלה. בנוסף, השיטה משתמשת בנשא איזוברי, המסייע בזיהוי חלבונים ומפחית את אובדן הדגימה.
פרוטוקול וידאו זה מספק הנחיות מפורטות כדי לאפשר אימוץ של ניתוח אוטומטי של חלבונים חד-תאיים באמצעות ציוד וריאגנטים בלבד הנגישים באופן נרחב. אנו מדגימים שלבים קריטיים בהליך של הכנת תאים בודדים לאנליזה פרוטאומית, החל מקציר ועד הזרקה ועד לניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית (LC-MS/MS). בנוסף, הצופים מונחים דרך עקרונות התכנון הניסויי עם המוביל האיזוברי, בקרת איכות הן עבור נשא איזוברי והן עבור תכשירים חד-תאיים, ותוצאות מייצגות תוך דיון במגבלות הגישה.

תוצאות חיוביות מהפרוטוקול כרוכות באימות כי מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול בוצעו בהצלחה; אלה כוללים את הכנת הנשא, בידוד תא בודד, תזה, עיכול, תיוג ברקוד, ואופטימיזציה של פרמטרים MS. עלילות DO-MS מאפשרות הערכה קלה של השלמת כל שלב קריטי בפרוטוקול. נשא מוכן בהצלחה, אשר בדרך כלל מתאים 25 ו 200 תאים בכמות (לכל קבוצה), הוא מתעכל היטב מסומן היטב. חלקות מ- DO-MS מאפשרות לכמת את עוצמת המדגם (כדי להעריך את הכמות), את יעילות העיכול (באופן אידיאלי &lt;25% miscleavages) ואת יעילות הסימון (חייב להיות &gt;99%). באופן קריטי ביותר, דגימות נשאיות שאינן מסומנות לחלוטין עשויות לאפשר את התגובה הצולבת עם הברקודים המיועדים לתאים בודדים ולהוסיף אות מופרך לכימות של פפטידים חד-תאיים.
בארות בקרה שליליות כוללות את כל הריאגנטים הניסיוניים אך חסרות תא. זה מאפשר לא רק להעריך רעשי רקע אלא גם את יעילות בידוד התאים על ידי מתן אות מייצג של באר ריקה. דו"ח DO-MS מציע מגרשים להערכת האות הנמדד של באר הבקרה לצד הבארות החד-תאיות כדי לקבוע את הצלחת בידוד התאים ורעשי הרקע. בנוסף, ניתן להעריך את איכות הכמות באמצעות צינור SCoPE2 (זמין ב- GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) או חבילת SCP Bioconductor29.
יעילות העיכול והתיוג של התאים הבודדים עשויה שלא להיבדק ישירות כמו אצל הנשא, אך DO-MS שוב מספקת עלילות המאפשרות להעריך את יעילות העיכול והתווית. על ידי הכללת בקרה של 100-200 תאים לצד הכנת התאים הבודדים (כלומר, קבלת כל אותן תוספות מגיבים), ניתן להעריך את יעילות העיכול והתיוג עבור בקרה זו, ולהניח שהם משותפים לתאים הבודדים שהוכנו לצדם. עיכול לקוי יצוין על ידי יחס גבוה של עוצמת הפפטידים השגויים למקביליהם השסועים לחלוטין (איור 1).
גורם נוסף שיש לקחת בחשבון בקבוצות הוא שבריר הנתונים החסרים ועוצמת יון הדיווח החציונית בכל ערוץ TMT (איור 2). כאשר תאים בודדים מוכנים בהצלחה, כמות הנתונים החסרים לכל תא ובקרה חיובית נמוכה בהרבה מאשר בדגימות בקרה שלילית. כמו כן, העוצמה החציונית של מבשרים גבוהה בהרבה בתאים בודדים ובבקרות חיוביות מאשר בבקרות שליליות. האופטימיזציה של פרמטרים של טרשת נפוצה נדונה בהרחבה במקומות אחרים21, וניתן לקבוע פרמטרים אופטימליים באמצעות כלים כגון DO-MS או SCP Companion25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig01.jpg"> איור 1: בקרת איכות הכנת נשאים. עלילות DO-MS המתארות (A) יעילות תיוג של נשא שהוכן בהצלחה באתרי תיוג עם TMT: האמין העיקרי בשרשרת הצדדית של ליזין ופפטיד N-terminus, ו-(B) יעילות העיכול בשאריות חומצות אמינו של ביקוע טריפטי. קיצור: TMT = תג מסה טנדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig02.jpg"> איור 2: בקרת איכות של הכנה חד-תאית. עלילות DO-MS המתארות (A) את החלק של הנתונים החסרים בתאים בודדים (C5-10), פקדים (C13,16), נשא (C1) וייחוס (C2), ו-(B) את העוצמה של תאים בודדים ופקדים. תגים 127C, 128N, 131C, 132N, 133N ו- 133C, המתאימים ל- C3, C4, C11, C12 ו- C15, אינם בשימוש בקבוצה מסוימת זו. הבקרה החיובית מורכבת מחומר תאי המעובד לפפטידים בתפזורת, ולאחר מכן מדולל לרמה של 2-5 תאים/μL לפני הסימון. השליטה השלילית מורכבת מבאר הכפופה לכל שלבי ההכנה המשמשים לתאים בודדים, רק ללא תוספת של תא בודד. קיצור: TMT = תג מסה טנדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להכין תאי יונקים לניתוח פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות ספקטרומטריית מסה באמצעות ריאגנטים וציוד זמינים מסחרית, עם אפשרויות לפיפטציה ידנית ואוטומטית כאחד.

Single-cell proteomics analysis requires sensitive, quantitatively accurate, widely accessible, and robust methods. To meet these requirements, the ...

SCoPE2 יכול לכמת אלפי חלבונים מאלפי תאי יונקים בודדים ללא נוגדנים. פרוטוקול זה יכול לסייע בחשיפת הטרוגניות פרוטאומית שאחרת הייתה בלתי נראית לניתוחים בתפזורת. פרוטאומיקה של תא בודד, תוך שימוש בגישת SCoPE2, תוכננה להיות נגישה לחוקרים עם מגוון משאבים, החל מפיפטה בלבד, וכלה ברובוטיקה לטיפול בנוזלים.SCoPE2 ישים באופן נרחב לתחומי מחקר רבים, כולל סרטן ואימונולוגיה, בכך שהוא מספק תובנה לגבי האופן שבו חלבונים הם דיפרנציאליים בשפע בין תאים בודדים מאותה אוכלוסייה. כדי להתחיל, התחל את הליך תזה התא על ידי הצבת צלחת 384 באר עם תאים בודדים ממוינים לתוך מחזור תרמי, חימום אותו במשך 10 דקות ב 90 מעלות צלזיוס ולאחר מכן קירור ב 12 מעלות צלזיוס. סובבו את הצלחת לזמן קצר בספינר של צלחת ספסל בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס.סוניקו את הצלחת במשך חמש דקות בסוניק אמבט מים בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הניחו אותו על קרח. כדי להמשיך בעיכול טריפסין, הכינו 100 מיקרוליטרים של תערובת המאסטר והוסיפו 0.2 מיקרוליטרים של תערובת האב לכל באר של צלחת 384 באר באמצעות מטפל בנוזל.אוטמים את הצלחת, מערבלים במשך חמש שניות, ומסתובבים מטה בספינר של צלחת ספסל בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס. מחממים את צלחת ה-384 במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כשטמפרטורת המכסה מוגדרת ל-52 מעלות צלזיוס. כדי להגדיר תגובת תיוג מסת טנדם, הוציאו את 85 המילימולרים של תגי מסת טנדם מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.לפני פתיחתם, מחממים את הצינורות לטמפרטורת החדר ומדללים את התוויות ל -22 מילימול באצטוניטריל נטול מים. באמצעות אסטרטגיית תיוג זו, הוסף 0.5 מיקרוליטרים של תגי מסה טנדם מדוללים לכל באר של צלחת 384 באר, באמצעות רובוט חלוקת נוזלים או פיפטה ידנית. אוטמים את הצלחת, מערבלים במשך חמש שניות, ומסתובבים מטה בספינר של צלחת ספסל בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס.תנו לתגובת הסימון להתקדם בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס למשך שעה. להמרווה של תגובת תיוג מסת טנדם, הוסף 0.2 מיקרוליטרים של 0.5% הידרוקסילאמין, מדולל במים ברמת HPLC, לכל באר של צלחת 384 באר באמצעות מטפל בנוזל. אטמו את הצלחת, ערבבו במשך חמש שניות והסתובבו מטה בספינר של צלחת ספסל לפני שתשמרו על הצלחת בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.הכנת ניתוח LC-MS מתחילה על ידי הסרת המוביל המשולב או חומר הייחוס מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. עבור כל סט, פיפטה מיקרוליטר אחד של נשא וחומר התייחסות לתוך הבאר הראשונה, יהיה חלק מסט אחד. פיפטה את הנפח המלא מהבאר הראשונה לבאר שלאחר מכן.המשיכו להעביר את הנפח השלם מבאר אחת לאחרת עד שכל הבארות הכלולות בסט אחד שולבו בבאר הסופית. עבור כל סט, הוסף חמישה מיקרוליטרים של 50% אצטוניטריל מדולל במים ברמת HPLC עבור באר התא הבודד הראשונה שתיכלל בכל ערכה. פיפטה את הנפח המלא מהבאר הראשונה לבאר שלאחר מכן.המשך להעביר את הנפח המלא מתא אחד למשנהו, עד שכל הבארות הכלולות בערכה אחת שולבו בבאר הסופית. כעת העבירו כל סט לתוספות הזכוכית האוטומטיות שלהם. יבשו את הדגימות לאחר שכל הסטים משולבים ומונחים בתוספות זכוכית.לפני ניתוח LC-MS-MS, יש להוסיף 1.2 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה פורמית לכל ערכה כדי להשהות את הפפטידים המסומנים. הנח את הדוגמאות האוטומטיות שהוכנסו לבקבוקוני הדגימה האוטומטית מזכוכית, וסגור כל דגימה באמצעות מכסה. מערבלים כל בקבוקון במשך חמש שניות כדי לוודא שהחידוש הושלם, ואז מסתובבים בספינר בקבוקון בטמפרטורה של 18 עד 22 מעלות צלזיוס.ודא שכל דגימה נמצאת בתחתית ההוספה ולא ניתזת בצדדים. הנח את הבקבוקונים במגש הדגימה האוטומטית ועבור כל ערכה, הכנס דגימת מיקרוליטר אחת לניתוח LC-MS-MS. ייתכן שיעילות העיכול וההתוויה של התאים הבודדים לא תיבדק באופן ישיר כמו אצל הנשא, אך תוכנת DO-MS מספקת עלילות המעריכות את יעילות העיכול והתווית.עיכול לקוי מסומן על ידי יחס גבוה של עוצמת פפטידים miscleaved לעמיתיהם שסועים לחלוטין. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון בקבוצות הוא חלק הנתונים החסרים בעוצמת יון הדיווח החציונית בכל ערוץ תיוג מסה טנדם. כאשר תאים בודדים מוכנים בהצלחה, נתונים חסרים לכל תא ובקרה חיובית נמוכים בהרבה מדגימות בקרה שליליות.טיפול זהיר בנוזלים במהלך הכנת דגימת LC-MS-MS הוא קריטי להתאוששות מרבית של פפטידים. ניתן להכין דגימות קטנות של כ-100 פיקוגרמות עד 100 ננוגרם לבאר לניתוח פרוטאומיקה באמצעות נשא איזוברי. SCoPE2 מנגישה מדידות פרוטאומיקה חד-תאית לחוקרים ברחבי העולם על ידי שימוש רק בריאגנטים נפוצים ובציוד זמין מסחרית.זה מקובל על עיבוד ידני או אוטומציה בתפוקה גבוהה על ידי טיפול רובוטי בנוזלים.

single-cell-proteomics-preparation-for-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מיועד למיצוי וריכוז של חלבון ו-DNA מביומסה מיקרוביאלית שנאספה ממי ים, ולאחר מכן יצירת פפטידים טריפטיים המתאימים לניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה טנדם.

Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע בדיקות כימות מוחלטות של חלבוני מטרה בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות ניטור תגובה נבחר. הוא שימש לכימות מדויק של חלבונים של מסלול האיתות הכימוטקסיס של מקרופאגים בעכבר. בחירת פפטיד יעד, פיתוח בדיקה ובדיקות איכותיות וכמותיות מתוארים בפירוט.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

פרוטוקול מיצוי מקיף של שומנים, מטבוליטים חלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות מדגם אחד מוצג.

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

כאן אנו מתארים אפיון פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסות של שושלות תאים עם גורלות רקמות ידועים בעובר בעל חוליות Xenopus laevis .

ספקטרומטריית מסה מונחית שושלת תאים פרוטאומיקה בעובר המתפתח (צפרדע)

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה של פרוטאומיקה לאפיון פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון על פני התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.

זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

פרוטוקול מפורט מסופק לניקוי ושימוש חוזר בצינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקרבונט לביצוע בידוד שלפוחית חוץ-תאי המתאים לניסויים בפרוטאומיקה.

שימוש חוזר בצינור אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט באנליזות פרוטאומיות של שלפוחיות חוץ-תאיות

כאן, אנו מקימים שיטה פרוטאומית מבוססת ספקטרומטריית מסה תוך שימוש באזורי עניין מבודדים בקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין. פרוטוקול זה משמש לניתוח פרוטאום מאזורי רקמה ספציפיים בקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

גישה יעילה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה תוך שימוש באזורי רקמה נבחרים

פרוטוקול זה נועד לשמר מטבוליטים של תאים עבור ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) על ידי שילוב של שטיפת תמיסת מלח נדיפה, מרווה חנקן נוזלי מהיר, ייבוש בהקפאה ואחסון של -8 מעלות צלזיוס. הוא מדגים כי כיבוי חנקן נוזלי חיוני לשמירה על פרופילי מטבוליטים, בעוד שיש למזער אחסון קר ממושך כדי למנוע שינויים מטבוליים.

הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

למד את פרוטוקול SCoPE2 לפרוטאומיקה חד-תאית בתאי יונקים באמצעות ספקטרומטריית מסה ותיוג איזוברי. שיטה זו מאפשרת כימות אלפי חלבונים מבודדים ללא נוגדנים וחושפת הטרוגניות פרוטאומית מוסתרת באנליזות גוש.

הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי

גלה סרטונים נוספים