Name: Sf9纯化超加工驱动蛋白-3系列电机的单分子分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习使用Sf9杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白KIF1A，并通过单分子运动性和多电机滑行实验研究其调控机制。该方法适用于细胞骨架蛋白的生物物理特性分析。

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V.S. 和 P.S. 感谢美国密歇根大学安娜堡分校（University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA）的 Kristen J. Verhey 教授和印度孟买印度理工学院（Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India）的 Roop Mallik 教授在本研究期间提供的无私支持。P.S. 感谢 Sivapriya Kirubakaran 博士在项目全程中的支持。V.S. 感谢印度生物技术部（DBT）资助（项目编号：BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 和 BT/RLF/Re-entry/45/2015）以及印度科学与工程研究委员会（DST-SERB）资助（项目编号：ECR/2016/000913）。P.K.N. 感谢印度医学研究理事会（ICMR）提供的经费支持（项目编号：5/13/13/2019/NCD-III）。P.S. 感谢印度科学与技术部（DST）资助（项目编号：SR/WOS-A/LS-73/2017）。D.J.S. 感谢&#160;来自印度理工学院甘地讷格尔分校的奖学金

1. Sf9 细胞培养、转染及病毒制备
注意：将 Sf9 细胞维持在 100 mL 无菌一次性锥形瓶中的 30 mL Sf-900/SFM 培养基中，不添加任何抗生素或抗真菌剂，于 28 °C 培养。将悬浮培养物置于摇床中，以 90 rpm 振荡培养。无需提供 CO2 或维持湿度。通常每四天传代一次，接种密度为 0.5 × 106 个细胞/mL，至第四天细胞密度达到 2.0 × 106 个细胞/mL。
<ol>
	<li>P0 病毒原液制备
	<ol>
		<li>用于转染时，将细胞以 4.5 × 105 个细胞/mL 的密度接种至 35 mm 培养皿中，并在 28 °C 下静置培养。</li>
		<li>24 小时后，待细胞贴壁且状态良好，按以下步骤进行转染：
		<ol>
			<li>试管 A：将编码组成型活性 KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG 特异性驱动蛋白-3 马达的 1 µg 杆状病毒 DNA 与 100 µL 未添加补充物的 Grace's 培养基混合。</li>
			<li>试管 B：将 6 µL 转染试剂与 100 µL 未添加补充物的 Grace's 培养基混合。</li>
			<li>小心地将 试管 A 中的内容物转移至 试管 B 中，并通过上下吹打（约 20 次）充分混匀。</li>
			<li>室温孵育混合物约 45 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>完成孵育后，向上述混合物中加入 0.8 mL 未添加补充物的 Grace's 培养基，并用移液器缓慢混匀。</li>
		<li>轻柔吸除细胞上的 Sf-900/SFM 培养基（以去除可能影响转染效率的任何血清残留）。</li>
		<li>将步骤 1.1.3 中的转染混合物逐滴加至细胞表面，并在 28 °C 下孵育 6 小时。</li>
		<li>孵育结束后，小心移除转染混合物，加入 2 mL Sf-900/SFM 培养基，并继续在 28 °C 下孵育 48 小时。</li>
		<li>在倒置荧光显微镜下检测马达蛋白的表达情况。该马达蛋白带有荧光蛋白标签 mCitrine，是黄色荧光蛋白的一种变体。 
		注：转染后的细胞使用配备微分干涉差（DIC）和落射荧光照明系统、20 倍物镜（200 倍放大）、汞灯和 EM-CCD 相机的倒置显微镜进行观察。通过 mCitrine 激发和发射滤光片组监测细胞中 mCitrine 标记马达蛋白的表达，以评估病毒生成和感染效率。此外，观察感染细胞的形态学变化，例如细胞或细胞核增大（图 1A-C）。</li>
		<li>再次于感染后 72 小时观察细胞状态。通常此时细胞开始从培养表面脱落（图 2）。</li>
		<li>若脱落细胞比例 &#62;5%，收集含感染细胞的培养上清至 1.5 mL 无菌微量离心管中，于 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>收集上清液，用液氮速冻成 1 mL 分装样品，并作为 P0 原液储存于 -80 °C，或用于制备 P1 病毒原液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>P1 病毒原液制备
	<ol>
		<li>为进一步扩增 P0 杆状病毒原液并确认蛋白表达，将 Sf9 细胞在液体悬浮培养中进行培养。</li>
		<li>在无菌的 100 mL 锥形瓶中加入 10 mL Sf-900/SFM 培养基，调整细胞密度为 2 × 106 个细胞/mL，并加入 1 mL P0 病毒原液。在 28 °C 下以 90 rpm 持续振荡培养。</li>
		<li>感染 72 小时后，按前述方法（步骤 1.1.7）检测蛋白表达。若蛋白表达良好（&#62;90% 的细胞显示明亮的 mCitrine 荧光信号），且出现明显细胞死亡（约 10%-15%），则将细胞在 15 mL 无菌锥形管中以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>收集上清液，用液氮速冻成 1 mL 分装样品（P1 原液），储存于 -80 °C，或用于大规模感染及蛋白纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大规模感染
	<ol>
		<li>为实现大规模蛋白表达，使用 1 mL P1 病毒原液感染 30 mL 悬浮培养物（细胞密度为 2 × 106 个细胞/mL），并在 28 °C 下以 90 rpm 持续振荡培养。</li>
		<li>感染后约 72 小时，检测蛋白表达（通常在感染后 65–75 小时达到最高表达水平）。</li>
		<li>若 &#62;90% 的细胞显示明亮的荧光信号且细胞死亡极少（&#60;5%），将细胞收集至无菌 50 mL 锥形管中，在 4 °C 下以 500 × g 离心 15 分钟。 
		&#8203;注：应保持极低的细胞死亡率（&#60;5%），因为死亡细胞会释放胞内成分至培养基中，导致表达蛋白的损失。</li>
		<li>弃去上清液，收集细胞沉淀，并进行蛋白纯化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. kinesin-3 运动蛋白的 Sf9 细胞纯化
<ol>
	<li>向上述细胞沉淀中加入 3 mL 冰冷的裂解缓冲液（补充表 1），新鲜添加 5 mM DTT、5 µg/mL 抑肽酶（aprotinin）、5 µg/mL 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）和 5 µg/mL PMSF，通过移液器吹打 20–25 次使细胞裂解，注意避免产生气泡。所有缓冲液组成和试剂请参见 补充表 1。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 150,000 x g 离心细胞裂解液 30 分钟。</li>
	<li>将上清液收集至新的无菌离心管中，加入约 40 µL 的 50% 抗 FLAG M2 亲和树脂，于 4 °C 轻柔翻转孵育 3 小时。</li>
	<li>孵育结束后，在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 1 分钟，使 FLAG 树脂沉淀。使用 26 G 针头小心吸除上清液，避免扰动沉淀，弃去上清。</li>
	<li>用冰冷的洗涤缓冲液（补充表 1）洗涤 FLAG 树脂沉淀三次，每次洗涤时新鲜添加 2 mM DTT、5 µg/mL 抑肽酶、5 µg/mL 亮抑蛋白酶肽和 5 µg/mL PMSF。每次洗涤后在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 1 分钟，使树脂沉淀。</li>
	<li>第三次洗涤后，尽可能彻底去除洗涤缓冲液，避免扰动沉淀。为进行蛋白洗脱，向树脂沉淀中加入约 70 µL 含 100 µg/mL FLAG 肽的洗涤缓冲液，于 4 °C 轻柔翻转过夜孵育。</li>
	<li>次日，在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 1 分钟，使树脂沉淀。将含有纯化蛋白的上清液收集至新的离心管中，并补充 10% 甘油。取 5 µL 分装，液氮速冻后于 -80 °C 保存，以备后续使用。</li>
	<li>进行 SDS-PAGE 电泳以测定蛋白浓度和得率。除目标纯化蛋白外，同时上样一系列已知浓度的标准蛋白对照（BSA），浓度分别为 0.2 µg、0.4 µg、0.6 µg、0.8 µg 和 1 µg，用于生成标准曲线。使用考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）染色凝胶（图 3）。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件内置的凝胶定量工具分析凝胶结果。首先测定已知浓度 BSA 条带的强度，绘制标准曲线；然后测定目标纯化蛋白条带的强度，据此确定其蛋白浓度。操作时打开 ImageJ 软件，点击菜单栏中的 分析 选项，并在下拉菜单中选择 凝胶 功能。</li>
</ol>
3. 体外 使用Sf9纯化的驱动蛋白-3分子进行单分子运动性检测
注意：Sf9 纯化的驱动蛋白-3 分子马达可用于研究其生物化学与生物物理特性，如 ATP 转换速率、微管亲和力、运动速度、运行长度、步长以及力的产生。以下为详细实验方案 体外 使用全内反射荧光（TIRF）显微镜对KIF1A(1-393LZ)进行单分子运动分析的方法描述如下。有关所有缓冲液组成和试剂，请参见 补充表1.
<ol>
	<li>微管聚合
	<ol>
		<li>在预冷的 0.5 mL 微量离心管中，按以下顺序加入试剂配制聚合反应混合液：12.0 µL BRB80 缓冲液（pH 6.9）、0.45 µL 100 mM MgCl2、1 µL 25 mM GTP。</li>
		<li>取出一份 10 µL 的 10 mg/mL 微管蛋白样品（储存于液氮中），立即融化后加入上述聚合混合液中。用移液器轻柔吹打 2–3 次混匀，避免产生气泡。 
		注意：上述操作需迅速完成，并严格在冰上进行。</li>
		<li>将上述混合液置于冰上静置 5 分钟。 
		注意：此步骤至关重要，可防止微管蛋白变性或短微管成核体的形成。</li>
		<li>将离心管转移至预热至 37 °C 的金属浴或水浴中，孵育 30 分钟以完成微管聚合。</li>
		<li>在微管聚合过程中，取出一份 P12 缓冲液解冻，并恢复至室温。</li>
		<li>在完成 30 分钟孵育前，开始准备微管稳定缓冲液：取 100 µL P12 缓冲液加入新的微量离心管中，加入 1 µL 1 mM 紫杉醇（taxol），立即涡旋混匀。 
		注意：应在步骤 3.1.4 孵育结束前约 5 分钟开始配制微管稳定缓冲液。紫杉醇通过结合 β-微管蛋白来稳定已聚合的微管。</li>
		<li>将微管稳定缓冲液在 37 °C 下预热 2–3 分钟，然后轻柔地加入已聚合的微管溶液中，避免扰动管底的聚合混合液。 
		&#8203;注意：预热稳定缓冲液可使其温度与聚合混合液一致。</li>
		<li>不要振荡或吹打混合液，继续在 37 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>轻柔振荡混合液，并使用斜切口吸头（200 µL 容量）缓慢吹打混匀。 
		注意：从此步骤起，始终使用斜切口吸头操作微管，以避免微管剪切损伤。</li>
		<li>取 10–15 µL 聚合后的微管溶液加入流动池中，以检测微管是否正常聚合。 
		注意：可使用微分干涉差显微镜（DIC）观察未标记的微管。</li>
		<li>若微管浓度过高，使用含 10 µM 紫杉醇的 P12 缓冲液进行稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运动分析流动池腔室的制备
	<ol>
		<li>使用载玻片、双面胶带和盖玻片（22 mm × 30 mm）制备运动分析腔室。</li>
		<li>取一张载玻片，在中央滴加一滴去离子蒸馏水（约 70 µL），并用无尘纸擦拭干净。</li>
		<li>裁剪两条双面胶带（约 35 × 3 mm），平行粘贴于载玻片上，两胶带之间保留约 4–5 mm 间隙，以形成狭窄通道。</li>
		<li>取一张盖玻片，在中央滴加一滴去离子蒸馏水（约 20 µL），将一小条无尘镜头纸覆盖于水滴上，待其吸干水分后，缓慢将纸条向盖玻片一端滑动。 
		注意：盖玻片应完全干燥，表面不可残留水分。</li>
		<li>将盖玻片放置于载玻片上的双面胶带上，沿胶带均匀按压，确保牢固粘合。 
		注意：请确保盖玻片的清洁面朝向载玻片。</li>
		<li>确保组装后的腔室容积为 10–15 µL，适用于运动分析实验（图 4A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外单分子运动分析实验 
	注意：为研究基于微管的分子马达单分子运动特性，需将微管吸附于运动腔室的盖玻片表面。
	<ol>
		<li>将紫杉醇稳定的聚合微管用含 10 µM 紫杉醇的 P12 缓冲液按 1:5 比例稀释，并使用斜切口吸头缓慢吹打混匀。</li>
		<li>将流动腔室倾斜放置（约 15–20°）。从腔室上端加入 30 µL 稀释后的微管溶液，同时在下端放置无尘纸以吸收液体。此操作可产生剪切力，使微管沿流动方向排列并直线吸附，保持平行排列。</li>
		<li>在腔室两端各保留少量液体，并将流动池倒置（盖玻片朝下）置于密闭湿润 chamber 中，防止腔室干燥。</li>
		<li>静置约 30 分钟，使微管充分吸附于盖玻片表面。</li>
		<li>在此期间，通过将 500 µL P12-BSA 缓冲液与 5 µL 1 mM 紫杉醇混合，配制&#160;封闭缓冲液。</li>
		<li>加入 40–50 µL 封闭缓冲液，将载玻片倒置于湿润 chamber 中孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 500 µL 容量的无菌微量离心管中，按以下顺序加入以下组分配制&#160;运动分析混合液：25 µL 含紫杉醇的 P12 缓冲液、0.5 µL 100 mM MgCl2、0.5 µL 100 mM DTT、0.5 µL 20 mg/mL 葡萄糖氧化酶、0.5 µL 8 mg/mL 过氧化氢酶、0.5 µL 2.25 M 葡萄糖、1.0 µL 100 mM ATP。 
		注意：荧光成像已广泛应用于生物学研究22,23,24,25,26。荧光蛋白在光激发下会产生活性氧（ROS），导致荧光蛋白光漂白并对生物样本造成损伤27,28。在运动分析实验中，通常使用葡萄糖、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶等耗氧系统，以减少光损伤并延长荧光蛋白的光漂白时间。</li>
		<li>最后，向上述运动混合液中加入 1 µL 纯化的分子马达，充分混匀后立即注入运动腔室。</li>
		<li>用液体石蜡密封运动腔室两端，立即在 TIRF 照明下使用 100X（NA 1.49）TIRF 物镜配合 1.5 倍放大镜进行成像。</li>
		<li>为聚焦盖玻片表面，首先在微分干涉差（DIC）照明下对运动腔室中双面胶带的内侧边缘进行聚焦。 
		注意：此时可见明亮且不均匀的表面。</li>
		<li>随后将焦点移入运动腔室内，通过微调聚焦盖玻片表面，并观察吸附于其上的微管。</li>
		<li>当微管清晰聚焦后，切换至 488 nm 激光激发的 TIRF 照明，通过调节激发光入射角度调整照明深度，以获得最佳且均匀的 TIRF 照明效果（图 4B）。</li>
		<li>使用 100 ms 曝光时间对沿微管表面持续运动的 mCitrine 标记单个分子马达进行聚焦，并利用 EM-CCD 相机记录其运动过程。 
		注意：尽管运动分析实验使用的是未标记微管，但可通过最大强度 Z 投影功能显示微管轨迹轮廓。优先选择长微管轨迹上的运动事件进行追踪分析。</li>
		<li>使用 ImageJ（nih.gov）软件中自定义编写的插件，逐帧手动追踪荧光标记的单个分子马达在长微管轨迹上的运动位置，方法如前所述29。</li>
		<li>通过绘制每个区间的事件数量，生成分子马达群体的速度和运行长度直方图。将直方图拟合为单高斯峰函数，以获得平均速度和平均运行长度12（图 4C–E）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体外 微管滑动实验
注意：为了理解驱动蛋白-3（kinesin-3）马达的集体行为， 体外 微管滑动实验已执行18,30,31. 当将马达蛋白以倒置方式固定在盖玻片上，随后向反应腔内加入微管时，微管会附着在马达蛋白上，并随着马达蛋白在其表面行走而发生滑动（图 5A，B).
<ol>
	<li>荧光微管聚合：&#160;按照先前描述的方案聚合微管，但将罗丹明标记的微管蛋白（3 mg/mL）与未标记的微管蛋白（10 mg/mL）按1:10的比例混合。</li>
	<li>聚合30分钟后，轻轻加入30 µL预热的微管稳定缓冲液，于37 °C继续孵育5分钟。</li>
	<li>接下来，使用毛细管上样枪头反复吹打约25–30次，以剪切微管。</li>
	<li>按照先前所述方法制备运动性流动腔室，加入50 µL经Sf9纯化的GFP纳米抗体（将2.5 µL的100 nM溶液用50 µL P12缓冲液稀释），将盖玻片朝下置于湿润 chamber 中，室温孵育30分钟。 
	注意：马达蛋白在C端标记有mCitrine。由于GFP纳米抗体具有较低的解离常数，因此用于固定这些马达蛋白。32.</li>
	<li>向流动池中注入50 µL封闭缓冲液，以封闭盖玻片表面，防止非特异性蛋白吸附，并继续孵育5 min。</li>
	<li>通过移液器加入50 µL封闭缓冲液、1 µL 100 mM ATP和5 µL 100 nM Sf9纯化的驱动蛋白-3（kinesin-3）马达，配制马达混合液。在流入反应腔前轻轻混匀，并在湿润环境中室温孵育30分钟。</li>
	<li>用50 µL P12酪蛋白洗涤反应室两次。</li>
	<li>在无菌的微量离心管中，按以下顺序配制滑动实验混合液：45 µL 含10 µM 紫杉醇的P12-酪蛋白，1 µL 100 mM ATP，0.5 µL 8 mg/mL 过氧化氢酶，0.5 µL 20 mg/mL 葡萄糖氧化酶，0.5 µL 2.25 M 葡萄糖，以及1 µL 剪切的荧光标记微管。在将混合液注入运动室之前轻轻混匀，并用液体石蜡密封运动室的两端。</li>
	<li>在TIRF照明下以100 ms曝光时间拍摄微管滑动图像，并使用连接的EM-CCD相机采集图像。 
	注意：通过使用 ImageJ 中自编写的插件逐帧手动追踪约 100 条单个微管，确定平均微管滑动速度29. 通过生成直方图并拟合高斯函数来确定微管滑动的平均速度图5C，D).</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

Sf9-杆状病毒表达系统是高通量蛋白质生产的最通用且最成功的方法之一19,36,37。Sf9细胞的翻译后修饰能力与哺乳动物系统高度相似15。使用该系统的一个显著缺点是操作周期较长且易受污染。其中最关键的步骤是实现Sf9细胞的高效感染和成功表达，这要求在无任何污染的情况下对Sf9细胞进行正确的操作和培养维护。该系统需要专用的无尘空间以及恒温培养箱和摇床等仪器设备。不规范的细胞培养操作或使用过度生长的培养物将导致感染效率低下、生长缓慢以及显著的细胞死亡。
在Sf9细胞中表达的蛋白进行FLAG标签纯化具有多项优势。首先，Sf9细胞可被高效裂解，从而获得大部分处于活性和可溶形式的蛋白。其次，与HIS和GST树脂相比，FLAG树脂的非特异性蛋白吸附更少。38因此，大量蛋白质以单一洗脱步骤被纯化释放。在生化ATP酶...

细胞内高度拥挤的环境给靶向蛋白质和分子的分选带来了诸多挑战。细胞质中分子的组织及其时空分布这一繁重任务，主要由分子马达和细胞骨架轨道系统来完成。分子马达是一类能够水解ATP等能量分子并利用所释放能量产生运动和力的酶1。根据氨基酸序列的相似性，驱动蛋白被分为14个家族，尽管存在序列相似性，但每种马达蛋白在细胞功能中均发挥独特作用。其中，驱动蛋白-3家族是最大的家族之一，包含五个亚家族（KIF1、KIF13、KIF14、KIF16和KIF28）2，参与多种细胞和生理功能，包括囊泡运输、信号转导、有丝分裂、细胞核迁移以及发育过程3,4,5。驱动蛋白-3运输功能的障碍与多种神经退行性疾病、发育缺陷以及癌症密切相关6,7,8,9。
近期研究表明，驱动蛋白-3（kinesin-3）马达蛋白在游离状态下为单体，但在货物分子的诱导下可形成二聚体，从而表现出比传统驱动蛋白更快且超常持续的运动能力10,11,12,13。对其生化与生物物理特性的研究需要大量高纯度且具有活性的蛋白样品。然而，在原核表达系统中表达时，这些蛋白往往以无活性或聚集状态存在，推测是由于原核系统在蛋白质合成、折叠和修饰机制方面与真核蛋白不兼容所致14,15,16,17,18。为克服上述限制并提高蛋白产量，本文建立了一种高效的Sf9-杆状病毒表达系统，用于表达和纯化此类驱动蛋白马达。
杆状病毒表达系统利用Sf9昆虫细胞系作为宿主系统，用于高通量真核重组蛋白的表达19,20杆状病毒具有一个强效的多角体蛋白启动子，可促进外源基因表达及可溶性重组蛋白的生产17由于其成本效益高、操作安全且能表达大量活性蛋白，已成为一种强大的工具21为了表达目标蛋白，一个关键步骤是构建重组杆状病毒基因组（bacmid）。由于 commercially available bacmid 生成试剂盒价格昂贵，且我们需要处理更多的样品，因此我们开发了一种实验室内部方案，用于将驱动蛋白-3（kinesin-3）马达结构域的大片段和小片段插入到 bacmid 中。所获得的 Sf9 细胞纯化的驱动蛋白-3 马达蛋白被用于后续表征。 体外 使用全内反射荧光（TIRF）显微镜研究单分子及多分子马达驱动的微管滑动特性。马达蛋白在其C末端标记三个串联的荧光分子（3xmCit），以增强信号强度并减少光漂白。由于TIRF成像具有较高的信噪比、较低的光毒性，并能选择性地对盖玻片附近极小区域进行成像，因此被广泛用于在单分子水平上观察蛋白质动态过程。 体内 和 体外.
本研究探讨利用Sf9-杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白-3分子马达的方法 体外 使用TIRF显微镜对分子马达进行单分子成像及多马达滑动分析。总体而言，本研究表明，Sf9纯化的马达蛋白的运动特性与从哺乳动物细胞裂解液中制备的马达蛋白相同。因此，我们认为Sf9-杆状病毒系统可被用于表达和纯化任何感兴趣的马达蛋白。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Sf9 细胞培养与转染材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 FLAG M2 亲和树脂</td><td>Biolegend</td><td>651502</td><td>用于蛋白纯化</td></tr><tr><td>抑肽酶（Aprotinin）</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td>用于蛋白纯化</td></tr><tr><td>Cellfectin</td><td>Invitrogen</td><td>10362100</td><td>用于 Sf9 细胞转染</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td>用于运动性分析和蛋白纯化</td></tr><tr><td>FLAG 肽段</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td>用于蛋白纯化</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>用于蛋白冷冻保存</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>用于 Sf9 细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>IGEPAL CA 630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>用于 Sf9 细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>用于蛋白纯化</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>用于裂解缓冲液配制</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>用于蛋白纯化</td></tr><tr><td>Sf9 细胞</td><td>由印度浦那印度科学教育与研究所 Thomas Pucadyil 博士惠赠</td><td></td><td>用于杆状病毒表达系统及蛋白纯化</td></tr><tr><td>Sf9 细胞培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>4115-0125</td><td>用于悬浮培养</td></tr><tr><td>Sf-900/SFM 培养基（1X）</td><td>Thermo Scientific</td><td>10902-096 -500ml</td><td>用于 Sf9 细胞培养</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S1888</td><td>用于配制 Sf9 细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>未添加补充物的 Grace&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>11595030 -500ml</td><td>用于 Sf9 细胞转染</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微管聚合与单分子分析材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2647</td><td>用于运动性与滑动分析</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>用于封闭运动性分析室</td></tr><tr><td>过氧化氢酶（Catalase）</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>用于运动性与滑动分析</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>用于溶解罗丹明</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>用于运动性与滑动分析</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>用于运动性与滑动分析</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td>用于微管聚合</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767</td><td>用于配制 PIPES 缓冲液（pH 6.9）</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td>用于配制运动性与滑动分析缓冲液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微管滑动分析材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G&amp;nbsp;针头</td><td>Dispovan</td><td></td><td>用于剪切微管</td></tr><tr><td>酪蛋白（Casein）</td><td>Sigma</td><td>C3400</td><td>用于微管滑动分析</td></tr><tr><td>GFP 纳米抗体</td><td>由美国明尼苏达大学 Sivaraj Sivaramakrishnan 博士惠赠</td><td></td><td>用于将马达蛋白固定于盖玻片</td></tr><tr><td>罗丹明</td><td>Thermo Scientific</td><td>46406</td><td>用于制备标记微管蛋白</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜及其他仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml、1.5 ml 和 2 ml 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化</td></tr><tr><td>10 ml&amp;nbsp;一次性无菌移液管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化</td></tr><tr><td>10 μl、200 μl、1 ml 移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化</td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化</td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Cole Palmer</td><td>15179-39</td><td>用于 Sf9 细胞培养</td></tr><tr><td>天平</td><td>Sartorious</td><td></td><td>量程：0.01 g - 300 g</td></tr><tr><td>台式轨道摇床培养箱</td><td>REMI</td><td></td><td>用于 28°C 下 Sf9 悬浮培养</td></tr><tr><td>相机</td><td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td><td></td><td>用于 TIRF 成像与图像采集</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Scotch</td><td></td><td>用于构建运动性分析室</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisherfinest</td><td>12-548-5A</td><td>尺寸：22×30</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Blue Star</td><td></td><td>用于构建运动性分析室</td></tr><tr><td>加热块</td><td>Neuation</td><td></td><td>用于溶解石蜡</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon Eclipse Ti-U</td><td></td><td>用于检测蛋白表达</td></tr><tr><td>激光器</td><td>488 nm（100 mW）</td><td></td><td>用于 TIRF 成像</td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td>用于样品冷冻与储存</td></tr><tr><td>微毛细管加样尖端</td><td>Eppendorf</td><td>EP022491920</td><td>用于剪切微管</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Eclipse Ti2-E，配备 DIC 装置</td><td></td><td>用于 TIRF 成像</td></tr><tr><td>小型离心机（Mini spin）</td><td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td><td></td><td>用于快速离心</td></tr><tr><td>物镜</td><td>100X TIRF 物镜，数值孔径 1.49，油浸</td><td></td><td>用于 TIRF 成像</td></tr><tr><td>Optima UltraCentrifuge XE</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>用于蛋白纯化</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Corning</td><td>Corning 430</td><td>用于调节 pH</td></tr><tr><td>移液器助吸器（Pipette-boy）</td><td>VWR</td><td></td><td>用于 Sf9 细胞培养与蛋白纯化</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>用于蛋白纯化</td></tr><tr><td>Sorvall ST8R 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>用于蛋白纯化</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于微管聚合</td></tr><tr><td>超速离心转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>SW60Ti 转子</td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman</td><td></td><td>5 mL，开口薄壁透明超速离心管，13 × 51 mm</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Neuation</td><td></td><td>用于样品混匀</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma</td><td>V001228</td><td>用于密封运动性分析室</td></tr></tbody></table>

单分子分析sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

复杂的细胞环境为单分子运动分析带来了挑战。然而，成像技术的进步显著推动了单分子研究的发展，并在检测和理解荧光标记分子动态行为方面获得了广泛应用。本文详细描述了一种方法&#160;体外 使用全内反射荧光（TIRF）显微镜对驱动蛋白-3家族马达进行单分子研究。驱动蛋白-3是一个庞大的家族，在从细胞内货物运输、细胞分裂到发育等多种细胞和生理功能中发挥关键作用。我们先前已证明，在哺乳动物细胞中表达驱动蛋白并制备细胞裂解液后，通过单分子水平的研究发现，组成性活化的二聚体驱动蛋白-3马达表现出快速且超程性的运动特性，并具有高微管亲和力。本实验室采用细胞生物学、生物化学和生物物理方法研究驱动蛋白-3马达及其调控机制，此类研究需要大量纯化的蛋白质。若使用哺乳动物细胞表达和纯化这些马达蛋白，成本高昂且耗时；而在原核表达系统中表达则导致蛋白显著聚集&#160;非活性蛋白。为了克服细菌表达系统和哺乳动物细胞裂解液纯化系统所带来的局限性，我们建立了稳定的Sf9-杆状病毒表达系统，用于表达和纯化这些分子马达。驱动蛋白-3（kinesin-3）马达在C末端连接了3个串联的荧光蛋白标签（3xmCitrine或3xmCit），可提供更强的信号并减少光漂白。 体外 使用Sf9纯化蛋白进行的单分子与多马达滑动分析表明，驱动蛋白-3马达具有快速且超程性的特征，这与我们先前使用哺乳动物细胞裂解液的研究结果相似。这些检测方法的其他应用包括深入了解马达蛋白的寡聚状态、与生物化学研究相对应的特异性结合伴侣，以及其动力学状态。

为了利用Sf9-杆状病毒表达系统大规模表达和纯化具有活性和功能的重组运动蛋白，需要先生成稳定携带编码序列的病毒颗粒，以感染Sf9细胞。为此，将编码KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG的重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞中。72小时后，大量细胞显示出绿色荧光蛋白（mCitrine）的表达，并伴有细胞和细胞核的增大（图1 和 图2），表明已成功生成病毒颗粒（P0代）。随后，通过用较大体积的P0代病毒颗粒感染新鲜的Sf9细胞群体，进一步扩增病毒，以制备可用于储存和大规模感染的P1代病毒储备液。为纯化驱动蛋白-3（kinesin-3）马达结构域，使用1 mL P1代病毒颗粒感染30 mL Sf9细胞培养物。感染72小时后，收集强烈表达绿色荧光蛋白的细胞，进行裂解，并利用连接有抗FLAG抗体的树脂，通过C端FLAG标签亲和层析进行纯化。有趣的是，向结合了驱动蛋白-3马达的树脂中加入FLAG肽后，大部分目标蛋白以单个洗脱组分被洗脱下来，所得纯化蛋白纯度很高，在图3</stro...

本研究详细描述了利用Sf9-杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白-3家族成员KIF1A(1-393LZ)的方法。体外对这些纯化的马达蛋白进行单分子及多马达滑动分析，结果显示其运动特性 robust，与来源于哺乳动物细胞裂解液的马达蛋白相当。因此，Sf9-杆状病毒系统适用于目标马达蛋白的表达与纯化。

单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

复杂的细胞环境为单分子运动分析带来了挑战。然而，成像技术的进步已经改善了……

该方案提供了一种利用Sf9杆状病毒系统纯化活性分子马达的简便方法，并详细描述了用于研究马达蛋白调控机制的单分子运动性和多马达滑动实验。通过传统的载体表达、Sf9杆状病毒表达及单步亲和纯化，可获得高纯度且具有活性的马达蛋白，用于在单分子和多马达体系中深入研究超进程性驱动蛋白的作用机制。除了驱动蛋白马达外，该方案还可用于研究其他基于细胞骨架的蛋白质（如动力蛋白和肌球蛋白）的生物化学与生物物理特性。该方案详细且易于操作。建议小心处理Sf9细胞，因其容易受到污染，并应遵循方案中提供的各项说明。视觉演示非常有效，易于跟随和理解关键步骤，尤其对于从未进行过这些检测的研究人员而言。实验操作将由我的博士生Pushpanjali Soppina和Dipeshwari Shewale博士进行示范。首先，在35毫升培养皿中以每毫升4.5×10⁵个细胞的密度接种细胞。24 小时后，将 1 微克杆状病毒 DNA 与 100 微升未添加补充物的 Grace 培养基在一支试管中混合。在另一支试管中，将 6 微升转染试剂与 100 微升未添加补充物的 Grace 培养基混合。小心地将第一支试管中的内容物转移至第二支试管中。混合后，室温孵育45分钟。向混合物中加入0.8毫升未添加补充物的Grace's培养基。混匀后，吸除细胞中的Sf900 SFM培养基。将制备好的转染培养基逐滴加入细胞表面，28摄氏度孵育6小时。然后小心移除转染混合物，加入2毫升SF900无血清培养基，继续在28摄氏度孵育48小时。接下来，在倒置荧光显微镜下检测马达蛋白的表达情况。收集含有感染细胞的培养基，在500 × g条件下离心5分钟，收集上清液并将等分试样迅速冷冻。在无菌的100毫升锥形瓶中加入10毫升SF900 SFM培养基和细胞，以及1毫升P-zero病毒原液。在28摄氏度下以90 rpm持续振荡培养。72小时后，在15毫升无菌锥形管中以500 ×g离心5分钟，沉淀细胞并收集上清液。进行大规模蛋白表达时，用1毫升P1病毒原液感染30毫升悬浮培养物。感染后72小时，检测细胞中的蛋白表达，并将细胞收集至无菌的50毫升锥形管中。离心后弃去上清液，收集细胞沉淀。为裂解细胞，向细胞沉淀中加入3毫升预冷的裂解缓冲液。在 4°C 条件下，以 150,000 G 离心细胞裂解液 30 分钟。收集上清液，并与 40 微升 50% ANTI-FLAG M2 亲和树脂混合。将混合物在 4°C 下轻轻翻转孵育 3 小时。现在将 FLAG 树脂在 4°C 条件下以 500 G 离心 1 分钟，形成沉淀。用预冷的洗涤缓冲液洗涤 FLAG 树脂沉淀 3 次。第三次洗涤后，小心吸除洗涤缓冲液。接下来，向树脂沉淀中加入70 µL含有100 µg/mL FLAG肽的洗涤缓冲液，并在4°C下孵育过夜，操作方式如前所述。离心后，将含有纯化蛋白的上清液收集至新的离心管中。按照论文中所述配制聚合反应混合液，并向聚合反应体系中加入10 µL微管蛋白。将离心管放入已预热至37摄氏度的金属浴中，孵育30分钟。在配制好微管稳定缓冲液后，将其预热并加入已聚合的微管中。待运动性流动池室制备完成后，向其中注入30微升稀释的微管溶液。孵育30分钟后，加入40至50微升封闭缓冲液并继续孵育。制备运动混合液，并向其中加入1微升纯化的马达蛋白。充分混匀后，将溶液注入运动分析室中。封闭运动室的两端，并在TIRF照明下进行成像。聚焦于单个mCitirine标记的马达蛋白，观察其持续运动的过程。将罗丹明标记的微管蛋白与未标记的微管蛋白按1:10的比例混合。聚合30分钟后，轻轻加入30微升预热的微管稳定缓冲液，在37摄氏度下继续孵育5分钟。使用毛细管上样头通过移液吹打剪切微管。在制备好运动流室后，加入50微升Sf9纯化的GFP纳米抗体，孵育30分钟。通过注入50微升封闭缓冲液封闭盖玻片表面。准备50微升的马达混合液。轻轻混匀溶液后将其注入反应室，孵育30分钟。用50微升P12-酪蛋白将反应室清洗两次。制备滑动测定混合液，轻轻混匀后注入运动室。密封运动室两端，在TIRF照明下观察微管滑动。转染48小时后，未转染的细胞呈小而圆且牢固贴壁。然而，表达蛋白的转染细胞则与表面松散贴附，并显示出增大的细胞直径。转染72小时后，超过90%的Sf9细胞表达了荧光标记的驱动蛋白-3家族分子马达KIF1A，且细胞与表面结合松散。从转染的Sf9细胞中纯化出驱动蛋白-3（kinesin-3）马达蛋白。该时空图显示驱动蛋白-3沿微管表面持续行走的过程。运动事件的平均速度和运行长度分别约为2.44 µm/s和10.79 µm。显微图像显示，驱动蛋白-3马达能够平稳地驱动微管滑动，平均速度约为1.37微米每秒。最关键的是在添加稳定缓冲液时不要扰动微管混合物，同时避免对微管产生剪切力。该实验方案也可用于其他应用，如ATP酶活性测定、生物物理分析、作用机制研究、体外重构实验等。利用sf9纯化的马达蛋白，我们最近证明了驱动蛋白-3（kinesin-3）具有快速且超常的持续运动能力。有趣的是，与已被充分表征的驱动蛋白-1（Kinesin-1）相比，这些马达蛋白表现出更高的ATP turnover速率。

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Research

科研

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生物化学

Sf9纯化超加工驱动蛋白-3系列电机的单分子分析

本方案旨在从黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中分离具有活性的全长驱动蛋白，用于单分子生物物理研究。我们展示了如何收集胚胎、制备胚胎裂解液，并随后聚合微管（MTs）。通过将驱动蛋白固定在微管上，离心沉淀驱动蛋白-微管复合物，再通过添加ATP将驱动蛋白从微管上释放，从而实现驱动蛋白的纯化。...

从Drosophila胚胎中分离与纯化驱动蛋白

囊泡或细胞器等货物的细胞内运输由分子马达蛋白沿极性微管进行。本方案描述了神经元内单个货物颗粒运输方向性与其相关马达蛋白的种类和相对含量之间的关联分析方法。...

利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

本文介绍了一种鉴定驱动蛋白-1（Kinesin-1）货物分子的实验方案。驱动蛋白-1重链（KIF5B）的一种无马达功能突变体会在细胞质中形成聚集体，并诱导其货物分子共同聚集。通过荧光显微镜可同时检测到这两类聚集体。该策略同样可用于鉴定其他马达蛋白的货物分子。...

利用荧光显微镜鉴定驱动蛋白-1的货物分子

本文展示了如何在活体运动神经末梢上进行单分子光激活定位显微镜成像 黑腹果蝇...

体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

我们提出一种构建分子穿梭装置的方案，其中表面附着的驱动蛋白马达推动带有染料标记的微管。驱动蛋白与表面之间的弱相互作用使其能够可逆地附着于表面，从而形成一种纳米尺度系统，该系统在保持功能完整性的同时，展现出组分的动态组装与解聚行为。...

组装由可逆附着驱动蛋白驱动的分子穿梭器

本实验方案的目的是在DNA折纸纳米结构上组装分子马达的集合体，并利用全内反射荧光显微镜观察该集合体的运动行为。...

在DNA折纸纳米结构上构建动力蛋白与驱动蛋白马达复合体用于单分子观测

双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8...

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本文介绍了一种用于单分子水平高精度FRET实验的方案。此外，该方法还可用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域中的三种构象状态。精确测定距离是基于FRET实验构建结构模型的第一步。...

单分子水平高精度FRET用于生物大分子结构测定

本文报道了一种用于操控G-四链体的单分子磁镊平台，该平台可用于研究G4的稳定性及其受多种蛋白质调控的机制。...

利用磁镊对G-四链体进行单分子操控

学习使用Sf9杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白KIF1A，并通过单分子运动性和多电机滑行实验研究其调控机制。该方法适用于细胞骨架蛋白的生物物理特性分析。

单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

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