生成人诱导性多能干细胞来源的2型肺泡上皮细胞的三维球体及二维气液界面培养模型

本方案概述了一种培养和传代肺部重要细胞群体的方法，并建立了一个与生理相关的环境暴露研究平台。该技术的主要优势在于可用于研究肺部生物学，特别是在稳态和疾病背景下的研究。该方法可提供深入见解，尤其有助于研究影响肺泡的肺部疾病，包括由遗传变异、环境暴露、病原体感染或这些因素共同作用所引起的疾病。

演示该操作的将是我本人以及 Rhiannon Werder，在 Kristy Abo（医学博士与哲学博士在读学生）和 Olivia Hix（本实验室的实验室主管）的协助下完成。首先，吸除12孔板中含肺泡球体的三维基质液滴内的全部CK DCI培养基。每滴加入1毫升的中性蛋白酶（dispase）。

使用P-1000移液器将液滴轻柔地吹打至dispase溶液中。孵育后，将dispase中一个基质液滴内的解离类器官转移至15毫升锥形管中。加入10毫升Iscove改良Dulbecco培养基，在室温下以300 × g离心5分钟。

尽可能吸除上清液。将细胞重悬于每滴1毫升的0.05%胰蛋白酶中，并转移回12孔板。在37°C孵育12至15分钟，随后在显微镜下观察细胞解离情况，避免对细胞进行过度吹打。

孵育结束后获得单细胞悬液。加入等体积含胎牛血清的培养基以终止胰蛋白酶的作用，随后在300 × g离心5分钟。用10毫升IMDM洗涤细胞，然后进行下一次离心。

用适当体积的溶液重悬细胞以进行计数。然后使用血细胞计数板对细胞进行计数。通过将iAT2细胞的单细胞悬液接种于3D基质中或接种于用于气液界面培养的细胞培养小室上，生成肺泡类球体。

计数细胞后，确定需重悬于3D基质中的目标细胞数量，并在室温下以300 × g离心5分钟。用移液器尽可能吸除上清液，并迅速将细胞重悬于3D基质中。使用P-200移液器将一滴3D基质加入预热的12孔板的孔中，注意避免在基质液滴中产生气泡；在加样多个液滴时，应避免细胞悬液发生沉降。

将培养板置于37摄氏度培养箱中孵育20至30分钟，使基质液滴聚合，然后每孔加入1毫升含10 µM Y-27632的CK DCI培养基以覆盖基质液滴。72小时后更换为不含10 µM Y-27632的CK DCI培养基，并每隔48至72小时更换一次新鲜CK DCI培养基。使用前一小时，通过将2D基质用Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12稀释至工作浓度，制备新鲜包被的6.5毫米细胞培养小室插入物。

然后每6.5毫米的细胞培养小室中加入100微升稀释后的基质。将基质置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟，或在室温下放置1小时，使其聚合。使用移液器吸除细胞培养小室中多余的基质。

用DMEM F-12冲洗，加入细胞前立即吸除洗涤液。以300 × g离心5分钟，尽可能去除上清液。用适当体积的溶液重悬细胞，使每孔细胞培养插入物中加入含10 μmol/L Y-27632的100 μL CK DCI，并向细胞培养插入物的顶端室加入100 μL细胞悬液。

轻轻以十字模式振荡培养板，确保细胞均匀分布，并在10倍物镜下显微镜检查。向每个细胞培养小室的基底外侧加入500 µL含10 µmol/L Y-27632的CK DCI培养基。接种后48小时，用移液器吸除顶端培养基，以建立气液界面。72小时后，将基底外侧培养基更换为不含10 µmol/L Y-27632的CK DCI培养基，之后每48至72小时用新鲜CK DCI培养基替换基底外侧培养基，持续至接种后28天。

代表性流式细胞术结果展示了SPC2细胞系在培养过程中对表面活性蛋白C内源性位点靶向的tdTomato报告基因的可视化便利性，以及随时间追踪2型肺泡上皮细胞程序的能力。当将诱导多能干细胞来源的2型肺泡细胞以球体形式重新接种于三维基质中或接种于细胞培养小室上时，其表面活性蛋白C的tdTomato表达得以维持。可通过测量跨上皮电阻来评估气液界面培养模型的完整性。

在进行此操作时，应避免通过机械吹打或酶消化造成过度解离，因为这可能导致细胞活力低下和存活率差。此操作之后可进行的其他方法包括跨上皮电阻测量以评估屏障完整性、添加病毒或化合物以刺激细胞、免疫荧光检测，以及收集RNA、蛋白质或上清液。该技术为研究人员探索新的肺部生物学和疾病相关问题铺平了道路，例如SARS-CoV-2病毒或电子烟雾等化合物如何影响肺泡上皮。