Name: 从尿囊液中生产高滴度重组新城疫病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 了解从尿囊液中生产高滴度重组新城疫病毒的标准化方法。本方案采用切向流过滤技术进行病毒纯化，可获得超过6×10⁹ PFU/mL的高滴度病毒，适用于小鼠等动物模型的体内研究，确保实验安全性与可重复性。

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J.G.E.Y 获得了安大略兽医学院博士奖学金和安大略省研究生奖学金。本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金资助，授予 SKW（项目编号 #304737）和 LS（项目编号 #401127）。

<ol><li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li>
<li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+paramyxoviruses%3A+mechanism+of+action%2C+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molekuliarnaia+Biologiia%22%5BJournal%5D)">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li>
<li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29%3A+brief+history+of+its+oncolytic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li>
<li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li>
<li>McAusland, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vanadyl+sulfate+with+Newcastle+disease+virus+potentiates+rapid+innate+immune-mediated+regression+with+curative+potential+in+murine+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).</li>
<li>Warner, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+vaccination+with+a+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccine+protects+hamsters+from+SARS-CoV-2+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease.</a> iScience. 24 (11), 103219(2021).</li>
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<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li>
<li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li>
<li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li>
<li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+therapy+resistance%3A+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li>
<li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li>
<li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus%3A+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li>
<li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li>
<li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+influenza+vaccines%3A+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li>
<li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335(2021).</li>
<li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic%3A+clinical-grade+production%2C+purification%2C+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).</li>
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<li>Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P+and+M+gene+junction+is+the+optimal+insertion+site+in+Newcastle+disease+virus+vaccine+vector+for+foreign+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression.</a> The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).</li>
<li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li>
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<li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li>
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<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).</li>
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作者声明无任何利益冲突。

用于临床前研究的治疗性病毒必须经过高度纯化，以避免给药时产生毒性 体内15若未能去除外源性因子或污染物，可能导致严重的不良反应，从而抵消病毒制剂的治疗效果28由于新城疫病毒（NDV）是在鸡胚中生产的，其中含有多种污染性卵蛋白（如卵清蛋白），在使用前必须将其去除。 体内 在临床前或临床模型中29即使经过充分纯化，卵清蛋白中仍会发现29去除这些污染蛋白是一个严格的过程，需要耗费大量时间和资源。15,22如果新城疫病毒（NDV）能够在基于细胞的系统中以足够高的滴度生产，以满足所需水平 体内 应用，这可能会简化纯化过程并改善新城疫病毒（NDV）向&#160;临床环境中。然而，基于鸡蛋的溶瘤性新城病毒（NDV）生产已用于多项人体临床试验30....

新城疫病毒（Newcastle Disease Virus），也称为禽副粘病毒-1型（Avian Orthoavulavirus-1），是一种有包膜的禽副粘病毒，具有作为溶瘤病毒或病毒载体疫苗的潜力1,2,3,4,5,6,7。最近，经基因工程改造表达SARS-CoV-2刺突蛋白的NDV已在小鼠和仓鼠攻毒模型中被证实是一种有效的鼻内疫苗7,8,9。当用作癌症免疫治疗时，该病毒可诱导天然免疫细胞（特别是自然杀伤细胞）的募集、I型干扰素的产生以及抗肿瘤特异性T细胞的生成10,11,12,13。除了这些强大的免疫刺激特性外，NDV还具有良好的安全性以及成熟的反向遗传操作系统14,15。这些理想特性促使NDV在多项临床前研究和人体临床试验中得到评估（NCT04871737、NCT01926028、NCT04764422）16,17。为了进一步推进这一极具前景的免疫刺激性病毒载体，亟需建立详细的方法，以制备和纯化高滴度、超纯的NDV，确保其可安全地用于in vivo给药。
由于新城疫病毒（NDV）是一种禽副黏病毒，通常在鸡胚中进行扩增。尽管已有基于细胞的系统可用于增殖NDV，但大多数系统无法达到在鸡胚中所获得的滴度水平18。然而，在鸡胚中生产NDV也存在一些缺点，包括基于鸡胚的生产周期较长、难以实现规模化，大量获取SPF级鸡胚可能存在困难，且存在被鸡蛋过敏原污染的风险13,18,19,20。最近，有研究团队表明，在无血清培养基中悬浮培养的Vero细胞可在纯化前支持NDV复制，达到与鸡胚中相当的滴度21。然而，该方法需要对病毒进行连续传代以适应Vero细胞，且仍需优化从悬浮培养的Vero细胞中纯化NDV的方法21。
如前所述，用于纯化高滴度、适用于体内实验级别的病毒的方法因具体病毒种类而异22。目前已有成熟的反向遗传学系统可用于重组新城疫病毒（NDV）的构建。该过程涉及使用cDNA克隆、辅助质粒以及表达T7 RNA聚合酶的辅助病毒，其详细步骤已有文献报道15,23。本实验方案适用于弱毒型（lentogenic）或中等毒力型（mesogenic）NDV。本方案中所描述的病毒为一种重组中等毒力型NDV，其在病毒P基因与M基因之间插入了来自维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）基因，作为一个独立的转录单元。此前研究已表明，该位点是外源转基因插入的最佳位置24。
封闭的方法基于新城疫病毒（NDV）的大小（100至500 nm）及其密度，概述了其纯化步骤15。这使得能够生成 体内-级、高滴度NDV毒株，从接收到鸡蛋到获得最终滴度约需3周。文中描述了基于鸡蛋大规模生产病毒常用的技术，包括切向流过滤、深层过滤和密度梯度超速离心，有助于将这些方法扩展至更大规模的生产。此前报道的NDV纯化技术已得到改进，改进措施包括引入病毒稳定缓冲液、在密度梯度超速离心中使用碘克沙醇，以及详细说明各项质量控制手段，以确保 体内-级质量15。这使得纯化成为可能 体内-级NDV，滴度高达3 × 1010 每0.8至1.0升羊水中的PFU/mL。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>HyClone</td><td>SH30042.02</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 滑动式针头注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 鲁尔锁式注射器</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10% 聚维酮碘溶液</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14955240</td><td></td></tr><tr><td>18G × 1 1/2 英寸钝头填充针</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>18G × 1 1/2 英寸精密滑动针</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25G × 5/8 英寸针头</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Thermo-Fisher</td><td>03446I-100</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛-PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 鲁尔锁式注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96 孔组织培养板 - 平底</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Froggabio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂 (5%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-102-0599</td><td></td></tr><tr><td>宽头无齿镊</td><td>Thermo-Fisher</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-25G</td><td></td></tr><tr><td>Centramate 夹具架</td><td>PALL</td><td>CM018V</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;培养箱</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-259</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP101-50</td><td></td></tr><tr><td>DF1 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-12203</td><td></td></tr><tr><td>饮食凝胶恢复剂</td><td>ClearH2O, INC</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Digital 1502 Sportsman 孵化器</td><td>Berry Hill</td><td>1502W</td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>验蛋灯</td><td>Berry Hill</td><td>A46</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 (70%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液，pH 8.0，0.5 M 水溶液</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>尼龙材质，1/8 英寸 NPT(F) 内螺纹三通接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-50</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>精细尖头高精度镊子</td><td>Thermo-Fisher</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>ZEISS AXIO</td><td></td><td>若不进行免疫荧光检测或NDV不编码荧光蛋白，则非必需</td></tr><tr><td>Freezone 4.5 冷冻干燥系统</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GiBOX 凝胶成像系统</td><td>Syngene</td><td></td><td>琼脂糖凝胶成像</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Thermo-Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>高糖 Dulbecco 改良必需培养基</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>湿度套件</td><td>Berry Hill</td><td>3030</td><td></td></tr><tr><td>碘克沙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>水中 60% (w/v) 碘克沙醇溶液（无菌）</td></tr><tr><td>L-赖氨酸单盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62929-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>1/8 英寸国家管螺纹 NPT 鲁尔锁公母接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>41507-44</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 数字驱动器</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07522-20</td><td>带数字显示的蠕动泵</td></tr><tr><td>Masterflex 精密管用 L/S 易装泵头</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 硅胶管（铂金固化）L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td>生物制药级铂金固化硅胶</td></tr><tr><td>MC Pro 5 梯度PCR仪</td><td>Eppendorf</td><td>EP950040025</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra 电泳槽</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td>SDS-PAGE 制胶与电泳装置</td></tr><tr><td>小鼠抗NDV抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-11633</td><td>克隆株 6H12</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo-Fisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Omega 膜 LV Centramate 夹具，100K</td><td>PALL</td><td>OS100T02</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OWL Easycast B1A 小型凝胶电泳系统</td><td>Thermo-Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X 溶液</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 平均分子量 20,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PowePac 300</td><td>BioRad</td><td></td><td>型号 1655050 - 用于琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>Q5 高保真 2X 预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp 病毒RNA小型提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>RedSafe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>50999562</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer 透析夹具（高强度），10,000 MWCO，0.5–3 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（颗粒）</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S318-10</td><td></td></tr><tr><td>无特定病原体鸡蛋</td><td>CFIA</td><td>NA</td><td>供应商因地区而异</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Supracap 50 深层过滤器</td><td>PALL</td><td>SC050V100P</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Thermo-Fisher</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Sw41Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>用于实验步骤 2.3.1、2.3.6、2.3.7</td></tr><tr><td>SX4750 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>SxX4750 圆底管适配器</td><td>Beckman Coulter</td><td>359472</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>超透明薄壁离心管 (9/16 英寸 × 3 1/2 英寸)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>管路螺钉夹</td><td>PALL</td><td>88216</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>通用压力表</td><td>Cole-Parmer</td><td>68355-06</td><td></td></tr></tbody></table>

从尿囊液中制备高滴度重组新城疫病毒

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），也称为禽副粘病毒血清型1（avian orthoavulavirus serotype-1），是一种负链单股RNA病毒，已被开发为溶瘤病毒和病毒载体疫苗。由于其成熟的反向遗传学系统、强大的免疫刺激特性以及优异的安全性，NDV成为一种具有吸引力的治疗和预防制剂。当作为溶瘤病毒或病毒载体疫苗使用时，NDV可引发强烈的抗肿瘤或抗原特异性免疫反应，激活免疫系统的先天性和适应性免疫应答。
鉴于这些理想的特性，新城疫病毒（NDV）已在多项临床试验中得到评估，是研究最为深入的溶瘤病毒之一。目前，有两项注册的临床试验涉及NDV：一项评估基于重组NDV载体的SARS-CoV-2疫苗（NCT04871737），另一项评估表达白细胞介素-12（Interleukin-12）的重组NDV与抗PD-L1抗体Durvalumab联合使用的疗效（NCT04613492）。为了推动这一极具前景的病毒载体的进一步发展，亟需建立简便的方法以制备高滴度、适用于体内实验（in vivo-grade）的重组NDV（rNDV）。
本文描述了一种在无特定病原体（SPF）鸡胚中扩增重组新城疫病毒（rNDV）并从尿囊液中纯化rNDV的详细步骤，其中包含若干改进措施以减少纯化过程中的病毒损失。同时提供了推荐的质量控制检测方法，用于确认病毒制品无污染物且具有完整病毒结构。总体而言，该详细操作流程可实现高滴度、 体内-级、重组型、低毒力型和中等毒力型新城疫病毒（NDV），用于临床前研究。

收集尿囊液 
在从鸡胚中收集尿囊液时，液体应呈清澈透明状。如果液体浑浊发黄，则表明存在污染物。在纯化过程中若混入此类尿囊液，会导致纯化压力迅速上升并超过10 psi，从而引起病毒剪切，导致感染性病毒丢失。若尿囊液呈血性，提示鸡胚接种的病毒PFU数量过多。该批鸡胚的病毒产量将显著低于预期，且该病毒很可能无法用于体内实验。接种弱毒株新城疫病毒（lentogenic NDV）的鸡胚在72小时后仍应可见明显的血管系统，且胚胎应保持存活，如图1所示。若血管系统消失或胚胎死亡，则提示胚胎可能已受到损伤或污染。
碘克沙醇密度梯度超速离心 
超速离心后，应在10%与20%梯度之间观察到一条高滴度、白色、含有新城疫病毒（NDV）的条带（图4B）。
SDS-PAGE 凝胶的考马斯亮蓝染色<b...

在此，我们提供了一种高效价重组新城疫病毒的制备、纯化与定量的详细操作流程。该方案可稳定获得 &#62; 6 × 109 每毫升噬斑形成单位，提供适用于病毒定量的合适数量 体内 动物实验。为确保安全性而进行的额外质量控制检测 体内 已描述。

新城病病毒（Newcastle disease virus，NDV），又称禽副粘病毒1型（avian orthoavulavirus serotype-1），是一种负链单股RNA病毒，已被开发用于……

本方案概述了用于制备新城疫病毒的技术，以便能够安全地将其施用于小鼠及其他动物（如仓鼠和绵羊）。采用切向流过滤技术，可比仅使用离心步骤的现有方法更高效地处理较大的起始体积。该过程耗时较长，涉及多个精细步骤，因此时间管理可能成为关键问题。建议识别所有可能的暂停步骤，以便合理分段操作，最大限度地减少压力。本次实验操作将由我实验室的研究助理 Alex 演示。对于新城疫病毒（Newcastle Disease Virus 或 NDV）的纯化，首先通过运行 50 毫升 PBS 来预处理先前设置好的实验系统。当管中剩余约五毫升 PBS 时，停止泵。接下来，将一个截留精度为 1 至 3 微米的深层过滤器连接到管路上。为排出过滤器中的气体，取下深层过滤器顶端侧面的第二个盖帽，然后向系统中继续注入额外的 50 毫升 PBS。当 PBS 开始从滤器顶部的排气口流出时，关闭该端口，并继续使 PBS 流经管路。随后，将废液容器更换为新的无菌收集容器，并开始使尿囊液通过深层滤器。接下来，搭建切向流过滤（TFF）系统，采用开放式构型，并按照文中的描述进行操作。当储液器中剩余约五毫升液体时，暂停泵的运行，并向储液器中加入经深度过滤的羊水。然后恢复泵的流速。为防止病毒受到剪切力损伤，需确保系统压力不超过每平方英寸10磅力（10 psi）。为了增强这种假象，应结合使用蠕动泵的速度和C型夹。在储液器中保留150至100毫升的羊水，暂停泵液，通过加入150至200毫升的ML缓冲液来更换缓冲液。当储液器中剩余5至10毫升液体时再次暂停泵液，然后使用两个C型夹闭合腰部。断开通向储液罐的保留管路，并将其插入一个50毫升的锥形管中。然后恢复液体流动，当储液罐中仅剩少量液滴时暂停。接下来，从废液管路上取下C型夹，将保留的进液管路重新连接至储液罐。同时，为准备碘克沙醇密度梯度超速离心，首先向一支13.2毫升开口薄壁超速离心管中加入0.5毫升40%碘克沙醇。然后依次加入2.5毫升20%碘克沙醇和2.5毫升10%碘克沙醇，制备梯度柱。在超速离心前，小心地将来自TFF系统的6至6.5毫升病毒溶液加至碘克沙醇梯度柱上，注意不要扰动梯度。超速离心后，用无菌镊子取出离心管。目标条带应位于10%和20%梯度之间，呈一条较宽的条带。接着，使用铁架台将离心管悬置于烧杯上方。随后，将一根18号、1.5英寸长的针头连接至5毫升注射器上，用针头刺穿超速离心管的侧壁，缓慢推动活塞以吸取目标条带。按照文中所述方法去除病毒溶液中的碘克沙醇后，使用注射器将病毒液小心注入透析盒中。为浓缩病毒溶液，需将透析盒从透析缓冲液中取出，并放入一个小的可密封塑料袋中。然后向袋中加入15至25毫升40%的聚乙二醇，使透析盒完全浸没。透析结束后，用PBS短暂冲洗透析盒。接着，取一支配有18号、1.5英寸针头的注射器，吸入空气，将注射器插入透析盒并推动活塞。在不排出已引入空气的情况下旋转装置以去除病毒。为清除附着在膜上的残留病毒，需戴手套轻轻按摩膜表面，注意不要损坏膜。为便于清除残留物，可去除透析夹中部分多余的空气。进行质量控制检测时，首先取10微升病毒溶液加入到990微升磷酸盐缓冲液（PBS）中，于1.5毫升离心管中将病毒溶液稀释100倍。随后，将前一步的稀释液100微升加入900微升PBS中，继续进行系列稀释。进行感染检测时，将每种稀释液各20微升分别加入96孔板的每个孔中。在观察绿色荧光蛋白的细胞病变效应或进行间接免疫荧光检测之前，需将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少48小时。通过本方案，可获得高度纯化的新城疫病毒（NDV），病毒蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果已证实了其纯度。采用该方法纯化的病毒的感染性也通过在96孔板中进行的50%组织培养感染剂量（TCID50）实验得到了验证。使用Spearman-Karber计算器，根据各稀释度下阳性孔的数量确定TCID50。感染实验显示了在孵育10小时和24小时后，不同条件下缓发型和中发型新城疫病毒（NDV）对DF1细胞的细胞病变效应差异。免疫荧光实验也有效用于研究缓发型NDV对Vero细胞的感染情况。在启动实验系统时，应确保管路充分预冲，因为任何残留的氢氧化钠都会使病毒失活。同时必须保持膜的完整性，因为膜的破损会显著影响病毒的纯化效果和得率。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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从质粒DNA中拯救甲型流感病毒是一项基础且关键的实验技术，该技术可使流感研究人员能够构建重组病毒，用于研究流感病毒生物学的多个方面，并可作为潜在的载体或疫苗使用。...

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来源：Brauer, R. et al.，鸡胚中流感病毒的增殖。J. Vis. Exp.

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在 FDA 批准的 Vero 细胞中生成用于疫苗开发的重组沙粒病毒

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随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

本文介绍了一种简化的新城疫病毒血清学检测用4血凝单位抗原的制备方法。通过准确定量抗原的血凝效价，结合更为严格的反向滴定法以及明确的调整流程，该方法可提高检测效率，减少假阳性结果，并改善家禽疫病的监测能力。...

新城疫病毒血清学血凝抑制试验中抗原制备的优化

了解从尿囊液中生产高滴度重组新城疫病毒的标准化方法。本方案采用切向流过滤技术进行病毒纯化，可获得超过6×10⁹ PFU/mL的高滴度病毒，适用于小鼠等动物模型的体内研究，确保实验安全性与可重复性。

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