单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

该方案提供了一种利用Sf9杆状病毒系统纯化活性分子马达的简便方法，并详细描述了用于研究马达蛋白调控机制的单分子运动性和多马达滑动实验。通过传统的载体表达、Sf9杆状病毒表达及单步亲和纯化，可获得高纯度且具有活性的马达蛋白，用于在单分子和多马达体系中深入研究超进程性驱动蛋白的作用机制。

除了驱动蛋白马达外，该方案还可用于研究其他基于细胞骨架的蛋白质（如动力蛋白和肌球蛋白）的生物化学与生物物理特性。该方案详细且易于操作。建议小心处理Sf9细胞，因其容易受到污染，并应遵循方案中提供的各项说明。

视觉演示非常有效，易于跟随和理解关键步骤，尤其对于从未进行过这些检测的研究人员而言。实验操作将由我的博士生Pushpanjali Soppina和Dipeshwari Shewale博士进行示范。首先，在35毫升培养皿中以每毫升4.5×10⁵个细胞的密度接种细胞。

24 小时后，将 1 微克杆状病毒 DNA 与 100 微升未添加补充物的 Grace 培养基在一支试管中混合。在另一支试管中，将 6 微升转染试剂与 100 微升未添加补充物的 Grace 培养基混合。小心地将第一支试管中的内容物转移至第二支试管中。

混合后，室温孵育45分钟。向混合物中加入0.8毫升未添加补充物的Grace's培养基。混匀后，吸除细胞中的Sf900 SFM培养基。

将制备好的转染培养基逐滴加入细胞表面，28摄氏度孵育6小时。然后小心移除转染混合物，加入2毫升SF900无血清培养基，继续在28摄氏度孵育48小时。

接下来，在倒置荧光显微镜下检测马达蛋白的表达情况。收集含有感染细胞的培养基，在500 × g条件下离心5分钟，收集上清液并将等分试样迅速冷冻。在无菌的100毫升锥形瓶中加入10毫升SF900 SFM培养基和细胞，以及1毫升P-zero病毒原液。

在28摄氏度下以90 rpm持续振荡培养。72小时后，在15毫升无菌锥形管中以500 ×g离心5分钟，沉淀细胞并收集上清液。进行大规模蛋白表达时，用1毫升P1病毒原液感染30毫升悬浮培养物。

感染后72小时，检测细胞中的蛋白表达，并将细胞收集至无菌的50毫升锥形管中。离心后弃去上清液，收集细胞沉淀。为裂解细胞，向细胞沉淀中加入3毫升预冷的裂解缓冲液。

在 4°C 条件下，以 150,000 G 离心细胞裂解液 30 分钟。收集上清液，并与 40 微升 50% ANTI-FLAG M2 亲和树脂混合。将混合物在 4°C 下轻轻翻转孵育 3 小时。

现在将 FLAG 树脂在 4°C 条件下以 500 G 离心 1 分钟，形成沉淀。用预冷的洗涤缓冲液洗涤 FLAG 树脂沉淀 3 次。第三次洗涤后，小心吸除洗涤缓冲液。

接下来，向树脂沉淀中加入70 µL含有100 µg/mL FLAG肽的洗涤缓冲液，并在4°C下孵育过夜，操作方式如前所述。离心后，将含有纯化蛋白的上清液收集至新的离心管中。按照论文中所述配制聚合反应混合液，并向聚合反应体系中加入10 µL微管蛋白。

将离心管放入已预热至37摄氏度的金属浴中，孵育30分钟。在配制好微管稳定缓冲液后，将其预热并加入已聚合的微管中。待运动性流动池室制备完成后，向其中注入30微升稀释的微管溶液。

孵育30分钟后，加入40至50微升封闭缓冲液并继续孵育。制备运动混合液，并向其中加入1微升纯化的马达蛋白。充分混匀后，将溶液注入运动分析室中。

封闭运动室的两端，并在TIRF照明下进行成像。聚焦于单个mCitirine标记的马达蛋白，观察其持续运动的过程。将罗丹明标记的微管蛋白与未标记的微管蛋白按1:10的比例混合。

聚合30分钟后，轻轻加入30微升预热的微管稳定缓冲液，在37摄氏度下继续孵育5分钟。使用毛细管上样头通过移液吹打剪切微管。在制备好运动流室后，加入50微升Sf9纯化的GFP纳米抗体，孵育30分钟。

通过注入50微升封闭缓冲液封闭盖玻片表面。准备50微升的马达混合液。轻轻混匀溶液后将其注入反应室，孵育30分钟。

用50微升P12-酪蛋白将反应室清洗两次。制备滑动测定混合液，轻轻混匀后注入运动室。密封运动室两端，在TIRF照明下观察微管滑动。

转染48小时后，未转染的细胞呈小而圆且牢固贴壁。然而，表达蛋白的转染细胞则与表面松散贴附，并显示出增大的细胞直径。转染72小时后，超过90%的Sf9细胞表达了荧光标记的驱动蛋白-3家族分子马达KIF1A，且细胞与表面结合松散。

从转染的Sf9细胞中纯化出驱动蛋白-3（kinesin-3）马达蛋白。该时空图显示驱动蛋白-3沿微管表面持续行走的过程。运动事件的平均速度和运行长度分别约为2.44 µm/s和10.79 µm。

显微图像显示，驱动蛋白-3马达能够平稳地驱动微管滑动，平均速度约为1.37微米每秒。最关键的是在添加稳定缓冲液时不要扰动微管混合物，同时避免对微管产生剪切力。该实验方案也可用于其他应用，如ATP酶活性测定、生物物理分析、作用机制研究、体外重构实验等。

利用sf9纯化的马达蛋白，我们最近证明了驱动蛋白-3（kinesin-3）具有快速且超常的持续运动能力。有趣的是，与已被充分表征的驱动蛋白-1（Kinesin-1）相比，这些马达蛋白表现出更高的ATP turnover速率。