Name: 完整澄清器官中克 氏锥虫感染细胞、休眠无鞭毛虫和 T 细胞的定量 3D 成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习光片荧光显微技术对克氏锥虫感染细胞和T细胞进行定量三维成像的方法。该技术可评估查加斯病治疗效果，揭示寄生虫与宿主免疫细胞的相互作用机制。

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我们感谢Etsuo Susaki博士在组织透明化和免疫染色方案方面提供的宝贵帮助和建议。同时，我们感谢CTEGD生物医学显微成像中心的M. Kandasamy在使用光片显微镜和共聚焦成像技术时提供的技术支持。我们还感谢Tarleton研究团队所有成员在本研究过程中给予的有益建议。

本研究严格遵循《公共卫生服务政策关于实验动物的人道护理与使用》以及实验动物护理评估与认证协会的认证指南进行。动物使用方案（小鼠中T. cruzi感染的控制-A2021 04-011-Y1-A0）已获得佐治亚大学机构动物护理与使用委员会的批准。本研究使用了以下小鼠品系：B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J、B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 和 C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J（雌性，1-2月龄）。这些小鼠来自商业来源（见材料表）。
1. 感染、灌注与解剖
<ol>
	<li>通过腹腔注射，用源自组织培养的Colombiana（DTU TcI）或Brazil（DTU TcV）克氏锥虫无鞭毛体感染小鼠 T. cruzi 分别表达tdTomato或GFP荧光蛋白的菌株。感染剂量可为50,000至200,000条锥鞭毛体，溶于100 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。 
	注：关于报告寄生虫的构建及感染小鼠模型的具体细节可参见 Canavaci 等人的研究.29 和Bustamante等人30.</li>
	<li>通过以3-7 L/min流速吸入二氧化碳处死小鼠。一旦动物不再表现出足底反射，立即从腹部向胸骨方向沿皮肤做纵向切口。然后从腹部切开体壁，并沿胸腔两侧肋骨继续剪开，直至胸骨可被抬起，暴露心脏。</li>
	<li>如所述 图1在心脏右心耳处做一个2.5 mm的切口，用1 mL微量移液器吸头收集流出的血液。</li>
	<li>将蝶形针（连接灌注系统的一端）插入左心室心尖，直至升主动脉。使用凝胶型胶水（参见 材料表用以密封针头周围的进液孔，并在灌注过程中保持针头位置固定。</li>
	<li>灌注小鼠30 用50 mL冷肝素-PBS（pH 7.4，含肝素10 U/mL）灌注，直至从小鼠流出至收集盘中的液体无血。</li>
	<li>用50 mL冰冷的4%（w/v）多聚甲醛（PFA）（pH 7.4）的PBS溶液灌注。 
	注意：PFA 组织固定可能是本实验方案中的关键步骤之一，尤其对于维持表位结构及后续的免疫检测至关重要。PFA 会随时间降解，因此必须新鲜配制。溶液的 pH 值同样重要，需避免过度固定，否则可能导致组织透明效果不佳。 
	警告：甲醛（PFA）经皮肤接触具有中等毒性。急性暴露对鼻腔、眼睛和咽喉有强烈刺激性。长期低水平空气暴露或皮肤接触可能引起皮炎、瘙痒等皮肤刺激症状，以及类似哮喘的呼吸系统问题。操作时应佩戴面部和眼部防护装备，避免吸入粉尘、气体、雾气、烟雾或蒸气。
	<ol>
		<li>PFA灌注后，用100 mL CUBIC-P缓冲液对小鼠进行灌注，以达到步骤1.5中所述的透明化程度。</li>
		<li>配制CUBIC-P缓冲液时，将10% N-丁基二乙醇胺、5% Triton X-100和5% 1-N-甲基咪唑溶解于双蒸水中，或使用市售预混液（参见 材料表). 
		注意：由于心脏和肾脏等色素较深的器官需要经过预透明处理才能提高透明度，因此仅建议对这类器官执行步骤1.6.1–1.6.2。使用CUBIC-P后，解剖器官并直接进入步骤2：组织透明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖组织样本/器官30 用于成像，并在4% (w/v) PFA的PBS溶液中（约10 mL/整个器官）于4 °C轻轻振荡固定过夜（ON），时间不超过5 × g) 加入50 mL离心管中。 
	注意：此后所有孵育步骤均须将试管水平放置于 20–30 °C 环境中避光进行。</li>
	<li>用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，添加 0.05% 叠氮化钠（NaN₃））洗涤样本3）在室温（RT）下轻柔振荡孵育3小时（共三次）（5 × g). 
	&#8203;注意：组织可在含30%蔗糖的10 mL PBS溶液中孵育，并轻轻振荡（5 × g) 在4 °C下于50 mL锥形管中过夜孵育。待组织沉至管底后，将其包埋于OCT包埋剂中，并置于-80 °C保存。室温下解冻至OCT包埋剂完全融化，随后在PBS中洗涤（约10 mL/完整器官），4 °C下轻柔振荡过夜（5 × g) 加入50 mL锥形管中。进行步骤2。</li>
</ol>
2. 组织透明化
注意：本研究中所有组织透明化操作均采用 CUBIC 协议 I22。共使用三种不同的试剂混合液：CUBIC-P 用于灌注过程中的去脂和快速脱色，CUBIC-L 用于去脂和脱色，CUBIC-R 用于折射率匹配。DNA 染色和免疫染色分别使用 CUBIC-HV 1 3D 核染色试剂盒和 CUBIC-HV 1 3D 免疫染色试剂盒（见材料表）。
<ol>
	<li>将单个器官浸入 10 mL 50% 水稀释的 CUBIC-L 中（参见 材料清单）中轻柔振荡（5 × g室温（过夜）在50 mL锥形管中进行。将管子平放在摇板上。 
	注意：为避免组织损伤，器官应保留在同一管中，并使用真空系统收集溶液。配制CUBIC-L时，使用市售混合液将10% N-丁基二乙醇胺和10% Triton X-100溶于双蒸水中 材料表). 
	警告：CUBIC-L 会造成严重的眼损伤。佩戴眼部和面部防护装备。应处置于经批准的废弃物处理场所。</li>
	<li>将样本浸入10 mL 100% CUBIC-L中孵育6天（第3天更换溶液）。 
	注意：在孵育期结束时，组织必须几乎完全透明。</li>
	<li>用 PBS（添加 0.05% NaN₃）洗涤透明器官3）在37 °C下轻轻振荡孵育2小时（重复三次）（5 × g将组织转移至新的50 mL锥形管中，每次洗涤以去除Triton X-100。 
	注意：如文中所述 图2B，如果实验目的是观察转基因生物体内表达的报告蛋白 T. cruzi 寄生虫或小鼠（图 2C- F），跳过步骤3、4和5，直接继续至步骤6。</li>
</ol>
3. DNA 染色
<ol>
	<li>将市售核酸染料（参见材料表）按1/2,500比例稀释于5 mL染色缓冲液中（试剂盒附带）。</li>
	<li>将组织浸入核染料溶液中，置于15 mL锥形管内，于37 °C、轻柔旋转条件下孵育5天。</li>
	<li>在室温下，用15 mL 3D核染色洗涤缓冲液（试剂盒附带）洗涤2小时（共三次），轻柔振荡（5 × g）。 
	&#8203;注意：其他DNA染料也可在以下浓度和孵育时间下使用：DAPI（试剂盒附带）：1/200，孵育5天；BOBO-1：1/400，孵育5天；碘化丙啶（PI）（试剂盒附带）：1/100，孵育3天；RedDot2：1/250，孵育3天。若实验的特定目的是同时观察内源性表达的报告蛋白并使用核染色剂，则跳过步骤4和5，直接进入步骤6。</li>
</ol>
4. 细胞外基质（ECM）消化
注意：必须对细胞外基质进行透明质酸酶消化，以促进抗体充分渗透到组织的深层区域28。
<ol>
	<li>将单个器官浸入盛有15 mL透明质酸酶反应缓冲液的50 mL锥形管中，于37 °C孵育2 h，平放并避光。 
	注意：配制透明质酸酶反应缓冲液时，将10 mM CAPSO、150 mM氯化钠（NaCl）和0.05% NaN3（见材料表）溶于双蒸水中，并调节pH至10。</li>
	<li>通过将75 µL浓度为20 mg/mL的透明质酸酶储备液加入425 µL透明质酸酶反应缓冲液中，配制酶溶液。配制20 mg/mL透明质酸酶储备液时，将透明质酸酶溶于含50 mM碳酸盐缓冲液、150 mM NaCl、0.01% BSA和0.05% NaN3的溶液中（见材料表），调节pH至10，并分装为77 µL每份，于-30 °C保存。</li>
	<li>用移液器弃去透明质酸酶反应缓冲液，将器官置于500 µL酶溶液中（盛于15 mL锥形管），竖直放置，于37 °C、避光条件下轻柔振荡（5 × g）孵育24 h。</li>
	<li>将样品置于50 mL锥形管中，加入15 mL透明质酸酶洗涤缓冲液，水平放置，于37 °C轻柔振荡（5 × g）洗涤2 h，重复三次，全程避光。
	<ol>
		<li>配制透明质酸酶洗涤缓冲液时，将50 mM碳酸盐缓冲液、150 mM NaCl、0.1%（v/v）Triton X-100、5%（v/v）甲醇和0.05% NaN3溶解于水中。调节pH至10。配制10×碳酸盐缓冲液-NaCl储备液时，将2.96 g碳酸钠、1.86 g碳酸氢钠和8.77 g NaCl溶于含0.05% NaN3的100 mL双蒸水中（见材料表），调节pH至10。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 免疫染色
<ol>
	<li>使用抗α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白，参见材料表）抗体，按以下步骤标记血管系统。
	<ol>
		<li>制备一抗与偶联Fab片段的二抗复合物。在染色程序开始前1.5小时启动该反应。
		<ol>
			<li>计算所需的一抗和二抗用量（按质量比1:0.5混合）。 
			注意：对于抗α-SMA一抗，标记整个心脏或尺寸相似的骨骼肌片段需要3.5 µg。对于浓度为2.5 mg/mL的产品，所需抗体溶液体积为3.5/2.5 = 1.4 µL。对于AlexaFluor 647标记的抗小鼠Fab片段二抗，标记整个心脏或尺寸相似的骨骼肌片段需要1.75 µg。对于浓度为1.7 mg/mL的产品，所需抗体溶液体积为1.75/1.7 = 1 µL。</li>
			<li>将一抗和二抗混合于棕色2 mL离心管中，在37 °C孵育1.5小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行缓冲液置换：将7.5 mL的2x HV1 3D免疫染色缓冲液（试剂盒中包含，参见材料表）与7.5 mL双蒸水混合，将组织样本浸入其中，在32 °C、轻柔振荡（5 × g）条件下于15 mL锥形管中水平放置孵育1.5小时。此步骤应与抗体复合物制备同时开始（即免疫染色前1.5小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下步骤进行3D免疫染色。
	<ol>
		<li>在15 mL锥形管中，根据补充文件1配制抗体染色溶液。</li>
		<li>从缓冲液置换液（步骤5.1.2）中取出组织样本，浸入抗体染色溶液中。将组织各自独立地在32 °C、避光、直立放置并轻柔振荡（5 × g）的条件下孵育1周。用石蜡膜密封管口以防止蒸发。</li>
		<li>转移至4 °C，直立孵育过夜（ON）。</li>
		<li>将1x HV1 3D免疫染色洗涤缓冲液（试剂盒中包含，参见材料表）冷却至4 °C，用15 mL缓冲液在4 °C轻柔振荡（5 × g）条件下洗涤样本两次，每次30分钟。在步骤5.2.7之前，保持15 mL锥形管水平放置。</li>
		<li>用1x HV1 3D免疫染色洗涤缓冲液将甲醛稀释至1%，将样本浸入8 mL该溶液中，在4 °C轻柔振荡（5 × g）条件下孵育24小时。</li>
		<li>在37 °C、轻柔振荡（5 × g）条件下，于新鲜的1%甲醛溶液中孵育1小时。</li>
		<li>在25 °C、轻柔振荡（5 × g）条件下，用15 mL PBS洗涤2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用抗红色荧光蛋白（RFP）抗体按以下步骤增强tdTomato信号。
	<ol>
		<li>孵育时间和温度同步骤5.2.2。计算所需的一抗和二抗用量（参见材料表），按质量比1:0.5混合。 
		注意：对于抗RFP一抗，标记整个心脏或尺寸相似的骨骼肌片段需要5 µg。对于浓度为1.25 mg/mL的产品，所需溶液体积为5/1.25 = 4 µL。对于Alexa Fluor 647标记的抗兔Fab片段二抗，标记整个心脏或尺寸相似的骨骼肌片段需要2.5 µg。对于浓度为1.5 mg/mL的产品，所需溶液体积为2.5/1.5 = 1.7 µL。</li>
		<li>按照补充文件1所述配制抗体染色溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用抗GFP纳米抗体按以下步骤增强GFP信号。
	<ol>
		<li>孵育时间和温度同步骤5.2.2所述。 
		注意：抗GFP纳米抗体（参见材料表）已偶联Alexa Fluor 647，因此无需制备抗体复合物。</li>
		<li>按照补充文件1所述配制抗体染色溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 折射率匹配
<ol>
	<li>将透明器官浸入盛有5 mL 50%水稀释CUBIC-R+溶液（参见材料表）的50 mL锥形管中，在室温下轻轻振荡（5 × g）过夜（ON）。在整个折射率匹配步骤中，保持锥形管直立放置。 
	注意：此前实验中回收的CUBIC-R+溶液可在此步骤中重复使用（最多四次）。配制CUBIC-R+溶液的方法为：将45%的2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（安替比林）、30%的烟酰胺或N-甲基烟酰胺以及0.5%的N-丁基二乙醇胺溶于双蒸水中，或使用市售CUBIC-R+缓冲液（参见材料表）。 
	警告：CUBIC-R+可引起皮肤刺激、严重眼刺激及器官损伤。操作时须佩戴防护手套，并做好眼睛和面部防护。避免吸入粉尘、烟雾、气体、雾气或蒸气。废弃物应送至经批准的废物处理场所进行处置。</li>
	<li>用5 mL 100% CUBIC-R+溶液替换50% CUBIC-R+溶液，在室温下轻轻振荡（5 × g）孵育2天。随后，将组织转移至无尘擦拭纸上，小心翻转组织，以去除器官表面残留的CUBIC-R+溶液，持续5分钟。</li>
</ol>
7. 封片
<ol>
	<li>组织干燥后，将其转移至六孔细胞培养板中，加入5 mL封片液（RI = 1.520）（参见材料表），在室温下孵育（过夜）。频繁翻动组织，以去除气泡，尤其是器官表面的气泡。 
	注意：器官可在封片液或CUBIC-R+中保存超过6个月。</li>
	<li>使用氰基丙烯酸酯凝胶胶水将组织固定在显微镜样品 holder 上。</li>
	<li>将样品浸入装有120 mL封片液的显微镜石英比色皿中，并沿其长轴垂直方向进行成像。固定心脏时，使心尖和主动脉保持水平对齐。 
	&#8203;注意：透明化并封片的器官可用振动切片机进行切片，并通过共聚焦显微镜进行高倍成像。将器官包埋于2%琼脂糖中，切取100–500 µm厚的切片。也可使用锋利刀片手动切片，制备厚组织切片（&#62;1000 µm）。切片后，将组织切片置于底部为玻璃的35 mm培养皿中，用相同的封片液封片，指甲油密封，然后通过共聚焦显微镜成像。</li>
</ol>
8. 图像采集
<ol>
	<li>使用光片显微镜对已固定的样品进行成像（参见材料表）。将放大倍数和各切片间的步进大小设置为 3 µm，使用厚度为 5 µm、宽度为 100% 的左右两侧光片激光。曝光时间恒定设置为 50–100 ms，并根据荧光信号强度将激光功率调整至 10%–80%。
	<ol>
		<li>对于共检测表达 tdTomato 的寄生虫与 DiR 染色的休眠型无鞭毛体（图 2C），分别使用红色（激发/发射波长 561/620–660 nm）和红外色（激发/发射波长 785/845–55 nm）通道。对于在 CD8 报告小鼠中共同检测 T 细胞与表达 tdTomato 的寄生虫（图 2D），分别使用绿色（激发/发射波长 488/525–50 nm）和红色通道。</li>
		<li>对于共感染实验（图 2E），以及在核报告小鼠中共同检测表达 GFP 的寄生虫（图 2F），分别使用绿色和红色通道。对于检测表达 tdTomato 的寄生虫、核染料及心脏血管系统（图 3B、C），分别使用红色、绿色和远红（激发/发射波长 640/680–730 nm）通道。</li>
		<li>使用远红通道检测抗 RFP 抗体，使用绿色通道检测抗 GFP 纳米抗体（图 3D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将获取的 TIFF 图像序列导入 Imaris v9.7.2 软件（参见材料表），进行三维器官重建。</li>
</ol>
9. 使用 Imaris 软件进行表面重建与定量分析
<ol>
	<li>选择表面检测算法工具，并在图像分析软件中启动向导。</li>
	<li>在选定的三维感兴趣区域（随机选择）中进行初步分析，然后将其应用于整个三维器官重建。选择感兴趣区域 (ROI)后，选择待分析的通道，取消勾选平滑按钮，并选择背景扣除。 
	注意：背景扣除会为每个体素计算唯一的局部背景值，并从原始像素值中减去该值。对于T. cruzi感染的细胞，能够完全拟合进目标物体的最大球体直径应不超过200 µm；T细胞为10 µm；单个寄生虫为5 µm。</li>
	<li>使用直方图调整分类，并通过滤波下拉列表选择用于分类的测量参数。 
	注意：建议使用直方图调整分类，推荐采用椭圆率（扁球形）和球形度作为测量参数。</li>
	<li>完成向导设置，点击统计按钮，获取每个时间点寄生虫感染细胞或T细胞的总数，即不连通组分的数量。</li>
</ol>

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<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

目前缺乏对寄生虫及其免疫反应的广泛性全器官成像，这限制了人们对宿主-寄生虫相互作用复杂性的理解，并阻碍了恰加斯病疗法的评估。本研究采用CUBIC技术对感染了T. cruzi的小鼠完整器官和组织进行透明化处理和染色。
本研究测试了多种组织透明化方案（PACT32、ECi33、FLASH34、iDISCO11,26 和 fDISCO13）；然而，只有 CUBIC 能够较好地保留 tdTomato 或 GFP 寄生虫荧光信号。类似地，既往研究报道，与其他组织透明化方法相比，CUBIC 能更好地保留内源性表达的标记物35。
有限的分辨率是当前传统光片显微镜的缺陷之一...

恰加斯病由原虫寄生虫T. cruzi引起，是全球最被忽视的热带病之一，每年导致约13,000人死亡。该感染通常从急性期进展至慢性期，其中30%的患者会出现心脏病变，包括心律失常、心力衰竭和猝死1,2。尽管在急性期宿主对寄生虫产生强烈的免疫反应，但少量寄生虫可在宿主体内长期持续存在于心脏和骨骼肌等组织中。多种因素可能共同导致T. cruzi逃避宿主免疫系统的彻底清除，包括适应性免疫反应的延迟启动以及寄生虫存在非复制形式3,4,5,6。此外，非复制的休眠形式寄生虫对锥虫杀灭药物的敏感性较低，这可能部分解释了临床上观察到的治疗失败现象7,8。
新型成像技术的发展为深入了解寄生虫在感染组织中的空间分布及其与参与控制寄生虫的免疫细胞之间的关系提供了契机。这些特征对于更好地理解免疫系统控制寄生虫的过程，以及追踪慢性感染组织中罕见的休眠寄生虫具有重要意义。
光片荧光显微镜（LSFM）是一种无需切片即可对大块组织或器官进行三维成像的最全面且无偏倚的方法之一。光片显微镜利用一束薄层光线仅激发焦平面内的荧光分子，从而减少样品的光漂白和光毒性，并借助超高速相机记录数千层组织的图像。为实现激光在组织中的有效穿透，需要获得高度透明的组织，这通常通过组织脱脂和脱色后均一化折射率（RI）来实现，该过程可减少光散射，从而获得高质量图像9,10,11。
组织透明化技术已发展用于整只小鼠12,13,14、类器官15,16,17、表达报告荧光标记物的器官18,19,20,21,22,23，以及最近少量的人体组织24的成像。目前的组织透明化方法可分为三类：（1）基于有机溶剂的方法，如DISCO系列方案25,26；（2）基于水凝胶的方法，如CLARITY27；以及（3）水性方法，如CUBIC（透明无障碍脑/体成像试剂与计算分析）18,19,28,29。CUBIC系列方案能够维持器官形态和组织完整性，并保留内源性表达的报告蛋白的荧光信号。该技术的最新改进版本CUBIC-HistoVision（CUBIC-HV）还可利用荧光标记抗体和DNA标记实现表位的检测28。
在本方案中，采用了CUBIC流程来检测在透明化完整小鼠组织中表达荧光蛋白的T. cruzi。光学透明的组织通过光片显微镜（LSFM）成像并进行三维重建，可自动定量每个器官中T. cruzi感染的细胞、休眠的无鞭毛体以及T细胞的精确总数。此外，该方案已成功应用于对透明化器官进行抗体和核染料的均匀标记。这些方法对于理解T. cruzi在感染宿主中的扩增与控制至关重要，并可用于恰加斯病化学治疗和免疫治疗药物的全面评估。

<table><tbody><tr><td>1-甲基咪唑</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（安替比林）</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 抗小鼠 Fab 片段</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 抗兔 Fab 片段</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP纳米抗体Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>抗RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-α-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm14(CAG-tdTomato)Hze&lt;/sup&gt;/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号 #007914</td><td>通用名称：Ai14、Ai14D 或 Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt; tm14(CAG-tdTomato)Hze&lt;/sup&gt;/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系 #007914</td><td>通用名称：Ai14、Ai14D 或 Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>碘化BOBO-1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>菌株 #032080</td><td>通用名称：Cd8a-Cre（E8III-Cre）</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 清洁擦拭纸</td><td>&amp;nbsp;Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D 免疫染色试剂盒</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D 细胞核染色试剂盒</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯凝胶超级胶水</td><td>透明胶带</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR（DiIC18(7)；1,1&amp;rsquo;-二辛基-3,3,3&amp;rsquo;,3&amp;rsquo;-四甲基吲哚三羰花青碘化物）公司：Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 离心管 15 mL</td><td>康宁</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 离心管 50&amp;nbsp; mL</td><td>康宁</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J16920.BBR</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma</td><td>#H3884 或 #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 文件转换器 x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>ImSpector 软件</td><td>LaVision BioTec，Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>23 号静脉注射针</td><td>萨托里，迷你萨特注射器滤器</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>无尘擦拭布</td></tr><tr><td>光片荧光显微镜</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II 成像系统</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头，10 个 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L 和 1,000 &amp;micro;L</td><td>Axygen</td><td>T-300、T-200-Y 和 T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>电动移液器分配器</td><td>Fisher Scientific，Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>封片液</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-丁基二乙醇胺</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-甲基烟酰胺</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 远红核染料</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>牺牲灌注系统</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>康宁 无菌</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green 核酸染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

完整透明器官中克氏锥虫感染细胞、休眠型无鞭毛体及t细胞的定量三维成像

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

恰加斯病是一种被忽视的疾病，影响全球数百万人，主要集中在拉丁美洲。恰加斯病的病原体Trypanosoma cruzi（T. cruzi）是一种专性胞内寄生虫，具有复杂的生物学特性，可感染包括人类在内的多种哺乳动物，导致心脏和消化系统病变。长期以来，人们一直需要可靠的方法来检测T. cruzi的体内感染，以深入理解恰加斯病复杂的生物学机制，并准确评估各种治疗方案的效果。本实验方案展示了一种集成化流程，可用于对经透明化处理并三维重建的器官中T. cruzi感染的细胞进行自动化定量分析。光片荧光显微镜技术能够精确地可视化和定量整个器官或组织中活跃增殖和休眠状态的T. cruzi寄生虫以及免疫效应细胞。此外，本研究成功采用了CUBIC-HistoVision流程，实现了对透明化器官使用抗体和核染料进行均匀标记。组织透明化结合三维免疫染色技术提供了一种无偏倚的方法，可全面评估药物治疗方案，加深对T. cruzi感染组织细胞结构的理解，并有望推动关于恰加斯病中抗T. cruzi免疫应答、组织损伤及修复机制的研究进展。

经CUBIC固定的组织用PBS洗涤以去除固定剂，随后在CUBIC-L试剂中孵育。CUBIC-L是一种含氨基醇的碱性缓冲溶液，可从组织中提取色素和脂质，使组织脱色，同时保持组织结构的完整性。纸上的网格线可透过组织清晰可见，表明器官已达到适当的透明效果(图2A)。脱脂后，组织经洗涤并分别浸入CUBIC-R+溶液和封片液中，以实现折射率均一化和成像(图2B)。
一只野生型小鼠被预先用DiR近红外花青染料染色并表达tdTomato的上鞭毛体感染。感染后15天处死小鼠，完整取出心脏，进行固定和透明处理。通过光片显微镜（LSFM）成像和三维重建，我们能够观察到表达tdTomato的增殖型T. cruzi寄生虫（红色）。红色通道中的自发荧光水平可用于准确显示心脏结构及边缘（图2C i）。光片显微镜（L...

本实验方案描述了光片荧光显微镜结合自动化软件辅助的方法，用于在完整且已透明化的器官和组织中可视化并精确定量增殖态与休眠态的Trypanosoma cruzi寄生虫及T细胞。这些技术为评估治疗效果提供了可靠手段，并有助于深入理解寄生虫与宿主之间的相互作用。

完整透明器官中克氏锥虫感染细胞、休眠型无鞭毛体及T细胞的定量三维成像

恰加斯病是一种被忽视的疾病，影响全球数百万人，主要集中在拉丁美洲。恰加斯病的病原体为克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）……

该技术为完整透明器官提供了更全面的三维图像，不仅可用于复制状态的寄生虫和免疫因子细胞的定量分析，也可用于休眠状态寄生虫和免疫因子细胞的定量分析。该技术使我们能够确定寄生虫、免疫细胞以及感染所致组织损伤之间的空间关联关系。表位免疫染色和DNA标记也可与该技术兼容。该方案已有效用于评估恰加斯病小鼠模型的治疗效果。在延长的治疗周期中，减少给药频率但提高单次剂量，可清除正在复制和处于休眠状态的寄生虫。本实验操作将由来自 Rick Tarleton 实验室的研究技术员 Caleb Hawkins 演示。安乐死后，按照文稿中所述方法解剖并固定感染小鼠的器官，将各个器官分别浸入10毫升50%稀释的CUBIC-L溶液中，置于50毫升锥形管内，室温下避光、轻轻振荡过夜。次日，将50% CUBIC-L溶液更换为10毫升100% CUBIC-L溶液，于37摄氏度孵育6天，期间将锥形管平放于摇床培养箱中持续振荡。此孵育阶段结束后，组织应几乎完全透明。用 PBS 在 37 摄氏度下轻轻振荡清洗透明器官两次，每次两小时。每次清洗后，将组织转移至新的 50 毫升锥形管中，以去除 Triton X-100。进行 DNA 染色时，将市售的核酸染料按 1:2,500 的比例稀释于 5 毫升染色缓冲液中。然后，将组织浸入含有核染色液的15毫升锥形管中，于37摄氏度下静置孵育，轻柔旋转五天。在室温下，用15毫升3D核染色洗涤缓冲液轻柔振荡洗涤组织三次，每次两小时。计算所需的一抗和二抗用量。在棕色2毫升离心管中混合一抗和二抗，在37摄氏度孵育1.5小时。进行缓冲液置换时，将7.5毫升2x HV1 3D免疫染色缓冲液与7.5毫升双蒸水混合。将组织样本浸入缓冲液中，于15毫升锥形管中水平放置，32摄氏度下轻轻振荡孵育1.5小时。从缓冲液置换介质中取出组织样本，浸入抗体染色液中。将组织样本单独在32摄氏度下孵育一周，于避光条件下轻轻振荡试管，保持直立状态。随后将组织样本转移至4摄氏度，继续在直立位置孵育。将HV1 3D免疫染色洗涤缓冲液冷却至4°C后，在4°C条件下，用15毫升缓冲液以水平位置轻轻振荡洗涤样本两次，每次30分钟。用HV1 3D免疫染色洗涤缓冲液将甲醛稀释至1%，并在4°C条件下将样本浸入8毫升该溶液中，轻轻振荡孵育24小时。随后，在37°C条件下，将样本置于新鲜的1%甲醛溶液中孵育1小时，并在25°C条件下用15毫升PBS洗涤2小时。将透明的器官浸入含有5毫升50%水稀释的CUBIC-R+溶液的50毫升锥形管中，在室温下轻轻振荡。更换为5毫升100% CUBIC-R+溶液，继续在室温下轻轻振荡孵育两天。用Kimwipes纸吸干组织，然后将其转移至六孔培养板中的5毫升封片溶液中，在室温下孵育。使用凝胶型超级胶水将组织粘附在显微镜样品架上。将样品浸入装有120毫升封片液的石英比色皿中。沿其纵轴的横截面方向进行成像，并将心脏粘附固定，使心尖与主动脉呈水平对齐。三维重建的克氏锥虫感染心脏显示，与心室相比，心房中感染细胞的比例更高。如三维放大插图所示，可在心脏中识别出休眠的寄生虫。在感染克氏锥虫的CD8报告小鼠的骨骼肌中，可观察到表达ZsGreen1的T细胞以及克氏锥虫感染的细胞。通过三维重建图像的3D放大观察，鉴定出感染细胞区域中的T细胞。利用共聚焦显微镜可视化T细胞与宿主感染细胞之间的界面。在免疫缺陷小鼠的心脏中，检测到宿主细胞感染了两种不同品系的克氏锥虫，对组织进行切片观察显示，在心脏心房不同深度的组织中存在大量被寄生虫感染的细胞。在克氏锥虫感染并清除的心脏组织中进行血管免疫检测，揭示了心脏复杂的血管网络结构。可在心房区域观察到被寄生的细胞。骨骼肌的核染色显示，在tdTomato标记的寄生虫稀少或无法检测的区域，细胞核出现聚集现象。使用抗RFP和GFP的抗体增强tdTomato和GFP寄生虫报告基因标记，并结合整体透明化骨骼肌处理，可产生强烈的荧光信号。因此，关键步骤包括在CUBIC缓冲液中的孵育时间、DNA染料中的稀释比例及孵育时间、抗体孵育时间，以及折射率匹配溶液中的孵育时间。若结合使用特异性抗体染色、荧光染料及快速反应方法，可显著提升该技术的应用潜力，实现对完整器官中多种细胞、细胞过程及结构的检测。我们现在有了更好且更全面的方法来研究负责杀灭寄生虫的免疫细胞、寄生虫长期持续存在的组织，以及特定药物在组织中的分布情况。

quantitative-3d-imaging-trypanosoma-cruzi-infected-cells-dormant

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

完整澄清器官中克 氏锥虫感染细胞、休眠无鞭毛虫和 T 细胞的定量 3D 成像

我们展示了利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因疟原虫进行脾脏活体显微成像的方法，并对疟原虫在该器官内的运动性及血流情况进行定量分析。...

活体脾脏显微成像：寄生虫运动性与血流的定量分析

我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。...

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在本方案中，使用荧光标记的 T. cruzi 被注入透明的斑马鱼幼鱼体内，并观察了寄生虫的运动性 体内...

建立幼体斑马鱼作为研究动物模型 克氏锥虫 运动性 在体 内

的 克氏锥虫 恰加斯病的病原体可引起长期无症状感染，随后突然发展为临床上可识别的病理状态。以下研究方案描述了一项短期的基于家庭的流行病学研究，旨在揭示 T. cruzi...

雄性和雌性美洲锥虫向未感染配偶的性传播

本方案描述了在锥虫感染期间生成代谢物分布三维模型的步骤，包括样品采集、代谢物提取、液相色谱-串联质谱数据采集概述、三维模型构建以及最终的数据可视化。...

研究锥虫感染的化学图谱学方法

本研究展示了一种详细的三相超结构扩展显微镜操作方案 体外 生活史阶段 克氏锥虫，恰加斯病的病原体。我们包含了细胞骨架蛋白和全蛋白质组标记的优化技术。...

体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

本文描述了一种能够在感染期间实现全器官范围内病原菌检测以及荧光报告基因活性定量的实验方法。...

高分辨率三维全器官微生物感染断层成像

本方案详细描述了在Trypanosoma...

揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

学习光片荧光显微技术对克氏锥虫感染细胞和T细胞进行定量三维成像的方法。该技术可评估查加斯病治疗效果，揭示寄生虫与宿主免疫细胞的相互作用机制。

完整透明器官中克氏锥虫感染细胞、休眠型无鞭毛体及T细胞的定量三维成像

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