Name: 结核分枝杆菌 通过尺寸排阻色谱实现细胞外囊泡富集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习使用尺寸排阻色谱法从结核分枝杆菌培养上清液中富集细胞外囊泡。该方法操作简便、重复性好，可获得高产量且非囊泡蛋白污染极低的Mtb EVs，适用于下游组学分析和功能研究。

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我们感谢兽医与生物医学科学学院实验奖和学院研究委员会共享研究计划对 NKG 的支持，以及 ATCC 对 KMD 的资助（项目编号 # 2016-0550-0002）。我们还感谢 Anne Simpson 提供的技术支持，以及 BEI Resources、NIAID、NIH 提供以下试剂：抗结核分枝杆菌 LpqH（基因 Rv3763）单克隆抗体，IT-54（体外生产），NR-13792；抗结核分枝杆菌 GroES（基因 Rv3418c）单克隆抗体，克隆株 IT-3（SA-12）（体外生产），NR-49223；以及抗结核分枝杆菌 LAM 单克隆抗体，克隆株 CS-35（体外生产），NR-13811。

科罗拉多州立大学机构生物安全委员会批准了本研究（19-046B）。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的培养及富含细胞外囊泡的培养上清液的收集均由经过培训的人员在高等级生物安全实验室中进行。在经过有效的灭活方法处理，并经机构生物安全政策确认和批准后，材料方可移出高生物安全 containment 区域。在重复本实验方案时，若无法实施经验证的灭活或无菌过滤方法，则后续所有操作必须在高等级生物安全实验室中进行。
1. 结核分枝杆菌囊泡粗提物的制备
注意：有关结核分枝杆菌（Mtb）培养及培养滤过蛋白（CFP）制备的详细步骤，请参见参考文献11,12。建议细菌培养基中不含含有细胞外囊泡（EV）或蛋白质成分的生长补充剂（如油酸白蛋白葡萄糖催化酶，OADC）以及吐温类去垢剂。同时建议对细菌培养物的质量及收获的CFP进行检测，以确保细胞死亡和裂解程度有限13,14。
<ol>
	<li>通过加入磷酸盐缓冲液（1× PBS）至100 kDa分子量截留值（MWCO）离心过滤器的满容量，准备该过滤器（参见材料表）。在4 °C条件下，以2,800 × g离心5分钟。 
	注意：若使用无死体积限位的过滤器，需特别注意避免样品体积减少至低于滤膜水平，导致离心过程中滤膜完全干燥。</li>
	<li>弃去滤过液及残留的PBS，然后将Mtb CFP加至样品室的最大容量。在4 °C条件下，以2,800 × g离心，直至体积减少至超滤装置的最小体积。根据需要重复此步骤，继续向装置中添加CFP，直至整个样品充分浓缩。 
	注意：如需用于后续鉴定，可保留部分100 kDa滤过液（100F）材料。储存于4 °C。</li>
	<li>向含有浓缩物的过滤器中加入1× PBS至装置的总容量。按步骤1.2所述方法再次浓缩体积。重复此步骤五次，以确保充分洗涤和缓冲液置换。</li>
	<li>根据超滤装置的说明书回收100 kDa浓缩后的CFP截留物（100R）（参见材料表）。回收100R后，用最小体积的1× PBS至少冲洗滤膜三次，并将冲洗液与100R合并，以最大化回收率。</li>
	<li>按照制造商说明，使用二辛可宁酸法（BCA）对100R材料进行定量（参见材料表）。进行测定时，将样品用PBS稀释为1:2、1:5和1:10多个稀释度，并每个样品设三个重复。 
	&#8203;注意：如需用于后续鉴定，可保留部分100R材料。储存于4 °C。</li>
</ol>
2. 利用尺寸排阻色谱法从CFP中富集结核分枝杆菌EV
注意：以下步骤专为使用 3 mg 的 100R Mtb CFP 并结合 SEC 柱和自动组分收集器（AFC，参见材料表）而设计。用户可根据起始浓度和色谱柱类型的不同，参照制造商的说明对本方案进行相应调整。此外，建议用户阅读并理解自动组分收集器的使用手册。
<ol>
	<li>让SEC柱在室温下平衡。</li>
	<li>使用塔式单元背面的电源开关打开AFC，并在主菜单触摸屏上按SETUP，根据需要调整称重传感器的设置。称重传感器仅在首次使用、每次软件更新后，或发现收集的组分体积不一致时才需校准。</li>
	<li>在SETUP界面中，选择CAROUSEL &#62; CALIBRATE以校准转盘。将带有13个小孔且孔朝上的转盘插入AFC塔中，并通过按-和/或+按钮调整转盘位置，使液体喷嘴正对冲洗位置。</li>
	<li>取下已平衡的SEC柱的盖帽。将SEC柱滑入合适的柱架中，并小心地安装到AFC塔上。确保柱上的射频识别（RFID）标签朝向AFC，并检查柱与阀门之间的连接是否牢固。将废液出口管放入收集容器中。</li>
	<li>在SETUP界面中，选择Collection Schedule，通过按-和/或+按钮将计数设为13，体积设为0.5 mL。将&#34;Buffer Volume&#34;设置保留默认值2.7 mL，然后按X关闭&#34;Collection Schedule&#34;窗口。</li>
	<li>从主界面选择START COLLECTION，并选择YES确认收集参数。将13个已标记、开盖且管口朝向转盘中心的1.7 mL微量离心管装入转盘。</li>
	<li>选择OK启动AFC，然后安装柱储液罐并再次按OK推进。按YES选择冲洗柱的选项，并加入一个柱体积的0.2 µm滤过的PBS以去除任何保存缓冲液。冲洗完成后，按OK继续推进AFC。</li>
	<li>将转盘盖盖在AFC上，然后按OK。准备一个柱体积的0.2 µm滤过的PBS。使用移液器去除柱中多余的缓冲液。</li>
	<li>将步骤1.5中定量的3 mg 100R样品用1x PBS定容至500 µL。将3 mg样品加至柱顶部。推进AFC，使样品流入筛板。待样品完全进入柱后，将步骤2.6中准备的PBS加入储液罐中。</li>
	<li>监测AFC运行过程，其将首先收集空体积，然后按指定收集各组分。运行结束后，转盘返回废液位置，取下盖子，并从转盘中取出各组分管。在定量（步骤3）和定性（步骤4）前，将组分储存于4 °C。</li>
	<li>若需重复使用该柱，请按YES选择清洗柱的选项；否则按NO。请遵循AFC上的操作说明。 
	&#8203;注：柱经清洗且保存缓冲液流过后，可将其取下、加盖，并在4 °C下储存。</li>
</ol>
3. 结核分枝杆菌EVs的定量
<ol>
	<li>使用BCA法和微BCA法测定各组分的蛋白质浓度12。
	<ol>
		<li>对于从3 mg 100R Mtb CFP中收集的0.5 mL组分，对每份样品的第1–7号组分进行三份平行测定，使用微BCA法并按1:3比例稀释。</li>
		<li>对于第5–13号0.5 mL组分，每份样品进行三份平行测定，使用BCA法且不稀释。 
		注：对第5–7号组分同时进行两种检测，有助于确保所有组分均获得可读结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用纳米颗粒追踪分析（NTA）定量各组分的颗粒浓度。
	<ol>
		<li>将样品用1 mL 1× PBS稀释，建议起始稀释比例如下：第1–3号组分使用1:100稀释，其余组分使用1:10稀释。</li>
		<li>涡旋振荡稀释后的溶液，然后将样品吸入1 mL一次性注射器中。如有条件，将注射器置于自动注射泵中。</li>
		<li>设置注射泵流速为30 µL/min，视频采集参数设为屏幕增益10–12，相机水平10–12，并为每个样品调节焦距。</li>
		<li>以恒定流速连续采集至少三个视频，每个视频时长30秒。</li>
		<li>使用软件进行分析时，检测阈值设为5。 
		&#8203;注：若不消耗大量样品体积，可能无法获得最晚洗脱组分（&#62;7）的NTA数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 结核分枝杆菌囊泡的鉴定
<ol>
	<li>使用银染蛋白凝胶观察各组分的总蛋白谱。 
	注意：SDS-PAGE 和银染的详细操作步骤参见参考文献15。
	<ol>
		<li>向每种组分各取 10 µL，以及 5 µg 的 CFP、100R 和 100F 中加入 SDS 上样缓冲液，在 100 °C 下煮沸 5 分钟，随后上样至 4%–12% Bis-Tris 凝胶，并使用蛋白分子量标记物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（见材料表）。</li>
		<li>使用 1× 2-[N-吗啉代]乙磺酸（MES）电泳缓冲液（见材料表），在 200 V 电压下电泳 35 分钟。</li>
		<li>从凝胶夹中取出凝胶，并进行银染染色15。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过蛋白质印迹法（Western blot）评估各组分中外泌体（EV）标志物的存在与否。 
	注意：蛋白质印迹法的详细操作步骤参见参考文献15。
	<ol>
		<li>按照步骤 4.1.1–4.1.2 所述进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。</li>
		<li>从凝胶夹中取出凝胶，将分离后的蛋白在 50 V 电压下转移至 0.2 µm 硝酸纤维素膜（见材料表），转移时间至少为 1 小时。</li>
		<li>进行 Western blot 分析以检测目标蛋白，推荐使用针对 LpqH、脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）和 GroES 的一抗（见材料表）。</li>
		<li>根据标志物的有无情况，按下游应用需求合并相应组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）确认完整囊泡的存在。
	<ol>
		<li>向 15 µL 囊泡样品中加入 15 µL 4% 电镜级多聚甲醛进行固定，4 °C 过夜保存。</li>
		<li>准备 200 目的 Formvar-碳包被铜 TEM 载网，清洁表面并制成亲水性基底。 
		注意：建议使用 95% 氩气、5% 氧气、30% 等离子功率进行等离子清洗 1 分钟。</li>
		<li>将 10 µL 固定后的样品滴加到载网上，静置 10 分钟使样品吸附，然后用滤纸吸去多余液体。</li>
		<li>将载网在超纯水液滴上漂浮 30 秒，随后吸去多余液体。</li>
		<li>将载网在 d% 电镜级醋酸铀液滴上漂浮 2 分钟，然后吸去多余液体。</li>
		<li>让载网在空气中彻底干燥。</li>
		<li>使用透射电子显微镜（TEM）（见材料表）在 100 kV 或类似条件下成像。 
		注意：应根据下游应用选择其他外泌体（EV）定量与表征方法。建议参考《细胞外囊泡研究的最低信息标准》18 指南，以确保所有 EV 研究的严谨性和可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Mycobacterium tuberculosis 的细胞外囊泡是高度抗原性的储存库，使其成为开发诊断工具和未来疫苗的有吸引力的方向4,19,20。传统上，密度梯度超速离心法被用于将结核分枝杆菌（Mtb）的细胞外囊泡（EVs）与其他可溶性分泌物质分离8。尽管该方法有效，但耗时较长、技术难度高，且可能影响最终EV制备物的完整性9,10。本方案提供了一种通过尺寸排阻色谱法（SEC）制备Mtb EV的替代方法。
该方法的成功有几个关键点。初始的结核分枝杆菌（Mtb）无细胞滤液（CFP）制备将影响后续尺寸排阻色谱（SEC）所得囊泡的质量和产量。建议在对数生长期中期或之前收获CFP，以限制收获时细胞裂解的程度。迟缓期和稳定期...

病原体释放的细胞外囊泡（EV）可能是解锁控制传染病新技术的关键1。结核分枝杆菌（Mtb）是一种具有重大影响的病原体，感染了全球约三分之一的人口，每年导致数百万人死亡2。尽管已有大量文献记录Mtb能够产生EV，但这些EV在感染过程中的生物合成机制及其多种功能（例如免疫刺激、免疫抑制、铁和营养获取）仍不明确3,4,5。对Mtb EV组成的研究揭示其为直径50–150 nm的脂质膜包被小球，来源于质膜，含有具有免疫学意义的脂质和蛋白质3,6。对Mtb EV在细菌生理学中作用的研究表明，细菌EV在响应环境压力以维持生存方面具有重要的调控作用5。宿主-病原体相互作用的研究解释起来更为复杂，但已有证据表明，Mtb EV可影响宿主的免疫反应，并可能作为有效的疫苗组分3,4,7。
迄今为止，大多数关于结核分枝杆菌（Mtb）细胞外囊泡（EVs）的研究均依赖密度梯度超速离心法来富集囊泡8。该方法在小规模研究中是有效的；然而，该技术存在若干技术和操作上的挑战。替代的工作流程通常结合多步离心法，先去除完整细胞和大颗粒碎片，最后通过超速离心步骤沉淀EVs。该方法的效率可能差异较大，常导致产量较低，并伴随可溶性非囊泡相关生物分子的共纯化，同时可能影响囊泡的完整性9。此外，该过程耗时较长，依赖大量人工操作，且由于设备限制，通量非常有限。
本方案描述了一种密度梯度超速离心的替代技术：尺寸排阻色谱法（SEC）。该方法此前已用于环境分枝杆菌，而在本研究中已将其拓展应用于结核分枝杆菌（Mtb）10。使用市售色谱柱和自动组分收集器可提高囊泡制备的一致性，并减少对特定昂贵设备的依赖。与密度梯度超速离心相比，该方案可在更短的时间内完成，显著提高实验通量。该技术操作难度较低，易于掌握，有助于提升实验室间和实验室内的可重复性。最后，SEC具有高分离效率，且过程温和，能够保持囊泡的完整性。

<table><tbody><tr><td>20x MES SDS 电泳缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>自动组分收集器</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark 预染蛋白 Marker</td><td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - 70 离心过滤器，截留分子量 100 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>步骤 1.1 中使用的超滤装置</td></tr><tr><td>电转印系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>电镜级多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/碳膜 200 目铜网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF200H-Cu-TA</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG H&amp;L（碱性磷酸酶），全分子，1 mL</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>二抗</td></tr><tr><td>JEM-1400 透射电子显微镜</td><td>JOEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗-&lt;em&gt;Mycobacterium tuberculosis&lt;/em&gt; GroES（基因 Rv3814c）</td><td>BEI Resources</td><td>NR-49223</td><td>一抗</td></tr><tr><td>单克隆抗-&lt;em&gt;Mycobacterium tuberculosis&lt;/em&gt; LpqH（基因 Rv3763）</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13792</td><td>一抗</td></tr><tr><td>单克隆抗-&lt;em&gt;Mycobacterium tuberculosis&lt;/em&gt; LAM，克隆 CS-35</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13811</td><td>一抗</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Fischione Instruments</td><td></td><td>用于透射电镜铜网的等离子清洗</td></tr><tr><td>配备注射泵及安装 NanoSight NTA 软件计算机的 Nanosight 仪器</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜，卷状，0.2 &amp;mu;m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV Original 35 nm 5/包</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>SEC 柱</td></tr><tr><td>SDS 上样缓冲液</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>本实验采用实验室自配配方，但该产品等效</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 凝胶电泳槽</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>银染增强试剂盒</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>本实验采用实验室自建方案，但该试剂盒等效</td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis 通过尺寸排阻色谱法富集细胞外囊泡

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

细胞外囊泡（EVs）在细菌感染背景下的作用已成为理解微生物生理学的一个新方向。具体而言，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的EVs在宿主-病原体相互作用以及对环境应激的响应中发挥重要作用。Mtb EVs还具有高度抗原性，显示出作为疫苗组分的潜力。目前纯化Mtb EVs最常用的方法是密度梯度超速离心法。该方法存在若干局限性，包括通量低、得率低、依赖昂贵设备、技术难度高，且可能对最终制备物产生不利影响。尺寸排阻色谱法（SEC）是一种更为温和的替代方法，可克服超速离心法的诸多缺点。本实验方案表明，SEC可用于高效富集Mtb EVs，快速、可扩展地获得更高产量且高质量的Mtb EV制备物。此外，通过定量与定性分析手段与密度梯度超速离心法进行比较，进一步证明了SEC的优势。尽管对EV数量（纳米颗粒追踪分析）、表型（透射电子显微镜）和内容物（蛋白质印迹）的评估是针对Mtb EVs优化的，但所提供的工作流程也可应用于其他分枝杆菌。

结核分枝杆菌（Mtb）的培养滤液蛋白（CFP）经浓缩和定量后，取3 mg样品上样至尺寸排阻色谱（SEC）柱。蛋白浓度和颗粒浓度分别通过BCA法和NTA法进行测定。蛋白和颗粒回收量的预期范围以及本实验获得的具体数值见表1。若数值显著高于该范围，可能提示存在污染或色谱柱完整性问题；若数值明显偏低，则提示超滤步骤中存在问题，因此需将穿流液与起始CFP及100R组分进行比较，以判断浓缩是否成功。非特异性蛋白银染结果显示，后续洗脱组分中蛋白含量更高，且其蛋白谱与100R组分相似（图1）。
各组分的蛋白质印迹结果显示，脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）存在于各个组分中，而较晚洗脱的组分显示出较弱强度的条带图 2A，补充图119 kDa脂蛋白LpqH，已知存在于结核分枝杆菌（Mtb）的细胞外囊泡（EVs）中3,<sup class=...

该方案描述了尺寸排阻色谱法，一种简便且可重复的富集技术 结核分枝杆菌 来自培养上清液的细胞外囊泡

Mycobacterium tuberculosis 通过尺寸排阻色谱法富集细胞外囊泡

细胞外囊泡（EVs）在细菌感染背景下的作用已成为理解微生物生理学的一个新方向。

本方案降低了从结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）中富集胞外囊泡（Mtb EVs）所需的技术复杂性和时间。它为传统的超速离心和基于密度的分离技术提供了一种温和的替代方法。该技术的主要优势在于操作简便，因而具有更高的可重复性。该方法可获得高产量的结核分枝杆菌EV，并最大限度减少非EV蛋白的共富集。本实验操作由本实验室前研究生Joanie Ryan演示。首先，通过加入最大体积的PBS，准备一个100千道尔顿分子量截留的离心过滤器。在 4 摄氏度下以 2,800 × g 离心 5 分钟。弃去滤过液及任何残留的 PBS，将样品室加满 Mtb CFP 至其最大容量。在 4 摄氏度下以 2,800 × g 离心，直至体积减少至超滤装置的最小体积。根据需要重复操作，直至样品体积被充分浓缩。向含有浓缩物的滤膜装置中加入 1× PBS，至达到装置的总容量。按前述方法浓缩体积，并重复此步骤五次，以确保彻底洗涤并完成缓冲液置换。然后，根据超滤装置的说明书，回收100千道尔顿截留的CFP截留物（100R）。用最小体积的1×PBS至少洗涤滤膜三次，并将洗涤液并入100R中，以最大限度地提高回收率。用PBS对样品进行一系列稀释，采用二辛可宁酸法（bicinchoninic assay）定量测定100R中的蛋白含量。将样品重复检测三次。让尺寸排阻色谱（SEC）柱平衡至室温。如有需要，通过塔式单元背面的电源开关打开AFC，并在主菜单触摸屏上按下“Setup”以调整称重传感器的设置。在设置界面中，选择“Carousel”（转盘），然后选择“Calibrate”（校准）以对转盘进行对齐。将带有13个小孔且孔朝上的转盘插入AFC塔中，并通过按减号或加号按钮调整转盘位置，使液体喷嘴正好位于冲洗位置的正上方。取下已平衡的SEC色谱柱的端盖，将SEC色谱柱滑入相应的色谱柱支架中。小心地将其安装到AFC塔上。确保柱子上的射频识别标签朝向AFC，并检查柱子与阀门之间的连接是否牢固。将废液出口管路放入收集容器中。在设置界面中，选择“收集计划”，通过按减号或加号按钮将收集次数设为13次，每次收集体积设为0.5毫升。缓冲液体积保留默认值2.7毫升，然后关闭收集计划窗口。从主界面选择“开始收集”，并通过选择“是”确认收集参数。将13个已标记的1.7毫升微量离心管装入转盘，管盖打开并朝向转盘中心。选择“OK”推进自动流体控制器（AFC），然后安装柱储液槽，再次按“OK”推进。选择按“是”冲洗色谱柱，并加入一个柱体积的0.2微米滤过的PBS，以去除任何保存缓冲液。冲洗完成后，按“OK”推进AFC。将转盘盖盖在AFC上，然后按“OK”。使用移液器从色谱柱中移除任何过量缓冲液。将3毫克100R样品用1×PBS定容至500微升，并将样品加至层析柱顶部。准备一个柱体积的0.2微米滤膜过滤的PBS。推动AFC，使样品流入柱床。当样品完全进入层析柱后，向储液槽中加入先前配制的 PBS。在 AFC 收集空体积组分及后续指定组分时，监测其运行过程。运行结束后，收集盘返回废液位置，此时取下盖子，并从收集盘上取出组分收集管。从3毫克100R结核分枝杆菌CFP中收集的0.5毫米级分，使用微BCA法测定蛋白浓度，每个样本的第1至第7级分均设三个复孔，并以1:3比例稀释。对于编号为5至13的0.5毫升级分，每个样本使用BCA法测定，无需稀释，同样设三个复孔。向每个级分的10微升样品以及CFP和100R各5微克中加入SDS上样缓冲液。在100摄氏度下煮沸5分钟。然后将样品上样至4至12% Bis-Tris凝胶，并使用蛋白分子量标记进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。使用1× MES电泳缓冲液和200伏电压，电泳35分钟，进行SDS-PAGE。将凝胶从胶盒中取出，施加50伏电压，持续至少一小时，以将分离的蛋白质转移至0.2微米硝酸纤维素膜上。最后，进行Western印迹分析以检测蛋白质。用银染法染色的SDS-PAGE凝胶展示了各组分的总体蛋白质谱。数据显示，后面的组分含有更多的蛋白质，并且与100R材料相似。检测LAM、LpqH和GroES的Western印迹表明，蛋白质标记物在不同组分间存在变化。此处展示的是固定前收集的凝胶过滤层析组分1至3的透射电子显微镜（TEM）图像。对结核分枝杆菌（Mtb）EVs 进行密度梯度超速离心后，采用负染法进行透射电子显微镜（TEM）成像。此处展示了尺寸排阻层析（SEC）第1至第3组分的纳米颗粒示踪分析（NTA）分布结果。通过纳米颗粒示踪分析对密度梯度超速离心获得的结核分枝杆菌（Mtb）EVs 进行检测，其粒径分布如图所示。本方案已针对从三毫克100R中纯化细胞外囊泡（EV）进行了优化。如果蛋白上样量有所变化，可能需要调整所得组分的推荐稀释倍数及BCA检测策略。采用本技术制备的结核分枝杆菌（Mtb）EV可用于后续的组分分析及基于组学的研究。它们也适用于体外和体内实验。该技术为制备高质量的结核分枝杆菌EV提供了一种简便高效的方法，为未来结核分枝杆菌EV实验的可重复性提升奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

结核分枝杆菌 通过尺寸排阻色谱实现细胞外囊泡富集

来源：Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. 铁限制条件下分枝杆菌产生细胞外囊泡的分离与表征。 J. Vis. Exp. (2019)本视频展示了从在模拟宿主环境的限铁条件下培养的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

从Mycobacterium tuberculosis中分离含铁载体的细胞外囊泡

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：Watson, D. C., 等. 从大肠杆菌及其他细菌中可扩展地分离与纯化细胞外囊泡. J. Vis. Exp.

使用尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡

在本视频中，我们演示一种技术——尺寸排阻色谱法，用于分离来源于细菌的异质性外膜囊泡（OMV）群体。这些囊泡为纳米级球形结构，可通过尺寸排阻色谱法根据其大小分离为大尺寸和小尺寸亚群。...

基于尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡：一种根据尺寸分离革兰氏阴性菌外膜囊泡异质群体的技术

尺寸排阻色谱法，细菌胞外囊泡，外膜囊泡，革兰氏阴性菌，囊泡分离，尺寸分离，纳米颗粒，生物分离技术

本视频演示了利用超滤法对细菌培养滤液蛋白（包括细菌胞外囊泡）进行分离和浓缩的过程。浓缩后的胞外囊泡可作为疾病检测的诊断标志物。...

使用超滤装置浓缩细菌培养滤液中的蛋白质

本视频演示了利用尺寸排阻色谱法（SEC）从结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种用于纯化分枝杆菌胞外囊泡的尺寸排阻色谱技术

分离与表征铁限制条件下分枝杆菌产生的细胞外囊泡

细菌囊泡在致病过程中发挥重要作用，并具有广阔前景的生物技术应用价值。由于囊泡具有异质性，其分析和应用受到限制；因此，亟需一种简单且可重复的方法来分离不同大小的囊泡。本文中，我们展示了利用尺寸排阻色谱法分离由Aggregatibacter...

利用尺寸排阻色谱分析细菌外膜囊泡的异质性

细菌会分泌携带生物活性分子的纳米级细胞外囊泡（EVs）。EV研究主要关注其生物发生机制、在微生物间及宿主-微生物相互作用和疾病中的作用，以及潜在的治疗应用。本文介绍了一种可放大的从多种细菌中分离EV的方法流程，以促进EV研究的标准化。...

可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法 大肠杆菌 及其他细菌

本方案详细描述了从无菌培养的分枝杆菌中富集天然的分枝杆菌胞外囊泡（mEVs）的方法 Mycobacterium smegmatis （耻垢分枝杆菌，Msm）以及如何设计并富集含有mCherry（一种红色荧光报告蛋白）的重组MsmEVs。最后，通过富集含有EsxA蛋白的MsmEVs验证了这一新方法。...

分枝杆菌天然及重组细胞外囊泡的富集

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。...

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

学习使用尺寸排阻色谱法从结核分枝杆菌培养上清液中富集细胞外囊泡。该方法操作简便、重复性好，可获得高产量且非囊泡蛋白污染极低的Mtb EVs，适用于下游组学分析和功能研究。

Mycobacterium tuberculosis 通过尺寸排阻色谱法富集细胞外囊泡

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