在含细胞悬浮液中进行陶瓷全向生物打印以生成骨类似物

本方案可在无需加热或有毒化学试剂的条件下制备骨类似物。通过该方法，可构建具有临床应用潜力的骨结构，利用患者自体细胞修复骨缺损。该技术的主要优势在于，骨墨可与活细胞共同打印，形成任意复杂的类骨结构，并可引导细胞向成骨谱系分化。

此外，可将药物载入骨墨中，以同时促进伤口愈合、骨再生，并治疗癌症等疾病。本实验操作将由我实验室的博士生Gagan Jalandhra和Sara Romanazzo博士进行演示，Sara Romanazzo博士曾与我和Jalandhra博士共同开展多个项目，包括此项技术的开发。首先，将磷酸氢钙与碳酸钙粉末的混合物加入氧化锆坩埚中，加入量不得超过坩埚容量的75%。

将坩埚转移至马弗炉中，以每分钟5 °C的升温速率加热至1,400 °C，并在此温度下保温3小时。通过将坩埚从炉中取出并置于耐火砖顶部进行淬冷。待其完全冷却后方可进行后续操作。

使用研钵和研杵将α-磷酸三钙块体破碎并研磨，使所得颗粒的最大尺寸不超过200微米。向研磨后的混合物中加入三个毫米级氧化钇稳定氧化锆球，随后加入100%乙醇。盖紧盖子，在每分钟180转的条件下研磨两小时。

收集悬浮液，并用100%乙醇洗涤以分离小球。将悬浮液置于120摄氏度的烘箱中干燥24小时。将干燥后的粉末加入研磨罐中，同时加入1毫米的氧化锆小球和100%乙醇，其质量比与第一阶段相同。

以每分钟180转的速度研磨两小时。然后分离并在烘箱中干燥。从烘箱中取出样品。

制备骨墨时，将630 µL甘油和130 µL聚山梨酯80加入球磨罐中。然后向其中加入100 mg磷酸氢二铵和2 g α-磷酸三钙粉末，用刮刀持续搅拌使其混合均匀。加入一个直径25 mm的氧化锆球，盖紧罐盖，置于行星式球磨机中以每分钟180转的速度研磨60分钟，研磨至一半时间时暂停，用刮刀刮下罐壁上的物料。

将墨水装入一个1毫升的注射器中。按照文本手稿中的描述，配制10%的A型明胶在1×PBS中的溶液。将锥形瓶放在搅拌器上。

然后加入 5.796 毫升甲基丙烯酸酐，在避光条件下继续于 50 摄氏度搅拌 90 分钟。用 PBS 将锥形瓶中的内容物稀释至两倍体积以终止反应。将溶液倾入 50 毫升离心管中，于室温下以 3000 ×g 离心 3 分钟，去除未反应的甲基丙烯酸酐，并收集上清液。

将上清液装入截留分子量为14千道尔顿的纤维素透析管中，于40摄氏度下对去离子水透析五天，期间轻轻搅拌。每天更换一次去离子水。将透析后的液体倾注至50毫升离心管中，拧紧管盖，置于冰箱中冷藏12小时，以备储存。

然后使用液氮冷冻样品，并立即在-54摄氏度和0.4毫巴条件下冻干五天。将所得泡沫在-20摄氏度冰箱中保存。为合成GelMA微凝胶，称取冻干的GelMA，加入PBS溶液中，配制成10%（重量/重量）的GelMA PBS溶液，并在50摄氏度水浴中加热至完全溶胀。

向烧杯中加入油，每1毫升 GelMA 溶液加入37毫升油，确保总体积不超过烧杯容量的65%。将盛有油的烧杯放入一个较大的烧杯中，在加热板上搭建双烧杯体系，并配备磁力搅拌。边搅拌边加热至40摄氏度。

将 GelMA 溶液装入注射器，通过 0.45 微米滤膜逐滴加入搅拌的油相中。让乳液平衡 10 分钟。将乳液温度降低至 15 摄氏度以实现热固化。

通过在两个烧杯之间的空隙中加入碎冰来稳定球体。将丙酮加入旋转的 GelMA 乳液中。将烧杯中的内容物倾倒入 50 毫升离心管中，并确保用丙酮冲洗烧杯内壁。

静置20分钟，使脱水微凝胶沉降至底部。弃去上清液，用丙酮洗涤微凝胶两次。合并至同一离心管中，加满丙酮，超声处理10秒。

再次用丙酮洗涤两次。在室温下用丙酮储存，直至打印时使用。为制备用于打印的 GelMA 微凝胶悬浮液，按照文稿中所述方法，配制 1%（质量分数）的 GelMA DMEM 溶液。

将脱水后的微凝胶中的丙酮蒸发，称取所得粉末放入离心管中。加入丙酮并转移至无菌环境。为制备微凝胶悬浮液，需在生物安全柜内将粉末中的丙酮蒸发。

蒸发后，加入DMEM、含1% GelMA的DMEM溶液以及2.5% LAP引发剂溶液，使终末填充分数达到30%。室温下充分水化至少12小时。将脂肪来源的间充质干细胞在低糖DMEM培养基中培养，培养基中添加10% FBS和1%青霉素-链霉素，于37°C及5%二氧化碳条件下培养至细胞融合。通过移除培养基并用无菌PBS洗涤，从组织培养瓶中去除脂肪来源的间充质干细胞。

将细胞在室温下以150 RCF离心5分钟，使其沉淀。计数细胞，并计算每毫升GelMA微凝胶至少需要5 × 10⁵个细胞。取所需体积的细胞悬液置于单独的离心管中，按前述方法离心沉淀。

用移液器小心吸出尽可能多的上清液，仅留下细胞沉淀。向沉淀中加入所需体积的微凝胶悬浮液，并轻轻吹打混匀，以确保细胞均匀分布。用移液器将含有细胞的微凝胶悬浮液加入反应器中。

使用配备23号针头的1毫升注射器，将骨墨沉积到负载细胞和骨墨的GelMA微凝胶结构中，并在405纳米波长下用紫外交联仪照射90秒以完成交联。立即将微凝胶悬液转移至含有完全DMEM培养基的适当规格的孔板中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。

24小时后更换培养基，之后根据需要每48至72小时更换一次。通过扫描电子显微镜分析骨墨的微观结构，结果显示墨水固化后形成了羟基磷灰石晶体，尤其在干燥条件下更为明显。本研究中，将细胞与GelMA微凝胶混合后进行培养，培养时间最长为五天，培养方式包括仅微凝胶悬浮培养或在COBICS系统中培养。

细胞在骨墨存在条件下，无论是在第一天还是第五天均表现出良好的活性，证实该墨水的浸出产物对细胞无不利影响。在合成微凝胶时，控制搅拌速度至关重要，因为搅拌速度的微小变化都可能导致微凝胶尺寸差异。同时，确保细胞在微凝胶悬浮液中均匀分布也非常重要。

相同的方案也可用于在明胶微凝胶悬浮液内部进行打印，这些微凝胶可作为牺牲性支撑材料，最终留下独立的骨结构。而使用 GelMA 则为进一步构建一体化的多相结构（如骨软骨或骨-肌腱界面）提供了可能。