Name: 巴西寄生体加纳 斯菌的饲养方法，这是一种有前途的生物控制剂，用于侵入性 铃木果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 了解巴西寄生蜂Ganaspis brasiliensis的规模化饲养方法，用于防治入侵性害虫Drosophila suzukii。本方案涵盖饲料配制、环境控制及成虫收集等关键技术，为生物防治研究提供可靠支持。

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作者感谢瑞士CABI的Lukas Seehausen和Marc Kenis慷慨提供G1 G. brasiliensis。意大利方面的研究经费由意大利特伦托自治省（Provincia Autonoma di Trento）提供，美国方面的经费由美国农业部国家食品与农业研究所（National Institute of Food and Agriculture）、美国农业部特色作物研究计划（USDA Specialty Crops Research Initiative）资助（项目号#2020-5118-32140）、美国农业部动植物卫生检验局（USDA Animal and Plant Health Inspection Service，农场法案基金14-8130-0463）以及美国农业部农业研究局CRIS基础资金（项目号8010-22000-033-00D）提供。美国农业部为平等机会提供者和雇主，不认可本出版物中提及的任何产品。

1. G3 Ganaspis brasiliensis 小规模实验室繁育方法
<ol>
	<li>准备寄主饲料。
	<ol>
		<li>将 600 mL 蒸馏水加入一个 1,500 mL 的玻璃容器中，并在电热板上加热该水。</li>
		<li>加入 88.6 g 市售干燥饲料（由琼脂、酿酒酵母、玉米粉、对羟基苯甲酸甲酯和蔗糖制成），或按照 Dalton 等人发表的配方28制备饲料（见步骤 2.1.2）。</li>
		<li>向干燥饲料中加入 300 mL 蒸馏水，并充分搅拌饲料混合物。</li>
		<li>将混合物加入沸腾的水中。</li>
		<li>使电热板上的液体饲料持续煮沸 10 分钟，期间定期搅拌混合物以防止烧焦。</li>
		<li>将饲料在室温下冷却 30 分钟，期间偶尔搅拌以均匀散热，并防止饲料表面凝固。</li>
		<li>在一个容器中量取 6.7 mL 95% 的乙醇，在另一容器中量取 3.5 mL 1 M 丙酸溶液。</li>
		<li>待饲料冷却后，先加入乙醇，再加入丙酸溶液，每次添加后均充分搅拌。</li>
		<li>准备蓝莓（从当地市场购买）：先用冷水冲洗，再用次氯酸钠漂白液（稀释至 5%）冲洗，最后再用冷水冲洗一次。</li>
		<li>用纸巾将果实擦干，并手工捣碎，直至每颗果实的果皮破裂，果肉和汁液充分暴露。</li>
		<li>向每个 250 mL 的锥形瓶中加入 25–30 g 捣碎的蓝莓。轻敲瓶壁，确保瓶底内表面被捣碎蓝莓均匀覆盖。</li>
		<li>将配制好的饲料倒入每个锥形瓶中，使其刚好覆盖捣碎蓝莓的顶部。</li>
		<li>在锥形瓶口塞上泡沫塞，并在室温下静置，使饲料凝固（图 1）。</li>
		<li>饲料凝固后，立即使用或在 5 °C 下保存，最长可保存 3 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>饲养寄主 Drosophila suzukii。
	<ol>
		<li>将储存的饲料从冰箱中取出，使其恢复至室温，或直接使用新制备的饲料。</li>
		<li>剪取一块吸水性纸巾（例如 5 cm × 20 cm），在其中心部位扭绞。将扭绞部分插入锥形瓶中（图 1）。</li>
		<li>用蒸馏水润湿纸巾及饲料表面，以保持湿度。</li>
		<li>将当前种群培养瓶中性成熟的成虫转移至新的饲料瓶：小心取下旧瓶的塞子，迅速将旧瓶倒置，并将其瓶口与新瓶对齐。</li>
		<li>轻轻敲击旧瓶侧壁，促使果蝇落入新瓶中。确保新瓶中有约 25–30 对 D. suzukii 成虫配对。当新瓶中果蝇数量足够后，迅速将旧瓶恢复正立，并为两个瓶子重新塞上塞子。</li>
		<li>重复转移操作，直至旧瓶中无果蝇残留。如有需要，可将多个旧瓶中的果蝇合并至一个新瓶中，以确保每瓶有足够数量的果蝇（20–30 对）。</li>
		<li>将新瓶置于环境培养箱中，在适宜条件下（21 °C，16 小时光照 : 8 小时黑暗光周期，60%–80% 相对湿度 [RH%]）培养 3 周，以待果蝇羽化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使寄主幼虫暴露于寄生蜂。
	<ol>
		<li>取一个含有果蝇卵和幼虫的锥形瓶（见步骤 1.2.7），移除其中的成虫及扭绞的纸巾。</li>
		<li>将一块吸水性纸巾对折后放入瓶中，作为被寄生幼虫的化蛹基质。</li>
		<li>用吸管将六对雌雄 G3 代 G. brasiliensis 吸入每个锥形瓶中（图 1）。在泡沫塞底部涂抹一层薄蜂蜜。</li>
		<li>将寄生蜂在瓶中放置 5 天。</li>
		<li>5 天暴露期结束后，移除寄生蜂，并将锥形瓶置于上述相同条件下，在环境培养箱中继续培养 35 天，直至预期的寄生蜂羽化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集并保存成虫寄生蜂。
	<ol>
		<li>在培养的第二周和第三周期间，每周检查锥形瓶是否有早期寄主羽化，并移除成虫果蝇。</li>
		<li>一旦成虫寄生蜂开始羽化，每周用吸管收集三次，并将其置于果蝇小瓶（例如 2.5 cm × 9.5 cm）中（图 1）。</li>
		<li>在小瓶底部放置一小块用蒸馏水润湿但未饱和的纸巾。</li>
		<li>每瓶放入约 60 只寄生蜂，并标注羽化日期。每周两次在泡沫塞底部涂抹一层薄蜂蜜。若未立即使用，可将装有成虫寄生蜂的小瓶置于上述环境培养箱中保存，最长可达一个月。</li>
		<li>每隔 4–7 天重新润湿瓶内纸巾，或在出现霉变迹象时更换纸巾。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大规模培育G1代Ganaspis brasiliensis的方法
<ol>
	<li>大规模饲养寄主昆虫 Drosophila suzukii。
	<ol>
		<li>将 D. suzukii 饲养于大型针织网罩笼中（例如 50 cm × 50 cm × 100 cm），每个笼内放置 1,500–2,000 只性成熟的成虫（雌雄比例 50:50）（图 2）。</li>
		<li>通过将所有成分（6 g 细菌学琼脂、75 g 玉米粉、17 g 营养酵母、15 g 蔗糖、10 g 大豆粉、10 mL 丙酸）加入 1 L 蒸馏水中煮沸 10 分钟来制备标准果蝇培养基（SDM），期间需定期搅拌混合物以防止烧焦28。</li>
		<li>让混合物冷却 5 分钟，然后加入 5 g 抗坏血酸。</li>
		<li>将新制备的 SDM 倒入直径为 9 cm 的培养皿中，待其在室温下凝固后盖上皿盖。</li>
		<li>将 SDM 培养皿堆叠后用铝箔包裹，并在 4 °C 下储存最多两周。</li>
		<li>在每个饲养笼内放置一个装有浸水棉球的培养皿以及四至六个装有 SDM 的培养皿（图 2）。</li>
		<li>每周两次用新鲜的 SDM 培养皿替换已被寄生的 SDM 培养皿。</li>
		<li>将无盖的已被寄生的 SDM 培养皿分别放入塑料杯（直径 13.3 cm 或容积 800 mL）中，每杯用细网（&#60;0.5 mm）封口，并在 23 °C 和 75% 相对湿度（RH）条件下培养 12–15 天（图 2）。</li>
		<li>将新羽化的 D. suzukii 成虫从塑料杯转移至饲养笼中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备寄主幼虫。
	<ol>
		<li>用冷水冲洗蓝莓 1 分钟，然后将果实浸泡在盛有次氯酸钠溶液（稀释至 5%）的盆中 3 分钟。</li>
		<li>倒掉次氯酸钠溶液，向盆中加入冷水冲洗蓝莓，用手轻轻搅动至少 30 秒。</li>
		<li>使用新鲜水重复步骤 2.2.2 至少三次，以去除残留的次氯酸钠及其他可能存在于果实表面的节肢动物（如螨类、蓟马）。</li>
		<li>将果实置于铺有多层吸水纸巾的托盘上，小心地前后倾斜托盘，使果实滚动以干燥表面。</li>
		<li>准备多个直径为 9 cm 的培养皿（可使用上半部或下半部，开口朝上），每个培养皿中放入清洗后的蓝莓（每皿 15–25 颗果实，视果实大小而定）。</li>
		<li>在傍晚时分，将培养皿暴露于寄主饲养笼内的性成熟成虫中（见步骤 2.1），并过夜放置。</li>
		<li>次日早晨，通过轻轻吹气或轻敲培养皿的方式驱赶果实上的成虫，移除培养皿，并将已被寄生的果实用于寄生蜂的饲养（见步骤 2.4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实施大规模寄生蜂饲养。
	<ol>
		<li>使用两种类型的笼子分别进行寄生蜂的寄生和羽化阶段饲养。</li>
		<li>确保寄生笼为立方体结构（例如每边 45 cm），前侧设有透明塑料观察板，前板上有两个 18 cm 的袖口开口，用于添加或移除昆虫及更换食物材料，顶部和侧面覆盖细聚酯网（例如 96 × 26 网孔），以保证通风。</li>
		<li>羽化笼可较小（例如每边 30 cm），在相对两侧各设一个袖口开口，前侧设有透明塑料观察板以便观察（图 2）。</li>
		<li>确保两种笼子的顶部内侧均悬挂一根细绳，用于悬挂一个或多个饲喂器（图 2）。 
		注：饲喂器由一个大型圆柱形泡沫塞（直径 9 cm）构成，表面散布蜂蜜滴，可置于笼底或悬挂在笼顶（图 2）。</li>
		<li>在每个笼内，每隔 5–7 天提供一次直壁果蝇小瓶（2.5 cm × 9.5 cm）盛装的水，瓶口用醋酸纤维素塞（直径 2.5 cm）密封，具体频率取决于相对湿度。将小瓶倒挂在笼顶（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使寄主幼虫暴露于寄生蜂。
	<ol>
		<li>在 D. suzukii 过夜寄生后（见步骤 2.2.7），立即将含有寄主幼虫的培养皿中的果实暴露于 G1 代 G. brasiliensis。</li>
		<li>将 10–15 个含有寄生果实的培养皿置于含有 1,500–2,000 只寄生蜂的寄生笼中，持续 2–3 天。</li>
		<li>使用底部铺有吸水纸层的塑料杯（直径 13.3 cm 或容积 800 mL）收集含有被寄生寄主的果实（图 2）。</li>
		<li>将敞口的塑料杯放入羽化笼中，在 21 °C 和 65% 相对湿度条件下培养至少 28 天（图 2）。</li>
		<li>在培养的第二周和第三周，每周检查一次笼内情况，及时清除早期羽化的寄主成虫，以便后续顺利收集寄生蜂。</li>
		<li>在第四周培养结束时，向笼内添加饲喂器和水源。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集并储存成虫寄生蜂。
	<ol>
		<li>一旦寄生蜂开始羽化，收集其中一部分（10%–15%）成虫，并将其重新转移至寄生笼中以替换老化且无繁殖力的个体。</li>
		<li>将剩余的寄生蜂收集并储存在塑料杯（直径 13.3 cm 或容积 800 mL）中（图 3A）。</li>
		<li>在杯底放置一个装有水的 2 mL 管，并用牙科棉卷（1 cm × 3.8 cm）密封管口（图 3A）。</li>
		<li>用改装过的杯盖封闭杯子，杯盖上装有可拆卸的泡沫塞（直径 3.5 cm）作为饲喂基质，并设有网罩通风孔（图 3B）。</li>
		<li>每个杯子最多放入 700 只成虫（雌雄比例 50:50），标记羽化日期，并将其储存在环境控制箱（17 °C；65% RH）中直至使用，最长可储存一个月（图 3B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运输成虫寄生蜂。
	<ol>
		<li>使用 50 mL 锥形管运输成虫寄生蜂。</li>
		<li>在管盖上钻一个通气孔（直径 8 mm），并用细网覆盖（图 3C）。</li>
		<li>在管盖内侧安装一个醋酸纤维素制成的饲喂环（图 3C）。</li>
		<li>使用蒸馏水配制饱和蔗糖溶液，滴加数滴于饲喂环上，使其充分吸收。</li>
		<li>在管内放入一片扇形吸水纸巾（图 3D）。</li>
		<li>每个管中加入约 200 只成虫寄生蜂，并将各管与冰袋一同放入保温运输容器中进行运输。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Matsuura, A., Mitsui, H., Kimura, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+study+on+distributions+and+oviposition+sites+of+Drosophila+suzukii+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29+and+its+parasitoids+on+wild+cherry+tree+in+Tokyo%2C+central+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">A preliminary study on distributions and oviposition sites of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) and its parasitoids on wild cherry tree in Tokyo, central Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 53 (1), 47-53 (2018).</li>
<li>Abram, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+records+of+Leptopilina%2C+Ganaspis%2C+and+Asobara+species+associated+with+Drosophila+suzukii+in+North+America%2C+including+detections+of+L.+japonica+and+G.+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hymenoptera+Research%22%5BJournal%5D)">New records of Leptopilina, Ganaspis, and Asobara species associated with Drosophila suzukii in North America, including detections of L. japonica and G. brasiliensis.</a> Journal of Hymenoptera Research. 78, 1-17 (2020).</li>
<li>Puppato, S., Grassi, A., Pedrazzoli, F., De Cristofaro, A., Ioriatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Leptopilina+japonica+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">First report of Leptopilina japonica in Europe.</a> Insects. 11 (9), 611(2020).</li>
<li>Dalton, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+survival+of+Drosophila+suzukii+under+simulated+winter+conditions+of+the+Pacific+Northwest+and+seasonal+field+trapping+in+five+primary+regions+of+small+and+stone+fruit+production+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Managagement+Science%22%5BJournal%5D)">Laboratory survival of Drosophila suzukii under simulated winter conditions of the Pacific Northwest and seasonal field trapping in five primary regions of small and stone fruit production in the United States.</a> Pest Managagement Science. 67 (11), 1368-1374 (2011).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

长期研究及后续对生物防治剂的田间释放依赖于高效且经济的饲养技术。本研究中描述的方法已被证明是小规模和大规模饲养巴西甘蔗瘿蚊茧蜂（Ganaspis brasiliensis）的有效方案。小规模饲养方案经过多年优化，旨在减少所需人力，并降低同时维持寄生蜂及其寄主种群所需的专用设备要求，适用于实验室研究或生物测定中种群的维持。作者曾采用类似方法进行该寄生蜂的检疫评估饲养。大规模饲养方案则可用于生产大量蜂类以供田间释放，如近期在意大利开展的工作。这些技术可轻松转移至其他实验室、生产单位或企业，用于近期的大规模饲养，同时也可作为进一步改进方法学的基础。
这些方案也可用于饲养Leptopilina japonica，因为Ganaspis brasiliensis与L. japonica在寄主生境偏好7,8、寄主发育阶段偏好或生殖生物学特性15、温度适应性<su...

原产于东亚的斑翅果蝇Drosophila suzukii（Matsumura）（双翅目：果蝇科）已在美洲、欧洲及非洲部分地区广泛定殖1,2。该果蝇具有极强的多食性，在其原生地和入侵地均可利用多种果皮柔软且较薄的栽培及野生果实1,2,3。目前对该害虫的防治主要依赖在易感果实成熟期间频繁施用杀虫剂以杀灭农田中的成虫。由于非作物生境中果蝇种群持续迁入，以及入侵地区缺乏有效的本地天敌，往往需要多次喷药1,4。生物防治，特别是利用可自我延续的专性寄生蜂，可能有助于在景观尺度上抑制果蝇种群，并在对该高迁移性、多食性害虫进行可持续的区域性管理中发挥关键作用4,5,6。
在过去十年中，研究人员致力于在东亚地区——Drosophila suzukii 的原生分布区——寻找与其共同进化的寄生蜂7,8,9，同时也探索在美洲和欧洲等入侵地区具有防治潜力但为新近关联的寄生蜂4,5,6。在该果蝇新入侵的地区，一些常见的Drosophila幼虫期寄生蜂，例如Asobara c.f. tabida (Nees)（膜翅目：茧蜂科）、Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) 和L. heterotoma (Thompson)（膜翅目：小蜂科），由于该果蝇具有较强的免疫抗性，难以在其体内发育或寄生率极低10。目前仅发现少数广布性、多食性蛹期寄生蜂能够成功在D. suzukii体内发育，包括北美和欧洲的Pachycrepoideus vindemiae (Rondani)（膜翅目：旋小蜂科）和Trichopria drosophilae (Perkins)（膜翅目：细蜂科），以及南美洲的Trichopria anastrephae Lima4。相比之下，在东亚地区的调查已发现多种D. suzukii的幼虫期寄生蜂4,5,6。其中，Asobara japonica Belokobylskij、Ganaspis brasiliensis Ihering 和Leptopilina japonica Novković &amp;#38; Kimura 是主要的优势幼虫期寄生蜂7,8,9,11。特别是两种小蜂科寄生蜂（L. japonica 和 G. brasiliensis）主要在自然植被中被发现，且多寄生于D. suzukii或其他近缘果蝇物种所侵染的新鲜果实内7,8,9。这三种亚洲来源的幼虫期寄生蜂已被引入美国和欧洲的检疫设施，用于评估其相对寄生效率12,13,14,15,16,17、气候适应能力18、潜在的种间竞争关系19，以及最重要的——寄主特异性8,20,21,22。
检疫评估表明，Ganaspis brasiliensis 对 Drosophila suzukii 的寄主特异性高于其他已测试的亚洲幼虫寄生蜂，尽管该种可能包含不同生物型或隐存种，其寄主特异性存在差异8,21,22,23,24。Nomano 等人22 基于线粒体细胞色素氧化酶 I 基因片段的分子分析，将来自不同地理区域的 Ganaspis 个体划分为五个遗传类群（命名为 G1–G5）。G2 和 G4 类群仅见于少数南亚热带地区，而 G5 类群则在亚洲及其他地区（如阿根廷、巴西、夏威夷和墨西哥）从未知寄主中被发现（Buffington，个人观察）。在韩国7、中国8 和日本9,23,25 对被 D. suzukii 侵染的野生果实进行的野外采集中，仅发现 G1 类群，或 G1 与 G3 类群的混合个体。这两个类群似乎为同域分布，并共同存在于 D. suzukii 及其他近缘寄主蝇类所栖居的同一寄主植物上。然而，两者之间已观察到一些差异：在检疫测试中，尽管 G1 和 G3 均可攻击多种近缘物种，但 G1 对 D. suzukii 的寄主或寄主生境特异性似乎高于 G321,22。进一步深入的分子分析可能有助于确定其物种地位，尤其是针对 G1 和 G3 类群。本研究将二者分别称为 G1 G. brasiliensis 和 G3 G. brasiliensis。一些早期研究也曾将 G1 G. brasiliensis 命名为 G. cf. brasiliensis14,21,22。目前，G1 G. brasiliensis 已获准在美国和意大利进行野外释放以防控 D. suzukii（另有多个欧洲国家正在考虑引入），而 G3 G. brasiliensis 也可能在不久的将来被考虑用于野外释放。最近的调查还发现，加拿大不列颠哥伦比亚省26 以及美国华盛顿州（Beers 等人，未发表数据）均出现了 L. japonica 和 G1 G. brasiliensis 的外来种群，意大利特伦托省也发现了外来 L. japonica 种群27。
鉴于人们对开发针对斑翅果蝇（Drosophila suzukii）的生物防治项目具有浓厚兴趣，以及引进（无论是自然迁入还是人为引入）的巴西甘氏菌蚊（Ganaspis brasiliensis）所展现出的重要生物防治潜力，迫切需要建立高效的该寄生蜂幼虫繁育方法，以支持未来的长期研究和/或田间释放。本实验方案及配套视频文章介绍了该寄生蜂的两套繁育方法：（1）在烧瓶中进行的小规模实验室繁育，采用寄主果实（蓝莓）与人工饲料混合的方式培养D. suzukii；该方法所用材料为最初采自中国昆明的G3品系8。（2）在大型笼中进行的大规模繁育，用于田间释放，使用寄主果实（蓝莓）培养D. suzukii；大规模繁育所用遗传品系为源自日本东京的G1品系9,22。此外，还简要讨论了其他规模的繁育方法，例如对上述两个品系均适用的试管或小型容器繁育方式。

<table><tbody><tr><td>活性干酵母</td><td>Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA</td><td>无</td><td>用于覆盖水果以减少霉菌生长，并增强水果对果蝇的吸引力</td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy</td><td>A1296 - 5KG</td><td>用于制备标准果蝇培养基</td></tr><tr><td>漂白剂溶液</td><td>Clorox Company, Oakland, CA, USA</td><td>无</td><td>用于对果肉类水果进行消毒</td></tr><tr><td>蓝色塞子</td><td>Azer Scientific, Morgantown, PA, USA</td><td>ES3837</td><td>用于密封试管，同时允许昆虫通风</td></tr><tr><td>蓝莓</td><td>杂货店，美国特拉华州纽瓦克</td><td>无</td><td>作为果蝇的寄主水果提供（也可使用其他多种水果）</td></tr><tr><td>BugDorm 昆虫饲养笼（宽24.5 × 深24.5 × 高63.0 cm）</td><td>Mega View Science Co. Ltd., 中国台湾台中</td><td>4E3030</td><td>用于饲养寄生蜂（寄生用饲养笼）</td></tr><tr><td>BugDorm 昆虫饲养笼（宽32.5 × 深32.5 × 高32.5 cm）</td><td>Mega View Science Co. Ltd., 中国台湾台中</td><td>4E4590</td><td>用于饲养果蝇</td></tr><tr><td>BugDorm 昆虫饲养笼（宽32.5 × 深32.5 × 高32.5 cm）</td><td>Mega View Science Co. Ltd., 中国台湾台中</td><td>4E4545</td><td>用于饲养寄生蜂（羽化用饲养笼）</td></tr><tr><td>镀锌铁丝网（0.64 cm，19号规格）</td><td>Everbilt, OH, USA</td><td>308231EB</td><td>用于抬高水果，以便寄生蜂最大程度地产卵</td></tr><tr><td>玉米粉</td><td>杂货店，意大利特伦托</td><td>无</td><td>用于制备标准果蝇培养基</td></tr><tr><td>牙科棉卷（1 × 3.8 cm）</td><td>Gima S.p.A., 意大利杰萨泰</td><td>35000</td><td>用于在储存容器内为寄生蜂提供水分</td></tr><tr><td>果蝇饲料</td><td>Frontier Scientific, Newark, DE, USA</td><td>TF1003</td><td>定制饲料，用于饲养果蝇</td></tr><tr><td>窄口果蝇小瓶，聚苯乙烯材质（2.5 × 9.5 cm）</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>75813-160</td><td>用于在饲养笼内为寄生蜂提供水分</td></tr><tr><td>果蝇小瓶塞，醋酸纤维素材质（2.5 cm）</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>89168-886</td><td>用于在饲养笼内为寄生蜂提供水分</td></tr><tr><td>锥形瓶（250 mL）</td><td>Carolina Biological, Burlington, NC, USA</td><td>731029</td><td>用于饲养果蝇和寄生蜂</td></tr><tr><td>离心管（Falcon型，50 mL）</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>VWRI525-0611</td><td>经改造后用于运输成年寄生蜂</td></tr><tr><td>泡沫塞</td><td>Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA</td><td>L800-C</td><td>用于密封锥形瓶，同时允许昆虫通风</td></tr><tr><td>蜂蜜</td><td>杂货店，美国特拉华州纽瓦克</td><td>无</td><td>作为寄生蜂的食物提供</td></tr><tr><td>Identi-Plug 塑料泡沫塞</td><td>Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US</td><td>14-127-40E</td><td>用作寄生蜂的饲喂装置，并用于密封储存容器</td></tr><tr><td>工业用纸巾</td><td>杂货店，美国特拉华州纽瓦克</td><td>无</td><td>作为蛹化基质供蛹使用，并可减少湿度</td></tr><tr><td>微孔网布（250 mL）</td><td>Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA</td><td>WN0250-72</td><td>用于制作昆虫通风盖</td></tr><tr><td>营养酵母（片状）</td><td>杂货店，意大利特伦托</td><td>无</td><td>用于制备标准果蝇培养基</td></tr><tr><td>纸质杯垫（10.2 cm）</td><td>Hoffmaster, WI, USA</td><td>35NG26</td><td>作为果蝇及被寄生蛹的蛹化基质提供</td></tr><tr><td>塑料杯（&amp;Oslash; 13.3 cm，800 mL）</td><td>Berry Superfos, Taastrup, Denmark</td><td>Unipak 5134</td><td>经改造后用于储存成年寄生蜂</td></tr><tr><td>塑料盖（&amp;Oslash; 13.3 cm）</td><td>Berry Superfos, Taastrup, Denmark</td><td>PP 2830</td><td>经改造后用于储存成年寄生蜂</td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy</td><td>P1386 - 1L</td><td>用于制备标准果蝇培养基</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>杂货店，意大利特伦托</td><td>无</td><td>用于制备标准果蝇培养基</td></tr><tr><td>带盖汤杯（475 mL）</td><td>StackMan, 越南</td><td>DC1648</td><td>用于被寄生的幼虫进行蛹化</td></tr><tr><td>大豆粉</td><td>杂货店，意大利特伦托</td><td>无</td><td>用于制备标准果蝇培养基</td></tr><tr><td>白色毛毡垫圈（厚0.64 cm，内径5 mm × 外径20 mm）</td><td>Quiklok, Lincoln, NH, US</td><td>WFW/.25 x 5 x 20 mm</td><td>用作寄生蜂的饲喂环</td></tr></tbody></table>

用于繁殖寄生蜂ganaspis brasiliensis的方法：一种针对入侵性斑翅果蝇drosophila suzukii的有前景的生物防治手段

Methods for Rearing the Parasitoid Ganaspis brasiliensis, a Promising Biological Control Agent for the Invasive Drosophila suzukii

斑翅果蝇（Drosophila suzukii Matsumura）（双翅目：果蝇科）原产于东亚，近十年来已在美洲、欧洲及非洲部分地区广泛定殖，成为入侵地区多种薄皮果实的毁灭性害虫。生物防治，特别是利用可自我延续且具有专一性的寄生性天敌，被认为是可持续地进行区域性防控这种高迁移性、多食性害虫的可行策略。Ganaspis brasiliensis Ihering（膜翅目：细蜂科）是一种幼虫期寄生蜂，在东亚广泛分布，被证实是对D. suzukii最具专一性和防治效果的寄生蜂之一。
在对其功效和潜在非靶标风险进行了严格的引入前评估后，该物种中宿主特异性较强的一个遗传类群（G1 G. brasiliensis）最近已获准在美国和意大利引入并进行田间释放。另一个遗传类群（G3 G. brasiliensis）在东亚地区也常被发现攻击D. suzukii，未来可能也会被考虑用于引入。目前，人们对饲养G. brasiliensis以用于研究，或大规模生产以进行田间释放来防控D. suzukii具有极大兴趣。本实验方案及配套视频文章描述了该寄生蜂在小规模研究和大规模生产及田间释放中的有效饲养方法。这些方法有助于进一步推动对该原产于亚洲的寄生蜂的长期研究与应用，使其成为防控这一全球性入侵害虫的有前景的生物防治手段。

图4展示了在美国农业部农业研究局有益昆虫引进单元（美国特拉华州纽瓦克）的检疫设施内，采用两种不同寄生蜂密度（6对或10对）和两种不同暴露时间（5天或10天）对G3代Ganaspis brasiliensis进行小规模实验室饲养的代表性结果。每种寄生蜂密度与暴露时间的组合均设有14个重复。总共64个培养瓶产生了4,018只蜂（每个培养瓶平均产生71.7 ± 4.9只子代），其中雌性子代占49.5% ± 1.9%。在21 °C条件下，成年寄生蜂在产卵后约30–35天羽化。寄生蜂密度和暴露时间对每个重复（培养瓶）产生的子代总数无显著影响（单因素方差分析，F3,52 = 0.379，P = 0.769），对雌性子代百分比仅有轻微影响（单因素方差分析，分析前根据需要对数据进行logit转换以稳定变异，F3,52 = 2.796，P = 0.049），但人均雌性个体的繁殖效率随寄生蜂数量增加而下降（单因素方差分析，F3,52</s...

Ganaspis brasiliensis 是斑翅果蝇（Drosophila suzukii，一种全球性入侵性果树害虫）的幼虫寄生蜂，目前已获准或正在考虑引入欧洲和美国，用于对该害虫进行生物防治。本文提供了该寄生蜂小规模和大规模饲养的操作方案。

用于繁殖寄生蜂Ganaspis brasiliensis的方法：一种针对入侵性斑翅果蝇Drosophila suzukii的有前景的生物防治手段

原产于东亚的斑翅果蝇 Drosophila suzukii（Matsumura）（双翅目：果蝇科）已在美洲、欧洲等地广泛定殖，……

长期研究和应用一种生物防治剂依赖于高效且经济的繁育技术，而本方案已被证明适用于该寄生蜂的繁育。目前，人们对为研究或田间释放而繁育该寄生蜂具有极大兴趣，本方案将有助于未来对该有前景的生物防治剂的长期研究与应用。初次使用者可能需要通过阅读文章中提供的相关参考文献以及进行一些方法实践，来了解所涉及昆虫的一些基本生物学特性。配制宿主饮食时，首先按照文中的描述制备饮食的液体部分。然后，将25至30克压碎的蓝莓加入一个空的250毫升烧瓶中。接着，将液体倒入装有蓝莓的烧瓶中，使液体刚好覆盖压碎蓝莓的顶部。接下来，为了饲养寄主果蝇 Drosophila suzuki，首先剪取一片吸水性纸巾，并在其中心位置扭绞。然后，将纸巾扭绞的中部放入饲料瓶中。为保持湿度，用蒸馏水润湿纸巾和饲料。然后，为了转移性成熟的成虫果蝇，小心地取下果蝇种群培养瓶的塞子，并将其倒置插入饲料瓶中。经过一周的暴露后，将果蝇置于环境培养箱中饲养三周，以待果蝇羽化。为了使寄主幼虫暴露于寄生蜂，首先从培养瓶中移除成虫果蝇和纸巾，保留果蝇的卵和幼虫。为了为幼虫提供化蛹基质，将一张新的吸水纸巾折叠后放入烧瓶中。然后用吸管将六对雌雄寄生蜂G3型巴西甘蔗矛茧蜂（G3 Ganaspis brasiliensis）吸入烧瓶，并在泡沫塞底部涂抹一层薄薄的蜂蜜。收集和保存寄生蜂时，于五天后移除成虫。然后将烧瓶置于环境培养箱中，在前述条件下保存35天。当成年寄生蜂出现后，每周用吸管吸取收集三次。为暂存寄生蜂，首先在规格为2.5厘米×9.5厘米的果蝇小瓶底部放置一张用蒸馏水润湿但未饱和的纸巾。然后，将约60只蜂转移到小瓶中，并标记羽化日期。将小瓶置于环境培养箱中。每周两次，在小瓶泡沫塞底部涂抹一层薄薄的蜂蜜。首先，将1,500至2,000只性成熟的果蝇以1:1的性别比例放入一个大型编织网罩笼中，进行大规模饲养黑腹果蝇（Drosophila suzuki）。然后，在笼内放置一个装有浸水棉球的培养皿以及四到六个含有标准果蝇培养基的培养皿。每周两次，将暴露的培养皿更换为新的培养皿。将每个已感染且无盖的培养皿放入一个800毫升的塑料杯中，并用细网覆盖杯口。然后将杯子置于23°C和75%相对湿度条件下培养12至15天。培养结束后，将新孵化的成年斑翅果蝇（Drosophila suzuki）转移至饲养笼中。接下来，开始准备寄主幼虫：将蓝莓用冷水冲洗一分钟，然后将果实浸泡在盛有次氯酸钠溶液的容器中，溶液稀释至5%，浸泡三分钟。随后，将清洗过的蓝莓放入九厘米的培养皿中。在傍晚时分，将培养皿放入饲养笼中，并过夜放置。第二天早晨，轻轻敲击培养皿，使果蝇从果实上脱落，然后将果实从饲养笼中取出。同时，为寄生蜂G1型巴西冈萨皮斯蜂准备一个寄生笼和一个成蜂羽化笼。两个笼子的顶部下方都应系一根细绳，用于悬挂一个或多个饲喂器。每隔五到七天（根据相对湿度而定），在每个笼子的顶部倒置悬挂一个含有水的果蝇小瓶，并用醋酸纤维素塞密封。从黑腹果蝇笼中取出被侵染的蓝莓后，立即将其放入含有 1,500 至 2,000 只巴西甘蔗茧蜂（Ganaspis brasiliensis）的寄生笼中，持续两到三天。随后，将果实收集到一个底部铺有吸水纸的 800 毫升塑料杯中。将敞口杯置于羽化笼中，在 21 °C 和 65% 相对湿度条件下孵育至少 28 天。在孵育的第二周和第三周，每周检查羽化笼一次，观察寄主是否提前羽化。为便于连续收集寄生蜂，需移除成虫蝇类。孵化至第四周末时，向笼内提供饲料和水源。收集约10%至15%的成虫蜂，并将其转移至寄生笼中，以替换老化且无繁殖能力的成虫蜂。将羽化笼中剩余的成虫蜂按1:1的雌雄比例保存，最多可保存700头，置于一个800毫升的塑料杯内，杯底放置一支装有2毫升水并以牙科棉卷密封的试管。将标记好羽化状态的杯子置于环境培养箱中，最多保存一个月。运输寄生蜂时，将约200头成虫放入一个50毫升的锥形管中，然后将所有锥形管连同冰袋一起放入保温运输容器中。本方案成功实现了在实验室条件下小规模饲养G3代巴西甘萨皮斯果蝇（Ganaspis brasiliensis），该生物为一种寄生性天敌，用于防治农业害虫斑翅果蝇（Drosophila suzuki）。子代产量不受寄生蜂密度和暴露时间差异的影响。同时亦可实现G1代巴西甘萨皮斯果蝇的大规模繁殖，自初次接触寄主斑翅果蝇后五周即开始产生后代。从第8周到第22周，寄生蜂的产量与暴露于其环境中的果实数量成正比。维持适宜的饲养温度、控制湿度以及持续为成虫提供食物至关重要。可通过优化寄主与寄生蜂的饲养密度以最大化黄蜂的繁殖效率，并探索该寄生蜂在替代寄主上饲养的可能性，进一步改进该方法。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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