水中抗生素抗性细菌的分离与鉴定及其抗生素抗性基因的分子表征

本方法可回答若干关键问题，例如：水样中耐药细菌的总体负荷是多少？这些细菌的种类是什么？它们携带了哪些不同类型的耐药性特征和耐药基因？本方案的优势在于能够检测出即使在实验室条件下无法培养的细菌，而这类细菌在水样所含的总细菌中占有相当大的比例。

因此，从理论上讲，不会遗漏任何细菌或其耐药性特征。这种结合了基于培养和非培养依赖技术的组合方法，可针对来自污水、制药厂或医院排放物、临床及非临床环境等各类样本进行复制和定制。与Devika一同演示实验操作的还有Harshali Shinde和Maitri Mishra，她们均来自我的实验室，是高级研究学者。

首先，通过无菌操作将水样用无菌纱布过滤，以去除其中的颗粒物。然后，对过滤后的水样进行系列稀释，以便进一步分析。为测定总细菌数量，取100微升适当稀释度的过滤水样，分别接种于固体R2A琼脂平板及其重复平板上，并均匀涂布。

将所有样品涂布平板在35至37摄氏度下孵育48小时。孵育结束后，计数菌落，并以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示总细菌负荷量。为测定耐药细菌数量，将抗生素分别加入含有20毫升无菌熔化的改良R2A琼脂（温度约为40摄氏度）的试管中。

在琼脂凝固前轻轻旋转混匀，并倒入无菌的培养皿中。为进行质量控制并检测抗生素的有效性，将100微升细菌悬液分别涂布于含有相应抗生素的改良R2A琼脂平板上。将平板在35至37摄氏度下培养48小时，然后测定细菌数量。

为准备用于PCR的DNA模板，使用无菌牙签挑取培养在培养皿上的单个分离纯菌落。将细菌菌落悬浮于微量离心管中100微升无菌双蒸水中，在沸水浴或干浴中100摄氏度加热10分钟。将悬浮液在10,000 g离心2分钟，使细胞碎片沉淀，然后将上清液转移至新的无菌微量离心管中，作为粗制DNA模板使用。

通过PCR扩增16S rRNA基因的V3区，在PCR管中配制40微升反应体系。将PCR管放入热循环仪的加热块中，运行相应的PCR程序。为分离并观察PCR扩增产物，取10微升扩增后的PCR产物与2微升6x上样缓冲液混合，将该混合物连同100 bp DNA分子量标记物一同加入1.5%琼脂糖凝胶的加样孔中，以估算扩增片段的大小。

在TAE电泳缓冲液中以80至100伏电压进行凝胶电泳，直至指示染料迁移至凝胶的3/4位置。随后在紫外透射仪下观察扩增产物条带。为制备接种物，使用无菌接种环无菌操作挑取一个分离的、纯化的抗生素抗性菌落，接种于2毫升不含任何抗生素的Luria-Bertani（LB）液体培养基中，于37摄氏度、80 rpm条件下过夜培养。

次日，将过夜培养的菌液 100 至 150 微升加入 2 毫升新鲜的非选择性 LB 肉汤中，培养 2 至 4 小时，直至 600 纳米处的光密度达到 0.4 至 0.5。使用无菌 0.85% 生理盐水溶液稀释新鲜培养的菌液悬液，并轻轻混匀，使细胞均匀分布，达到相当于 0.5 麦克法登标准的菌液浓度。稀释后 15 分钟内，将无菌棉签浸入菌液中，去除多余悬液，以避免平板接种过量。

然后用棉签将菌液均匀涂布于已准备好的穆勒-欣顿琼脂平板上，从顶部开始，来回涂布至边缘。接着将平板旋转60度，再次进行涂布。放置抗生素纸片时，使用经火焰灭菌的镊子，将抗生素纸片无菌转移至接种好的琼脂平板上。

轻轻按压纸片，确保其与琼脂表面完全接触。根据所用抗生素、目标微生物及平板大小，在琼脂平板上放置适量的抗生素纸片，避免抑菌圈重叠。在抗生素纸片贴附后15分钟内，将平板倒置，并于37°C下孵育过夜。

次日，以毫米为单位测量抑菌圈直径，并根据 EUCAST 提供的折点值进行判读。水样中总细菌负荷量为 3.0 × 10⁹ CFU/mL，且抗生素耐药菌负荷量较高。经测序鉴定，抗生素耐药菌的培养分离株属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），其中大多数为大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）。

此外，还鉴定出一些罕见的机会性细菌。通过纸片扩散法进行的抗生素敏感性试验显示，八个分离株的多重抗生素耐药指数约为 0.2，表明具有较高的耐药程度。然而，丛毛单胞菌属（Comamonas）和节杆菌属（Arthrobacter）物种对所测试的所有抗生素均未表现出耐药性。

可培养的分离菌株显示出存在编码抗β-内酰胺类、甲氧苄啶和氨基糖苷类抗生素的耐药基因。通过对总细菌多样性的宏基因组DNA分析，鉴定出50个门，表明细菌多样性较高，其中变形菌门（Proteobacteria）为最优势的门，包含α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）。在目水平上，伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）最为丰富，属于β-变形菌纲（Betaproteobacteria）。

在总体水平上，假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、土壤杆菌属（Pedobacter）、柄杆菌属（Prosthecobacter）、湖泊生境杆菌属（Limnohabitans）、黄杆菌属（Flavobacterium）和丛毛单胞菌属（Comamonas）是一些丰度较高的细菌。宏基因组DNA分析还揭示了更多的抗生素耐药基因。在本方法中，连续稀释步骤至关重要，因为任何误差都可能导致对总菌落形成单位（CFU）及抗生素耐药菌负荷的错误解读。

此外，应仔细测量抑菌圈的直径，以准确判断该分离株是耐药还是敏感。利用这些方案，除了水样外，还可研究其他任何样本，无论是环境样本、食品样本还是临床样本。而且，除了细菌之外，还可采用类似方法研究任何生态系统中的其他微生物群落。