使用3D打印技术制造工程血管瓣

我们的实验方案允许研究人员在完全工程化和可植入的皮瓣内生成分层血管网络，这为体内整合下血管行为的新研究铺平了道路。该技术结合了两种3D打印技术的多功能性，可以在微观和中尺度上创建和组装血管，这些血管可以使用显微外科手术直接与宿主血管吻合。完全工程化的血管化皮瓣可用于治疗大组织缺损，并为研究组织发育和整合提供平台。

所提出的方法可以扩展到研究组织特异性细胞的掺入，以及评估不同生物墨水和支持材料的使用。首先在BVOH模具中填充30微升聚合物溶液。将模具以100倍g离心2分钟，然后用另外20微升聚合物溶液填充模具，以确保完全填充。

将填充的模具在零下80摄氏度冷冻至少30分钟，以确保所有聚合物溶液冻结。通过冷冻过夜从模具中除去溶剂。要去除牺牲模具材料，请在轻柔搅拌下将冷冻干燥过程后的模具转移到5升去离子水浴中。

当浴缸变得浑浊时，更换水。当所有BVOH溶解时，风干支架并将其储存在真空室中直至使用。使用容积式移液器将大约4毫升制备的压实支撑材料转移到12孔板的每个孔中。

在坚硬的表面上敲击孔板，以迫使支撑材料在孔中均匀扩散。在10毫升内皮细胞培养基中制备含有200万HAMEC-ZsGreen和600万牙髓干细胞的悬浮液。将细胞悬浮液以200倍g离心4分钟，得到细胞沉淀，然后吸出上清液培养基并将细胞沉淀重悬于1毫升rhCollMA生物墨水中，得到总细胞浓度为每1毫升生物墨水800万个细胞的生物墨水。

将 0.22 毫米内径的针装入 3 毫升琥珀色打印墨盒，然后将墨盒放入 50 毫升锥形管中。使用正置换移液器从顶部填充1毫升细胞 - 生物墨水混合物到打印墨盒中，以减少气泡。将打印墨盒安装在生物打印机的相应工具中。

草绘一个 4 毫米正方形的 2D 图案，其中心包含一个直径为 2 毫米的圆形通道。将草图拉伸 4 毫米，得到一个带有中心通道的 4 毫米立方体。将此对象导出为 STL 文件。

将 12 孔板 STL 模板导入生物打印机切片软件的实体建模选项卡，并将其放置在虚拟打印床的指定区域。将立方体形状的 STL 文件导入生物打印机切片软件中的实体建模选项卡。单击"使用外部切片器"复选框，然后单击对象属性部分下的"配置切片器"。

在弹出窗口中，为填充图案选择直线图案，然后在填充密度中键入 30%，然后单击接受。单击立方体并使用鼠标移动它，将立方体形状的副本放置在每个所需的虚拟孔中。单击生物打印机切片软件材料选项卡中的添加材料按钮，为 rhCollMA 生物墨水创建新的材料设置。

选择用于打印的材料设置。对于压力，类型为 2 psi，对于速度类型，在相应的框中为 20 毫米/秒。将线宽和线高值指定为 0.24 毫米，将加速度值指定为每平方秒 400 毫米。

在实体建模选项卡中，单击立方体对象，然后单击材料部分中的 rhCollMA 材料以将其指定给立方体形状。在生物装配选项卡中，单击发送打印作业按钮将打印作业发送到生物打印机。将装有细胞生物墨水的打印墨盒装入基于3D挤出的生物打印机的3毫升环境气动点胶工具中。

单击生物打印机界面屏幕上"控制加热"或"冷却"选项卡下的"冷却"按钮，将打印床温度设置为4摄氏度。将印版与支撑浴槽一起装入打印机床上。在生物打印机界面屏幕上的"打印"选项卡中，单击打印作业，然后单击"开始"，然后单击"转到"以开始打印作业。

打印后，将孔板暴露在405纳米光源下，强度为每平方厘米3毫瓦，持续30秒，以启动rhCollMA生物墨水的交联。交联后，将孔板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育至少20分钟，直到所有支撑浴融化。轻轻吸出液化支撑浴，并用内皮细胞培养基代替。

将构建体在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。在支持材料去除生物打印的微血管网络后，立即在生物打印结构旁边放置纤连蛋白包被的PLLA:PLGA血管支架。将血管支架插入生物打印结构的主通道中。

将组装好的结构在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育两天。制备表达tdTomato的人脂肪微血管内皮细胞的细胞悬浮液，浓度为每毫升1000万个细胞。将此细胞悬浮液的20微升液滴放在疏水表面上。

轻轻地将血管支架放在液滴的顶部，使支架一端的管腔与细胞液滴接触。从支架的相对端吸出液滴，用细胞悬浮液填充其腔。将坐着的支架放入微量离心管中，并将其放入加湿培养箱内的旋转器中60分钟。

最后，将支架转移到12孔板中，并加入2毫升内皮细胞培养基。此处显示了在血管支架内皮衬里四天后拍摄的代表性工程皮瓣的侧视图。生物打印的微脉管系统以绿色显示，而内皮衬里以红色显示。

代表性图像显示了生物打印的脉管系统和内皮衬里之间的吻合。此处显示了孵育七天后平滑肌肌动蛋白，细胞核和内皮细胞的免疫染色。代表性图像显示了在钳子移除之前和夹具移除之后，工程皮瓣与大鼠股动脉的吻合完成的吻合。

该技术可用于研究体内3D打印脉管系统的成熟和整合，并监测植入物在后肢中的灌注，以确定其用于治疗组织缺陷的潜力和安全性。