从尿囊液中生产高滴度重组新城疫病毒

在这里，我们提供了生产，纯化和定量高滴度重组新城疫病毒的详细程序。该方案始终产生>6×10⁹ 个斑块形成单位/ mL，提供适合体内动物研究 的 病毒量。描述了确保 体内 安全性的其他质量控制测定。

该协议概述了用于生产新城疫病毒的技术，以便可以安全地将其施用于小鼠和其他动物，如仓鼠和绵羊。与仅使用离心工艺的现有程序相比，使用切向流过滤可以更有效地处理大起始体积。这是一个漫长的过程，涉及几个复杂的步骤，这意味着时间管理可能是一个问题。

我建议确定所有潜在的暂停步骤，以便可以适当地拆分该技术，从而最大限度地减少压力。演示这个程序的将是亚历克斯，我的实验室的研究助理。对于新城疫病毒或NDV的纯化，首先，通过运行50毫升PBS来启动先前设置的实验系统。

当管中残留约 5 毫升 PBS 时，请停止泵。接下来，将具有一到三微摩尔保留等级的深度过滤器连接到管道上。要排出过滤器，请取下深度过滤器表皮侧的第二个盖子，然后开始通过系统额外运行50毫升PBS。

一旦PBS开始流过过滤器顶部的通风口，关闭端口并继续通过管路流动PBS。之后，用新的无菌收集容器替换废物容器，并开始通过深度过滤器运行尿囊流体。接下来，在开放确认中设置切向流过滤或TFF系统，并按照手稿中所述运行。

当储液罐中剩余约五毫升流体时，暂停泵并向储液罐中添加深度过滤的尿囊流体。然后恢复泵流量。为了防止病毒剪切，重要的是要确保系统的压力不超过每平方英寸10磅力。

为了增加错觉，应使用蠕动泵的速度和C型夹的组合。将150至100毫升尿囊流体留在储液罐中，暂停泵并通过添加150至200毫升缓冲液来交换缓冲液。同样，当油箱中剩余 5 到 10 毫升液体时，暂停泵，然后使用两个 C 形夹关闭腰围。

断开为储液罐供电的再张力管，并将其插入 50 毫升锥形管中。然后恢复流动，并在储罐中剩余的几滴液体时暂停。接下来，从废物管路中取出C型钳，并将再密封的进料管重新连接到储罐。

同时，为了制备碘克沙醇密度梯度超速离心，首先向13.2毫升开顶薄壁超离心管中加入0.5毫升的40%碘克沙醇。然后用连续加入2.5毫升20%碘克沙醇和2.5毫升10%碘克沙醇使色谱柱准备就绪。在超速离心之前，小心地将TFF系统中暗示的6至6.5毫升病毒溶液加入碘克沙醇柱中，而不会干扰梯度。

超速离心后，用一对无菌镊子取出管子。目标波段应为 10% 和 20% 梯度之间的段。接下来，使用蒸馏架将管子悬挂在烧杯的顶部。

之后，将1.5英寸的18号针头连接到5毫升注射器上，然后用针刺穿超速离心管的侧面，并通过缓慢伸出柱塞来取出目标带。如手稿中所述，从病毒溶液中除去碘克沙醇后，使用注射器小心地将病毒注射到透析盒中。要浓缩病毒溶液，请从透析缓冲液中取出透析盒，并将其放入可密封的小塑料袋中。

然后在袋子中加入15至25毫升的40%聚乙二醇，使透析盒完全浸没。透析后，用PBS短暂冲洗透析盒。接下来，将装有1.5英寸18号针头的注射器装满空气，将注射器插入透析盒并推动柱塞。

旋转设备以去除病毒，而不去除任何引入的空气。要清除粘附在膜上的残留病毒，请用戴手套的手指小心按摩膜，以免损坏膜。为了简化脱落过程，请去除透析盒中的一些多余空气。

对于质量控制测定，首先，通过在1.5毫升管中将10微升病毒溶液加入990微升PBS中来稀释100倍。然后通过向900微升PBS中加入100微升先前稀释液来继续连续稀释。对于感染测定，将每个妄想的20微升加入到96孔板的每个孔中。

在检查绿色荧光蛋白的细胞病变作用或进行间接免疫荧光测定之前，将板在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育至少48小时。通过使用该方案，通过硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳病毒蛋白得到高度纯化的NDV。通过该方法纯化的病毒的传染性也通过96孔板中进行的50%组织培养感染剂量或TCID50测定来验证。

TCID50是使用斯皮尔曼-卡伯计算器从每次稀释的正孔数中确定的。感染试验显示，在不同条件下，慢速和中源性NDV在孵育10~24 h后对DF一细胞的细胞病变作用差异。免疫佛罗伦萨测定在研究慢发性NDV感染Vero细胞方面也有效。

在启动实验系统时，请确保有效启动管路，因为任何残留的氢氧化钠都会使病毒失活。保持膜的完整性也很重要，因为损害这将严重损害病毒的纯化和产量。