Name: 水性抗生素耐药细菌的分离和鉴定及其抗生素耐药基因的分子表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习从水样中分离和鉴定抗生素耐药细菌的方法，结合培养法与非培养法技术进行抗生素耐药基因的分子表征。该方案可检测可培养和不可培养细菌，全面分析淡水样本中的细菌多样性。

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本工作部分得到了孟买大学科学技术部—促进大学研究与科学卓越计划（DST-PURSE）项目资金的资助。Devika Ghadigaonkar 在该计划下担任项目研究员。特此致谢科学技术部—科学与工程研究委员会（DST-SERB）项目（编号：CRG/2018/003624）的高级研究员 Harshali Shinde 提供的技术协助。

1. 样本采集与处理
<ol>
	<li>样品采集
	<ol>
		<li>在无菌采样容器中采集适量体积的水样，确保容器填充量不超过其容量的3/4。</li>
		<li>采集后应尽快在无菌条件下将样品运送至实验室，并立即进行处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品处理
	<ol>
		<li>使用无菌纱布对水样进行无菌过滤，以去除任何颗粒物。</li>
		<li>对过滤后的水样进行适当的系列稀释，用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 总细菌载量及耐药细菌数量的估算
<ol>
	<li>细菌总负荷的测定
	<ol>
		<li>将 18.12 g 改良 R2A 琼脂粉末悬浮于 1,000 mL 双蒸水中，加热溶解。将溶解后的混合物在高压灭菌器中于 121 &#176;C，15 psi 下灭菌 20 分钟。通过将适量高压灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中制备改良 R2A 琼脂平板（例如，向一个 90 mm 的无菌培养皿中加入约 20 mL 高压灭菌后的无菌培养基）。</li>
		<li>均匀铺展 100 &#181;L 将过滤后的水样适当稀释后，涂布于已凝固的改良R2A琼脂平板上。实验重复一次。</li>
		<li>将上述所有平板置于35-37 &#176;C 孵育48小时（根据所用分离培养基的不同，调整温度和孵育时间）。</li>
		<li>以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示总细菌负荷，使用公式（1): 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/63934/63934eq01.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160;(1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AR细菌数量的测定
	<ol>
		<li>按照步骤 2.1.1–2.1.4 操作。但与使用改良 R2A 琼脂平板不同，应分别使用添加了五种不同抗生素的改良 R2A 琼脂平板，即头孢噻肟（cefotaxime）3 &#181;g/mL），环丙沙星（0.5 &#181;g/mL），红霉素（20 &#181;g/mL），卡那霉素（15 &#181;g/mL），以及万古霉素（vancomycin）3 &#181;g/mL).</li>
		<li>将抗生素分别加入含有20 mL无菌熔融改良R2A琼脂的试管中（改良R2A琼脂的熔融温度应≤40 &#176;C）以达到步骤 2.2.1 中所述的最终抗生素浓度。</li>
		<li>轻轻混匀，趁琼脂未凝固前倒入无菌培养皿中。实验重复两次。</li>
		<li>将上述所有平板置于35-37 &#176;C 孵育48小时（若使用不同的培养基，温度和孵育时间可能有所不同）。</li>
		<li>为进行质量控制并检测抗生素的有效性，涂布 100 &#181;L 细菌悬液的 大肠杆菌 ATCC 25922 和 Staphylococcus aureus 将ATCC 29213菌株接种至各自含抗生素的改良R2A琼脂平板上（确保用于接种的新鲜培养物浓度为OD600 = 0.5）。</li>
		<li>按照步骤 2.1.4 中所述，以 CFU/mL 为单位测定耐药细菌数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离株的甘油菌种
	<ol>
		<li>挑选形态上不同的 AR 菌落。</li>
		<li>将单个分离的菌落悬浮于2 mL含相应抗生素的无菌Luria-Bertani肉汤中（例如，若菌落选自含有头孢噻肟的平板，则将2.3.1步骤中的菌落接种至含相应浓度头孢噻肟的无菌Luria-Bertani肉汤中）。</li>
		<li>将接种后的试管置于 37 &#176;C 80 rpm 下直至 OD600 达到 0.5。</li>
		<li>通过混合制备分离株的甘油菌种 750 &#181;L 步骤 2.3.3 中的培养悬液 250 &#181;L 在无菌条件下，加入无菌的100%甘油。</li>
		<li>将甘油菌种保存于 −80 &#176;C 直至进一步分析。 
		注意：复苏甘油冻存菌种时，需将甘油冻存管在 4 &#176;C将一环该菌种接种于含有相应抗生素的2 mL无菌LB肉汤培养基中，静置培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过16S rRNA基因测序鉴定可培养细菌
<ol>
	<li>PCR用DNA模板的制备 
	注意：本实验中用于从细菌中提取粗DNA作为PCR模板的方案由Carlson等人10提供。
	<ol>
		<li>使用无菌牙签挑取培养在培养皿上的单个、分离且纯的菌落，将其悬浮于无菌微量离心管中含100 µL无菌双蒸水的溶液中，煮沸10分钟。</li>
		<li>将悬浮液在10,000 × g 条件下离心2分钟以沉淀细胞碎片，将上清液转移至新的无菌微量离心管中，作为粗DNA模板使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>16S rRNA基因V3区的靶向PCR扩增及测序
	<ol>
		<li>在PCR管中配制40 µL反应体系进行PCR扩增，具体组分见表1。 
		注意：DNA制备过程应在冰上操作，尽量避免污染（操作试剂时应佩戴手套，并用70%乙醇彻底清洁工作台面）。</li>
		<li>将PCR管放入热循环仪的加热模块中，运行相应的程序。标准化的PCR扩增循环条件及用于扩增16S rRNA基因V3区的引物信息见表2。</li>
		<li>为分离和观察扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳（AGE）。取10 µL PCR扩增产物与2 µL 6x上样缓冲液（表3）混合，加样至1.5%琼脂糖凝胶的加样孔中（将1.5 g琼脂糖粉末溶于100 mL 1x TAE缓冲液中 [表3]），并在凝胶中加入5 µL 10 mg/mL溴化乙锭（EtBr），使溴化乙锭终浓度为0.5 µg/mL（100 mL凝胶中）。 
		警告：EtBr为强致癌物，操作含EtBr的试剂及凝胶时必须始终佩戴手套。</li>
		<li>加入DNA Marker以估算扩增片段的大小。</li>
		<li>在TAE电泳缓冲液中以80–100 V电压进行凝胶电泳。</li>
		<li>当示踪染料迁移至凝胶约3/4位置时，停止电泳，并在紫外透射仪下观察扩增条带。</li>
		<li>将PCR扩增产物（扩增子）用于16S rRNA基因测序，以鉴定菌株。</li>
		<li>通过分光光度法分析并使用公式（2）对扩增子进行定量。 
		<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/63934/63934eq02.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160;(2)</li>
		<li>为检测DNA纯度，计算A260/A280比值。 
		注意：理想情况下，该数值应高于1.5，最好介于1.8至2.0之间。</li>
		<li>通过使用适当的序列比对搜索工具，将所获得的序列与数据库中的序列进行比对，以鉴定菌株。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 采用抗生素药敏试验检测分离株的抗生素耐药性
注意：本方案描述了通过纸片扩散法进行抗生素敏感性试验（AST）的方法。所使用的抗生素纸片如下：头孢噻肟（5 µg）、氨苄西林（10 µg）、左氧氟沙星（5 µg）、氯霉素（30 µg）、替加环素（15 µg）、头孢曲松（30 µg）、亚胺培南（10 µg）、庆大霉素（10 µg）、新霉素（10 µg）、甲氧苄啶（5 µg）和环丙沙星（5 µg）。
<ol>
	<li>药敏试验（AST）接种物的制备
	<ol>
		<li>使用无菌接种环，将单个、分离且纯化的耐药菌（AR）菌落无菌接种至2 mL无菌非选择性培养基（如不含任何抗生素的LB肉汤）中，在37 °C、80 rpm条件下过夜培养。</li>
		<li>取100–150 µL过夜培养的菌液（约OD600 = 1.8–2.0）重悬于2 mL新鲜的非选择性LB肉汤培养基中，继续培养2–4小时（直至OD600达到0.4–0.5）。</li>
		<li>用无菌0.85%生理盐水稀释该新鲜培养的菌悬液，使菌液浓度相当于0.5麦氏比浊标准（约OD600 = 0.1），相当于菌密度约为1–2 × 108 个细胞/mL。</li>
		<li>轻轻混匀细菌悬液，确保细胞分布均匀。</li>
		<li>稀释后15分钟内使用上述菌悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂平板的接种
	<ol>
		<li>通过将38 g Mueller-Hinton琼脂（MHA）溶于1,000 mL双蒸水中并加热溶解，制备用于药敏试验的MHA平板，121 °C、15 psi条件下高压灭菌15分钟。</li>
		<li>确保平板中MHA的厚度为4 mm（每板25 mL培养基）。</li>
		<li>同时，将抗生素纸片从冰箱中取出，并使其升至室温。 
		注：为避免纸片表面冷凝水影响抑菌圈（ZOI）结果，应先将纸片在4 °C缓慢解冻，再转移至室温。</li>
		<li>在无菌条件下，将无菌棉签浸入步骤4.1制备的接种物中，轻轻挤去多余液体，避免平板接种过量。</li>
		<li>从MHA平板顶部开始，来回均匀涂布菌液至边缘，并在涂布过程中每涂布约60°旋转平板一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗生素纸片的放置
	<ol>
		<li>使用火焰灭菌的镊子，在无菌条件下将抗生素纸片转移至已接种的MHA平板上，并轻轻按压纸片，确保其与琼脂表面完全、平整接触。 
		注：此操作必须在平板接种后15分钟内完成。</li>
		<li>根据待测菌种、所用抗生素及平板大小，合理放置适量抗生素纸片，避免抑菌圈重叠。 
		注：直径90 mm的圆形平板可放置4至5个纸片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平板的培养
	<ol>
		<li>在抗生素纸片放置后15分钟内，将平板倒置，在37 °C条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果判读
	<ol>
		<li>测量抑菌圈（ZOI）直径（单位：mm），并依据EUCAST11提供的折点值进行判读。参见以下两个示例：
		<ol>
			<li>针对Enterobacterales，环丙沙星（5 µg）抗生素纸片的抑菌圈直径折点（mm）为S ≥ 25，R &#60; 22，即当ZOI ≥ 25 mm时判定为敏感（S），ZOI &#60; 22 mm时为耐药（R）。若ZOI直径介于22至25 mm之间，则该分离株判定为中介（I）。</li>
			<li>针对Staphylococcus spp.，氯霉素（30 µg）抗生素纸片的抑菌圈直径折点（mm）为S ≥ 18，R &#60; 18，即当ZOI ≥ 18 mm时为敏感，ZOI &#60; 18 mm时为耐药。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过计算分离株对所测试抗生素中耐药抗生素种类数与总测试抗生素种类数的比值，确定多重耐药指数（MAR指数）。 
		&#8203;注：质量控制中，按照步骤4的方案，使用E. coli ATCC 25922和S. aureus ATCC 29213作为标准参考菌株。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过PCR检测分离株中的抗生素抗性基因
<ol>
	<li>采用标准PCR方案对分离株中的耐药基因（ARGs）进行鉴定。使用步骤3.1中所述的方案制备DNA模板。 
	注意：本研究中使用的PCR扩增条件为：94 °C 预变性10 min，随后进行35个循环（94 °C 变性30 s，退火温度根据各引物对优化条件确定，退火30 s，72 °C 延伸40 s），最后在72 °C 延伸5 min。反应体系组成见表4。耐药基因（ARGs）、引物序列及退火温度列表见表5。</li>
	<li>为分离、观察并检测扩增产物的纯度，请执行步骤3.2.3–3.2.10。</li>
</ol>
6. 宏基因组DNA分析，用于鉴定总细菌多样性及检测宏基因组中的抗生素抗性基因（ARGs）
<ol>
	<li>从水样中提取总DNA（宏基因组）
	<ol>
		<li>从过滤后的水样中提取宏基因组DNA。 
		注意：在本研究中，使用参考的DNA提取试剂盒并按照制造商提供的方案，从过滤后的水样中提取宏基因组DNA（总DNA）（见材料表）。</li>
		<li>取3 µL提取的宏基因组DNA上样至0.8%琼脂糖凝胶，在80–110 V电压下电泳约30分钟，以检测DNA质量。</li>
		<li>检查是否出现单一完整条带。</li>
		<li>使用荧光计测定DNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用全宏基因组DNA测序分析细菌多样性及耐药基因（ARGs）的检测
	<ol>
		<li>文库制备与PCR扩增：
		<ol>
			<li>使用参考的DNA文库制备试剂盒制备双端测序文库（见材料表）。</li>
			<li>取200 ng DNA，通过机械剪切将其打断为较小片段，随后进行末端修复，并在3'端添加一个“A”碱基，以准备接头连接。</li>
			<li>根据所使用的测序平台，在DNA片段两端连接特定的接头。 
			注意：这些接头中含有对双索引文库结合至流动池进行测序至关重要的序列，可实现接头连接片段的PCR扩增，并允许标准测序引物结合。</li>
			<li>按照制造商说明，使用高灵敏度DNA芯片分析扩增后的文库，以检测其质量与数量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>簇生成与测序：
		<ol>
			<li>将扩增后的文库加载至相应的测序平台，进行簇生成及后续测序。 
			注意：文库分子会结合到双端流动池上互补的接头寡核苷酸上。在测序过程中，逆转录链重新合成后，正向链被选择性切割，随后从片段的另一端对复制出的逆转录链进行测序。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>生物信息学分析：
		<ol>
			<li>利用适当的平台对高质量数据进行拼接，生成支架序列（scaffolds）。</li>
			<li>对这些支架序列进行生物信息学分析，以实现分类学注释及耐药基因（ARGs）的鉴定。 
			注意：用于鉴定宏基因组中全部细菌多样性及检测耐药基因（ARGs）的全宏基因组DNA分析流程见图1。本文所述完整方法的流程图见图2。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance%3A+A+global+multifaceted+phenomenon%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon.</a> Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).</li>
<li>Knight, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance+and+COVID-19%3A+Intersections+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications.</a> Elife. 10, 64139(2021).</li>
<li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistance+crisis%3A+Part+1%3A+Causes+and+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacy+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats.</a> Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).</li>
<li>Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+of+total+microbial+diversity+and+antibiotic+resistance+of+culturable+microorganisms+in+raw+chicken+meat+and+mung+sprouts+%28Phaseolus+aureus%29+sold+in+retail+markets+of+Mumbai%5BTitle%5D)+AND+%22India.+Current+Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai.</a> India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).</li>
<li>Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multiple+antibiotic+resistance+of+culturable+microorganisms+and+metagenomic+analysis+of+total+microbial+diversity+of+marine+fish+sold+in+retail+shops+in+Mumbai%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India.</a> Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).</li>
<li>Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater+as+a+point+source+of+antibiotic-resistance+genes+in+the+sediment+of+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake.</a> The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).</li>
<li>Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+pollution+in+the+environment%3A+From+microbial+ecology+to+public+policy%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy.</a> Microorganisms. 7 (6), 180(2019).</li>
<li>Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+human+hand+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Review of human hand microbiome research.</a> Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).</li>
<li>de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+approaches+to+analyze+antimicrobial+resistance%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview.</a> Frontiers in Genetics. 11, 575592(2021).</li>
<li>Carlson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+multiresistant+Salmonella+typhimurium+DT104+using+multiplex+and+fluorogenic+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).</li>
<li>Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf">https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf</a> (2022).</li>
<li>Bharti, R., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+and+best-practice+protocols+for+microbiome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).</li>
<li>Choo, J., Leong, L., Rogers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+storage+conditions+significantly+influence+faecal+microbiome+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles.</a> Scientific Reports. 5, 16350(2015).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Dilution+Antimicrobial+Susceptibility+Tests+for+Bacteria+that+Grow+Aerobically%2C+11th+edition%22">Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).</li>
<li>Bayot, M., Bragg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Susceptibility+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Susceptibility Testing.</a> StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).</li>
<li>Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+antibiotic+resistance+index+of+Escherichia+coli+isolates+in+a+tertiary+hospital+in+South-West+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Journal+of+Zambia%22%5BJournal%5D)">Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria.</a> Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).</li>
<li>Lorenz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Rolin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+and+human+gut+as+reservoirs+of+transferable+antibiotic+resistance+encoding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes.</a> Frontiers in Microbiology. 4, 173(2013).</li>
<li>Racewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+characterisation+of+antimicrobial+resistance+genes+and+class+1+and+2+integrons+in+multiresistant+Escherichia+coli+isolated+from+poultry+production%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production.</a> Scientific Reports. 12, 6062(2022).</li>
<li>Gebreyes, W., Thakur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+Salmonella+enterica+serovar+Muenchen+from+pigs+and+humans+and+potential+interserovar+transfer+of+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+characteristics+of+extended-spectrum+%CE%B2-lactamase+and+plasmid-mediated+fluoroquinolone+resistance+genes+in+Escherichia+coli+isolated+from+chickens+in+Anhui+Province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China.</a> PLoS One. 9 (8), 104356(2014).</li>
<li>Akers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycoside+resistance+and+susceptibility+testing+errors+in+Acinetobacter+baumannii-calcoaceticus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).</li>
<li>Ciesielczuk, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Extra-intestinal+pathogenic+Escherichia+coli+in+the+UK%3A+The+importance+in+bacteraemia+versus+urinary+tract+infection%2C+colonisation+of+widespread+clones+and+specific+virulence+factors%22">Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors</a>. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

样本的采集与处理具有重要意义，可能影响研究结果及其解释。因此，为了排除样本间的变异性，应在所研究的淡水体多个不同位置进行采样。在处理此类样本时，维持适当的无菌环境条件可防止污染。此外，为避免细菌组成发生变化而影响提取核酸的质量和数量，样本从采集到后续处理的运输过程应保持在4 °C条件下，并尽量缩短时间间隔。已有多个研究指出，若未谨慎控制样本采集与处理之间的这一过渡期，可能在后续分析阶段导致结果出现差异12,13。
使用不同稀释度进行涂布可确保菌落既不会重叠成团，也不会因数量过少而难以计数。实验需设置重复组，以消除因移液或操作误差导致的CFU/mL结果差异。此外，每次实验均需设置对照组平板，以确认所用抗生素有效，并排除假阳性结果。因此，对照组平板上应无可见菌落生长，这表明所用抗生素具有抑菌效果。
在进行药敏试验（AST）时，接种菌液的浓度和琼脂平板的厚度可能影响抑菌圈（ZOI）的直径，从而影响结果的判读。因此，在...

抗菌素耐药性（AMR）已被确定为全球最紧迫的问题之一。AMR 的快速演化及其在全球范围内的传播，因其相关的医疗成本，已成为威胁人类健康和全球经济的最大挑战之一1。抗生素的过度使用和不当使用导致了耐药性的增加。这一点在 COVID-19 大流行期间尤为突出，许多患者因存在 AMR，其相关继发性感染的治疗在很大程度上受到严重影响2。除了人类对抗生素的直接使用或滥用外，农业和畜牧业中抗生素的过度使用和不当使用，以及将其不当排放到环境中（包括水体），也是一个重大关切问题3。细菌中新耐药性状和多重耐药性的出现，迫切凸显了深入理解导致耐药性产生及其传播因素的重要性。多种抗生素耐药菌通常在质粒等可移动遗传元件上携带多个耐药基因（ARGs），可将这些耐药基因转移给非耐药微生物，包括潜在的人类病原体，从而导致“超级细菌”的出现，甚至对最后手段的抗生素也无效4。如果这些多重耐药菌存在于水生生态系统中，可通过食用受污染的水产品（如鱼类、螃蟹和软体动物）直接进入人体肠道。via 此途径。先前的研究表明，自然水体系统中耐药菌的传播还可能波及其他水源，包括饮用水，从而进入人类食物链5,6,7。
本研究的目的是提供一套综合方案，结合基于培养和非基于培养（全宏基因组分析）的技术，以全面获取印度孟买某水体中总细菌多样性及各类抗生素抗性基因（ARGs）库的完整信息。传统上，研究水体中细菌多样性主要采用基于培养的技术。由于可培养的微生物仅占任何生境中总微生物群的一小部分，因此为了更全面地了解样本中细菌多样性的整体状况以及普遍存在的各种抗性特征，必须联合使用基于培养和非依赖培养的技术。其中一种强大且可靠的非依赖培养技术即为全宏基因组DNA分析。该高通量方法已在多项关于细菌多样性或各类抗生素抗性基因功能注释的研究中成功应用8,9。该技术以宏基因组（样本中的全部遗传物质）作为多种分析的起始材料，因而无需依赖培养。本研究中的方案可用于水样中全宏基因组DNA分析，以获取有关总细菌多样性及各类抗生素抗性基因（耐药组，resistome）的信息。

<table><tbody><tr><td>100 bp DNA 标准分子量标记</td><td>Himedia</td><td>MBT049-50LN</td><td>用于估计扩增片段的大小</td></tr><tr><td>2x PCR Taq 预混液</td><td>HiMedia</td><td>MBT061-50R</td><td>用于配制 PCR 反应体系</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 培养箱</td><td>GS-192, Gayatri Scientific</td><td>NA</td><td>用于细菌培养</td></tr><tr><td>6x 上样缓冲液</td><td>HiMedia</td><td>ML015-1ML</td><td>上样和示踪染料，有助于增加 DNA 样品比重并监测电泳进程</td></tr><tr><td>琼脂糖粉末</td><td>Himedia</td><td>MB229-50G</td><td>用于琼脂糖凝胶电泳（AGE）中分离扩增产物</td></tr><tr><td>氨苄西林抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD002</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Equitron</td><td>NA</td><td>用于培养基、玻璃平板、试管等物品的灭菌</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>用于检测扩增文库的质量和数量</td></tr><tr><td>生物安全二级 B2 型柜</td><td>IMSET</td><td>IMSET BSC-Class II Type B2</td><td>用于细菌培养、抗生素敏感性试验（AST）等微生物学操作</td></tr><tr><td>头孢噻肟抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD295E-5VL</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>头孢噻肟抗生素粉末</td><td>HiMedia</td><td>TC352-5G</td><td>用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液</td></tr><tr><td>头孢曲松抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD065</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>微量离心机 Minispin</td><td>Eppendorf</td><td>Minispin Plus-5453</td><td>用于粗提 DNA 过程中沉淀杂质</td></tr><tr><td>氯霉素抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD006-5x50DS</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>环丙沙星抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD060-5x50DS</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>环丙沙星抗生素粉末</td><td>HiMedia</td><td>TC447-5G</td><td>用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液</td></tr><tr><td>比色计</td><td>Quest</td><td>NA</td><td>用于测定菌液悬浮液的光密度（OD）</td></tr><tr><td>综合性抗生素耐药基因数据库（CARD）</td><td></td><td></td><td>用于抗生素耐药基因（ARGs）的功能注释；https://card.mcmaster.ca/</td></tr><tr><td>冷却摇床培养箱</td><td>BTL41 Allied Scientific</td><td>NA</td><td>用于培养细菌的培养基平板的孵育</td></tr><tr><td>超低温冰箱（-40 &amp;deg;C）&amp;nbsp;</td><td>Haier</td><td>DW40L, Haier Biomedicals</td><td>用于甘油菌种的保存</td></tr><tr><td>DNA 文库构建试剂盒</td><td>NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NA</td><td>用于双端测序文库的制备</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>HiMedia</td><td>GRM1195-100G</td><td>用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液</td></tr><tr><td>电泳装置</td><td>TechResource</td><td>15 cm 凝胶制胶托盘</td><td>用于制备琼脂糖凝胶&amp;nbsp;并进行电泳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带电极的电泳电源</td><td>Genei</td><td>NA</td><td>用于运行琼脂糖凝胶电泳（AGE）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>红霉素抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD222-5VL</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>红霉素抗生素粉末</td><td>HiMedia</td><td>CMS528-1G</td><td>用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液</td></tr><tr><td>红霉素抗生素粉末</td><td>HiMedia</td><td>TC024-5G</td><td>用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; ATCC 25922&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>0335X-1</td><td>在进行抗生素敏感性试验（AST）时作为对照菌株</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>HiMedia</td><td>MB071-1G</td><td>用于电泳后在凝胶成像系统下对 DNA 进行嵌入染色和可视化</td></tr><tr><td>荧光计</td><td>Qubit 2.0</td><td>NA</td><td>用于测定提取的宏基因组 DNA 的浓度</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>BioRad</td><td></td><td>用于电泳后观察 PCR 扩增产物</td></tr><tr><td>庆大霉素抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD170-5x50DS</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>HiMedia</td><td>AS119-500ML</td><td>用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液</td></tr><tr><td>甘油</td><td>HiMedia</td><td>GRM1027-500ML</td><td>用于制备甘油菌种保存液</td></tr><tr><td>亚胺培南抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD073</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>Kaiju 数据库</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于测序读段的分类学归属分析；https://kaiju.binf.ku.dk/</td></tr><tr><td>卡那霉素抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD017-5x50DS</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>卡那霉素抗生素粉末</td><td>HiMedia</td><td>MB105-5G</td><td>用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液</td></tr><tr><td>左氧氟沙星抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD216-5VL</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>LB 肉汤培养基</td><td>Himedia</td><td>M1245-500G</td><td>用于菌液的富集培养</td></tr><tr><td>麦氏比浊标准</td><td>Himedia</td><td>R092-1No</td><td>用于比较菌液悬浮液的浓度</td></tr><tr><td>分子生物学用水</td><td>HiMedia</td><td>TCL018-500ML</td><td>用于配制 PCR 反应体系</td></tr><tr><td>穆勒-欣顿琼脂（MHA）&amp;nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M173-500G</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>新霉素抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD731-5x50DS</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>PCR 梯度热循环仪</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz&amp;nbsp;</td><td>用于扩增 16S rRNA 区域及多种抗生素耐药基因的 PCR 反应</td></tr><tr><td>引物&amp;nbsp;</td><td>Xcelris</td><td>NA</td><td>用于 PCR 扩增&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>改良 R2A 琼脂</td><td>HiMedia</td><td>M1743</td><td>用于制备培养基平板，以分离总细菌和抗生素耐药菌（AR）</td></tr><tr><td>支架序列生成</td><td>CLC Genomics Workbench 6.0</td><td>NA</td><td>用于生成支架序列</td></tr><tr><td>测序仪</td><td>Illumina 平台（2 x 150 bp 化学体系）</td><td>NA</td><td>用于扩增文库的测序</td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>TC046-500G</td><td>用于配制 0.85% 生理盐水，以对水样进行系列稀释</td></tr><tr><td>土壤 DNA 提取试剂盒</td><td>Xcelgen</td><td>NA</td><td>用于从过滤后的水样中提取完整的宏基因组 DNA&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt; subsp. aureus ATCC 29213</td><td>HiMedia</td><td>0365P</td><td>在进行抗生素敏感性试验（AST）时作为对照菌株</td></tr><tr><td>分类学归属分析</td><td>Kaiju 生物信息学工具</td><td>NA</td><td>用于将测序读段分类至从门到属的不同分类学层级&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>综合性抗生素耐药基因数据库（CARD）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于抗生素耐药基因（ARGs）的功能注释</td></tr><tr><td>替加环素抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD278</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>甲氧苄啶抗生素纸片</td><td>HiMedia</td><td>SD039-5x50DS</td><td>用于进行抗生素敏感性试验（AST）</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>HiMedia</td><td>TC072-500G</td><td>用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液</td></tr><tr><td>万古霉素抗生素粉末</td><td>HiMedia</td><td>CMS217</td><td>用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME204 Mettler Toledo</td><td>用于称量培养基粉末、试剂粉末等</td></tr><tr><td>NA - 不适用</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

水中抗生素抗性细菌的分离与鉴定及其抗生素抗性基因的分子表征

Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes

淡水体相关微生物群落中抗生素耐药性（AR）的发展与传播是全球公共卫生的重大关切问题。本研究采集了淡水样本，结合传统基于培养的技术和高通量非培养依赖型宏基因组学方法，对样本中的总细菌多样性及抗生素耐药基因（ARGs）进行了分析。本文提供了一套系统性实验方案，用于定量淡水样本中可培养的总细菌及抗生素耐药性可培养细菌，并对可培养分离株进行表型和基因型耐药性的鉴定。此外，我们还报道了对从淡水样本中提取的总宏基因组DNA进行全宏基因组分析的方法，以鉴定水体中整体细菌多样性（包括不可培养细菌）以及全部不同ARGs（耐药组）的组成。依据这些详细的操作流程，我们观察到淡水样本中抗生素耐药细菌负荷较高，范围达9.6 × 105-1.2 × 109 CFU/mL。大多数分离株对多种测试抗生素具有耐药性，包括头孢噻肟、氨苄西林、左氧氟沙星、氯霉素、头孢曲松、庆大霉素、新霉素、甲氧苄啶和环丙沙星，其多重抗生素耐药（MAR）指数≥0.2，表明分离株具有较高的耐药水平。16S rRNA测序鉴定出潜在的人类病原体，例如 肺炎克雷伯菌,&#160;以及机会性细菌，例如 康氏菌 sp.， 微球菌属 spp. 节杆菌属 种（复数形式）., 和 气单胞菌属 spp。对分离株的分子特征分析显示存在多种ARGs，例如 blaTEM, blaCTX-M （β-内酰胺类） aadA, aac(6')-Ib （氨基糖苷类），以及 dfr1 （甲氧苄啶），这一点也通过全宏基因组DNA分析得到了证实。其他编码抗生素外排泵的抗生素抗性基因（ARGs）也表现出较高的 prevalence。mtrA, macB, mdtA, acrDβ-内酰胺酶-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ 的&#160;氯霉素乙酰转移酶基因 catB10 和&#160;利福平抗性基因 rphB-在宏基因组DNA中也检测到了该基因。通过本研究讨论的实验方案，我们证实了水体中存在具有多种耐药表型和基因型特征的水传播多重耐药细菌。因此，全宏基因组DNA分析可作为传统基于培养技术的补充方法，用于评估水体的整体耐药状况。

总细菌负荷量与抗生素耐药性（AR）细菌计数 
通过将水样稀释 10−4 至 10−6 倍后涂布于改良 R2A 琼脂培养基上，对总细菌负荷量进行计数。为测定 AR 细菌数量，将稀释 10−3 至 10−6 倍的样品涂布于含有抗生素的培养基平板上（图 3）。总细菌和 AR 细菌数量均以 CFU/mL 表示，所有涂板实验均设两个重复。根据上述实验方案，本研究测得总细菌数量为 3.0 × 109 CFU/mL。AR 细菌负荷量较高，范围为 9.6 × 105–1.2 × 109 CFU/mL（表 6）。
通过16S rRNA基因测序鉴定可培养细菌 
每个分离株的粗提DNA均用作模板，进行16S rRNA基因特异性PCR扩增。在总共测序的15株抗性（AR）分离株...

本文介绍了一种从水体中分离和鉴定耐药细菌的详细方案，以及对其耐药基因（ARGs）进行分子表征的方法。通过基于培养和非培养依赖性（宏基因组分析）技术的结合，可全面了解印度孟买淡水环境中细菌多样性的总体情况以及存在的各类耐药基因的总库。

淡水生态系统相关微生物群中抗生素耐药性（AR）的发展与传播是全球健康面临的主要问题之一。在……

本方法可回答若干关键问题，例如：水样中耐药细菌的总体负荷是多少？这些细菌的种类是什么？它们携带了哪些不同类型的耐药性特征和耐药基因？本方案的优势在于能够检测出即使在实验室条件下无法培养的细菌，而这类细菌在水样所含的总细菌中占有相当大的比例。因此，从理论上讲，不会遗漏任何细菌或其耐药性特征。这种结合了基于培养和非培养依赖技术的组合方法，可针对来自污水、制药厂或医院排放物、临床及非临床环境等各类样本进行复制和定制。与Devika一同演示实验操作的还有Harshali Shinde和Maitri Mishra，她们均来自我的实验室，是高级研究学者。首先，通过无菌操作将水样用无菌纱布过滤，以去除其中的颗粒物。然后，对过滤后的水样进行系列稀释，以便进一步分析。为测定总细菌数量，取100微升适当稀释度的过滤水样，分别接种于固体R2A琼脂平板及其重复平板上，并均匀涂布。将所有样品涂布平板在35至37摄氏度下孵育48小时。孵育结束后，计数菌落，并以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示总细菌负荷量。为测定耐药细菌数量，将抗生素分别加入含有20毫升无菌熔化的改良R2A琼脂（温度约为40摄氏度）的试管中。在琼脂凝固前轻轻旋转混匀，并倒入无菌的培养皿中。为进行质量控制并检测抗生素的有效性，将100微升细菌悬液分别涂布于含有相应抗生素的改良R2A琼脂平板上。将平板在35至37摄氏度下培养48小时，然后测定细菌数量。为准备用于PCR的DNA模板，使用无菌牙签挑取培养在培养皿上的单个分离纯菌落。将细菌菌落悬浮于微量离心管中100微升无菌双蒸水中，在沸水浴或干浴中100摄氏度加热10分钟。将悬浮液在10,000 g离心2分钟，使细胞碎片沉淀，然后将上清液转移至新的无菌微量离心管中，作为粗制DNA模板使用。通过PCR扩增16S rRNA基因的V3区，在PCR管中配制40微升反应体系。将PCR管放入热循环仪的加热块中，运行相应的PCR程序。为分离并观察PCR扩增产物，取10微升扩增后的PCR产物与2微升6x上样缓冲液混合，将该混合物连同100 bp DNA分子量标记物一同加入1.5%琼脂糖凝胶的加样孔中，以估算扩增片段的大小。在TAE电泳缓冲液中以80至100伏电压进行凝胶电泳，直至指示染料迁移至凝胶的3/4位置。随后在紫外透射仪下观察扩增产物条带。为制备接种物，使用无菌接种环无菌操作挑取一个分离的、纯化的抗生素抗性菌落，接种于2毫升不含任何抗生素的Luria-Bertani（LB）液体培养基中，于37摄氏度、80 rpm条件下过夜培养。次日，将过夜培养的菌液 100 至 150 微升加入 2 毫升新鲜的非选择性 LB 肉汤中，培养 2 至 4 小时，直至 600 纳米处的光密度达到 0.4 至 0.5。使用无菌 0.85% 生理盐水溶液稀释新鲜培养的菌液悬液，并轻轻混匀，使细胞均匀分布，达到相当于 0.5 麦克法登标准的菌液浓度。稀释后 15 分钟内，将无菌棉签浸入菌液中，去除多余悬液，以避免平板接种过量。然后用棉签将菌液均匀涂布于已准备好的穆勒-欣顿琼脂平板上，从顶部开始，来回涂布至边缘。接着将平板旋转60度，再次进行涂布。放置抗生素纸片时，使用经火焰灭菌的镊子，将抗生素纸片无菌转移至接种好的琼脂平板上。轻轻按压纸片，确保其与琼脂表面完全接触。根据所用抗生素、目标微生物及平板大小，在琼脂平板上放置适量的抗生素纸片，避免抑菌圈重叠。在抗生素纸片贴附后15分钟内，将平板倒置，并于37°C下孵育过夜。次日，以毫米为单位测量抑菌圈直径，并根据 EUCAST 提供的折点值进行判读。水样中总细菌负荷量为 3.0 × 10⁹ CFU/mL，且抗生素耐药菌负荷量较高。经测序鉴定，抗生素耐药菌的培养分离株属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），其中大多数为大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）。此外，还鉴定出一些罕见的机会性细菌。通过纸片扩散法进行的抗生素敏感性试验显示，八个分离株的多重抗生素耐药指数约为 0.2，表明具有较高的耐药程度。然而，丛毛单胞菌属（Comamonas）和节杆菌属（Arthrobacter）物种对所测试的所有抗生素均未表现出耐药性。可培养的分离菌株显示出存在编码抗β-内酰胺类、甲氧苄啶和氨基糖苷类抗生素的耐药基因。通过对总细菌多样性的宏基因组DNA分析，鉴定出50个门，表明细菌多样性较高，其中变形菌门（Proteobacteria）为最优势的门，包含α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）。在目水平上，伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）最为丰富，属于β-变形菌纲（Betaproteobacteria）。在总体水平上，假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、土壤杆菌属（Pedobacter）、柄杆菌属（Prosthecobacter）、湖泊生境杆菌属（Limnohabitans）、黄杆菌属（Flavobacterium）和丛毛单胞菌属（Comamonas）是一些丰度较高的细菌。宏基因组DNA分析还揭示了更多的抗生素耐药基因。在本方法中，连续稀释步骤至关重要，因为任何误差都可能导致对总菌落形成单位（CFU）及抗生素耐药菌负荷的错误解读。此外，应仔细测量抑菌圈的直径，以准确判断该分离株是耐药还是敏感。利用这些方案，除了水样外，还可研究其他任何样本，无论是环境样本、食品样本还是临床样本。而且，除了细菌之外，还可采用类似方法研究任何生态系统中的其他微生物群落。

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水性抗生素耐药细菌的分离和鉴定及其抗生素耐药基因的分子表征

设计一种简便的单日工作流程方案用于细菌病原体诊断，可实现对血流感染的快速识别。该方案包含八种临床相关细菌靶标及其抗生素耐药谱，可使临床医生在同一天内获得初步诊断信息，从而有助于制定更为恰当的治疗方案。...

从血培养中检测细菌病原体及进行抗菌药物耐药性测试的一日工作流程方案

来源：Ghadigaonkar, D. 和 Rath, A. 水源性抗生素耐药细菌的分离与鉴定及其抗生素抗性基因的分子表征。J. Vis. Exp.

从水样中分离耐药细菌用于分子分析

裂解性噬菌体生物传感器和抗体微珠能够区分耐甲氧西林（MRSA）和敏感型葡萄球菌。通过朗缪尔-布洛杰特法将噬菌体固定在石英晶体微天平传感器表面，作为广谱葡萄球菌探针。抗体微珠可特异性识别MRSA。...

用于检测耐抗生素葡萄球菌的生物传感器

本方案描述了食品中1类整合子及其相关基因盒的检测方法。...

筛选食品中的一类整合子及基因盒

我们描述了一种利用一系列同基因型抗生素抗性大肠杆菌（Escherichia coli）进行抗生素去重的平台。通过表达相应抗性基因的大肠杆菌（E.

利用抗生素耐药性平台进行抗生素去重

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

原子力显微镜-红外光谱法（AFM-IR）为细菌研究提供了强大的平台，能够实现纳米级分辨率。该技术可在单细胞水平上对细菌进行亚细胞结构变化的成像（例如细胞分裂过程中）以及化学成分的比较研究（例如由药物耐药性引起的差异）。...

原子力显微镜结合红外光谱作为探测单个细菌化学特性的工具

我们介绍了从水生环境中分离、扩增和表征降解烃类细菌的过程。该方案概述了细菌的分离方法、基于16S...

从水生环境分离、扩增与鉴定具有碳氢化合物代谢特性的细菌物种

本文介绍一种通过提高低分子量细胞外DNA比例来评估环境抗菌素耐药性（AMR）的简便技术。预先使用20%-30%聚乙二醇（PEG）和1.2 M...

从废水中增强提取低分子量DNA以全面评估抗菌素耐药性

野生动物通常寄生有多种多样的蠕虫。  蠕虫主要包括四类：“线虫”（nematodes）、“棘头虫”（acanthocephalans）、“吸虫”（trematodes）和“绦虫”（cestodes）。...

野生动物中寄生虫的采集与鉴定

学习从水样中分离和鉴定抗生素耐药细菌的方法，结合培养法与非培养法技术进行抗生素耐药基因的分子表征。该方案可检测可培养和不可培养细菌，全面分析淡水样本中的细菌多样性。

水中抗生素抗性细菌的分离与鉴定及其抗生素抗性基因的分子表征

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