Name: 用于生成骨类似物的细胞悬浮液中的陶瓷全向生物打印 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学习使用磷酸钙墨水在明胶颗粒支撑中进行三维全向生物打印技术，制备含活细胞的骨类似物结构。该方法无需加热或有毒化学品，可用于骨组织工程和再生医学的临床应用。

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作者感谢澳大利亚国家健康与医学研究委员会（资助号：GNT1111694 和 GNT1141602）以及澳大利亚研究理事会（资助号：FT180100417、FL150100060 和 CE14100036）提供的支持。作者感谢新南威尔士大学生物医学成像设施。图示使用 Biorender.com、Adobe Photoshop 和 Adobe Illustrator 制作，并通过付费订阅导出。

1. 骨标记物的制备
<ol>
	<li>α-磷酸三钙的合成
	<ol>
		<li>按3:2的钙磷摩尔比称取磷酸氢钙（CaHPO4）和碳酸钙（CaCO3）粉末，用刮刀将两种粉末充分混合均匀。</li>
		<li>将磷酸氢钙-碳酸钙粉末混合物加入氧化锆坩埚中，填充量不超过坩埚容量的75%。 
		注意：为避免污染，请使用新的坩埚或此前仅用于制备相同材料的坩埚。清洁时，用100%乙醇冲洗，并在通风橱中自然晾干至完全干燥后再加入粉末。</li>
		<li>将坩埚转移至炉中，以5 °C/min的升温速率加热至1,400 °C，并保温3小时。</li>
		<li>通过将坩埚从炉中取出并放置在耐火砖上进行快速冷却。待其完全冷却后方可操作。 
		注意：使用长度合适的坩埚钳，并确保有足够的热防护措施。</li>
		<li>使用研钵和研杵将α-TCP块体破碎并研磨，使所得颗粒最大尺寸不超过200 µm。 
		注意：使用标准不锈钢筛网以确保颗粒尺寸正确。</li>
		<li>使用行星式球磨机分两个阶段进一步研磨颗粒。首先，按8:1的球料质量比加入3 mm的氧化钇稳定氧化锆磨球，然后按3:1的乙醇与粉末质量比加入100%乙醇。拧紧盖子后，在180 rpm条件下研磨2小时。</li>
		<li>收集悬浮液，并用100%乙醇洗涤以分离磨球。</li>
		<li>将悬浮液置于烘箱中，在120 °C下干燥24小时。</li>
		<li>将干燥后的粉末加入球磨罐中，按第一阶段相同的质量比加入1 mm氧化锆球和100%乙醇。在180 rpm条件下研磨2小时，随后分离并干燥。 
		注意：整个合成过程如图1A所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨墨的配制
	<ol>
		<li>配制骨墨时，将2 g α-TCP粉末加入球磨罐中，罐内已含有630 µL甘油和130 µL吐温80，并持续用刮刀搅拌。</li>
		<li>加入100 mg磷酸氢二铵（(NH4)2HPO4，APD），搅拌均匀。 
		注意：刮刀上残留过多液相会导致墨水组分比例失衡，从而影响固化动力学。</li>
		<li>加入一个25 mm氧化锆磨球，拧紧盖子后放入行星式球磨机中，在180 rpm条件下研磨60分钟，中途暂停一次，用刮刀刮下罐壁上的物料。</li>
		<li>用刮刀将墨水装入1 mL注射器中，妥善包裹以避免接触湿气。若不立即使用，应储存在−20 °C条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨墨微观结构表征
	<ol>
		<li>将骨墨在去离子水中打印，并静置5分钟使其固化。</li>
		<li>用100%乙醇洗涤样品3次，并使其完全干燥。</li>
		<li>在样品表面镀一层15 nm厚的金膜。</li>
		<li>使用场发射扫描电子显微镜在5 kV加速电压下拍摄显微图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 制备用于打印的微凝胶悬浮液
<ol>
	<li>明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）的合成 
	注意：本方法已针对10 g和20 g明胶的批次规模进行过验证。本方法以10 g明胶为例进行说明。
	<ol>
		<li>通过称取10 g A型明胶（猪源，Bloom强度300），加入含有90 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的锥形瓶中，配制10% w/w的明胶溶液。在搅拌条件下加热至50 °C，直至明胶完全溶解。</li>
		<li>加入5.796 mL甲基丙烯酸酐。在锥形瓶口加盖橡胶塞，在50 °C避光条件下持续搅拌90分钟。 
		注意：甲基丙烯酸酐若吸入或吞咽具有毒性，且对皮肤和眼睛具有刺激性。仅可在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>通过将反应液用PBS稀释一倍，终止反应。</li>
		<li>将溶液倒入50 mL离心管中，在室温下以3,000 × g离心3分钟，以去除未反应的甲基丙烯酸酐。</li>
		<li>将上清液转移至截留分子量为14 kDa的纤维素透析管中，在40 °C去离子水中透析5天，同时轻柔搅拌。每天更换一次去离子水。</li>
		<li>将透析产物倒入50 mL离心管中，盖紧管盖，于冰箱中静置12小时，以备储存。可在冰箱中储存最多7天。</li>
		<li>使用液氮速冻，并立即在−54 °C和0.4 mbar条件下冻干5天。 
		注意：冷冻时确保每管液体体积不超过40 mL。完全冻结后，将管盖更换为允许气体交换的覆盖物，例如用橡皮筋固定的洁净擦拭布。</li>
		<li>将所得冻干泡沫储存于−20 °C冰箱中，待用于微凝胶悬浮液的制备时取出使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GelMA微凝胶的合成 
	注意：微凝胶采用水包油乳液法13（图2）进行合成。本方法已验证适用于1–10 mL体积的GelMA溶液。相同方案也可用于合成用于打印独立骨结构的明胶微凝胶。
	<ol>
		<li>通过称取冻干GelMA，加入PBS中，置于50 °C水浴中加热至完全溶胀，配制10% w/w的GelMA溶液。</li>
		<li>每1 mL GelMA溶液向烧杯中加入37 mL油，确保液体体积不超过烧杯容量的65%。</li>
		<li>在加热板上设置双烧杯系统，通过磁力搅拌实现：将盛有油的烧杯置于一个更大的烧杯内部。 
		注意：两个烧杯的尺寸应确保可将冰块轻松投入两烧杯壁之间的空隙。装置示意图见图2。</li>
		<li>在搅拌条件下加热至40 °C。 
		注意：确保涡流平稳，不产生湍流，且涡流深度约为烧杯内油层高度的1/3。</li>
		<li>将GelMA溶液装入注射器，通过0.45 µm滤膜逐滴加入搅拌中的油相中。乳液静置平衡10分钟。</li>
		<li>通过向双烧杯之间的空隙加入碎冰，将乳液温度降至15 °C，以实现微球的热稳定化。</li>
		<li>向旋转的乳液中加入丙酮，GelMA溶液与丙酮的体积比为1:11。 
		注意：应通过漏斗缓慢加入丙酮，避免破坏乳液体系。继续搅拌60分钟。</li>
		<li>将烧杯内容物倒入50 mL离心管中，确保用丙酮冲洗烧杯内壁。静置20分钟，使脱水后的微凝胶沉降至管底。</li>
		<li>弃去上清液，并用丙酮至少洗涤2次。 
		注意：上清液应澄清透明。</li>
		<li>将所有微凝胶合并至一个离心管中，补加丙酮至满，超声处理10秒。再用丙酮洗涤2次。</li>
		<li>将微凝胶悬浮于丙酮中，室温储存，待打印时取出使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打印用GelMA微凝胶悬浮液的制备
	<ol>
		<li>通过称取冻干GelMA，加入DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），置于50 °C水浴中加热至完全溶胀，配制1% w/w的GelMA-DMEM溶液。</li>
		<li>将脱水微凝胶中的丙酮蒸发，称取所得粉末置于离心管中。加入丙酮，并转移至无菌环境。</li>
		<li>为形成微凝胶悬浮液，先蒸发丙酮，随后加入DMEM、1% w/w的GelMA-DMEM溶液以及2.5% w/w的二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP）引发剂溶液，使最终堆积分数达到30%。在室温下充分水合至少12小时。可在冰箱中储存最多7天。使用前恢复至室温。 
		注意：上述试剂的体积基于微凝胶的干重计算，可依据表1中的公式进行计算。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>公式</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>x = 干微凝胶的质量（mg）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 中 1% w/w GelMA 的体积，a (µL)</td>
			<td>a = 21.93x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 的体积，b (µL)</td>
			<td>b = 8.773x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% w/w LAP 溶液的体积，c (µL)</td>
			<td>c = 0.6267x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生成的微凝胶悬浮液总体积 (µL)</td>
			<td>a + b + c</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于计算水合 GelMA 微凝胶悬浮液所需试剂体积的公式。缩写：GelMA = gelatin methacrylate；LAP = lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate。
<img alt="烧杯中含冰的油包水凝胶溶液示意图，展示用于科学研究的聚合过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于微凝胶合成的油包水乳液法示意图。 双层烧杯装置显示，装有搅拌乳液（以箭头表示）的烧杯置于更大的烧杯内，以便实现冷却。缩写：GelMA = gelatin methacrylate&nbsp;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 将骨墨打印至细胞悬液中
注意：基于明胶的微凝胶支持多种不同类型细胞的黏附，因此该方法适用于在微凝胶基质中培养单个或多个细胞。本实验方案以脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）为例进行描述，因为这类细胞是肌肉骨骼组织工程中常用且性能稳定的细胞类型。
<ol>
	<li>在低糖 DMEM 培养基中培养 ADSCs，培养基中添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素，于 37 °C、5% CO2 条件下培养至细胞融合。</li>
	<li>移除培养基，用无菌 PBS 洗涤，然后在 37 °C、5% CO2 条件下用 0.25% 胰蛋白酶孵育 3 分钟，使 ADSCs 从组织培养瓶中脱离。</li>
	<li>在室温下以 150 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>计数细胞，并为每 1 mL GelMA 微凝胶计算 5 × 105 个细胞。将所需体积的细胞悬液分装至独立离心管中，并按上述方法离心收集细胞沉淀。</li>
	<li>用移液器小心尽可能吸除上清液，仅保留细胞沉淀。向沉淀中加入所需体积的微凝胶悬液，并轻柔吹打以确保细胞均匀分布。 
	注意：若悬液中存在过多气泡，可轻柔离心去除，并反复吹打以重新分散细胞。</li>
	<li>用移液器将含细胞的微凝胶悬液加载至反应器中。 
	注意：本研究中使用的 10 mm × 10 mm × 3 mm 反应器（容积为 100 µL）为 3D 打印制备。</li>
	<li>使用装有 23 G 针头的 1 mL 注射器沉积骨墨。 
	注意：可通过 3D 打印机完成此步骤，方法是改装允许直接从 1 mL 注射器打印的挤出系统，或将骨墨直接装入打印机的挤出 cartridge 中（图 3）。</li>
	<li>使用 UV 交联灯（405 nm）对含细胞和骨墨的 GelMA 微凝胶结构照射 90 秒进行交联。立即转移至合适尺寸的培养板中，并加入完全 DMEM 覆盖。 
	​注意：上述 3D 打印反应器可适配于 24 孔细胞培养板中。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。24 小时后更换培养基，之后根据需要每 48–72 小时更换一次。</li>
</ol>
<img alt="GelMA 微凝胶制备流程图、骨墨配方、用于生物工程研究的细胞混合物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：COBICS 工艺示意图，展示微凝胶的水合过程、细胞的引入，以及在含细胞的微凝胶悬浮液中后续打印骨墨的过程。 缩写：COBICS = 细胞悬浮液中的陶瓷全向生物打印（ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions）；GelMA = 明胶甲基丙烯酰（gelatin methacrylate）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
4. 细胞活力与增殖评估
<ol>
	<li>为评估骨墨的细胞毒性，将含有细胞的 COBICS 构建体置于完全培养基中培养。在 24 小时、72 小时和 120 小时（或相关时间点）进行活死细胞染色检测。</li>
	<li>在每个时间点，用 PBS 清洗构建体，然后加入含 4 mM 钙黄绿素和 2 mM 溴化乙锭的无酚 DMEM 溶液。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 清洗后转移至玻璃底培养皿，使用共聚焦显微镜在激发/发射波长 494/517 nm 和 528/617 nm 下进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBates%2C+P+%22Basic+Orthopaedic+Sciences.+The+Stanmore+Guide%22">Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. 123-134 (2007).</li>
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<li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+starch%2Fgelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490(2014).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何需要披露的利益冲突。

COBICS 3D 打印技术的开发旨在通过将材料挤出至含有活细胞的可交联微凝胶悬浮液中，实现矿化类骨结构的构建。该技术已应用于一种可降解的微凝胶悬浮体系，细胞在其中表现出良好的存活率、铺展能力以及成骨分化潜能11。使用该技术构建结构成功的关键因素之一，在于基于α-TCP的骨墨水的正确合成。首先，α-TCP的形成高度依赖于适当的温度控制。为了获得正确相态的磷酸三钙，必须在反应温度从1,400–1,200 °C下降过程中，在其跨越相界进入β-TCP相区之前迅速淬冷14。可通过X射线衍射分析确认所得产物为单相α-TCP。随后，将所有骨墨水前体材料按正确比例混合，对于形成具有理想流变特性、适合挤出打印、凝固时间及纳米-微米结构形成的骨墨水至关重要。由于 GelMA 微凝胶悬浮液可通过光交联实现打印结构的&#34;锁定&#34;，因此可调节前体材料的比例以适配所使用的3D打印机。然而，强烈建议进行充分测试，以确保这种调整不会损害该技术的整体完整性。
在 GelMA 合成过程中，一个关键的考虑因素是...

骨骼是体内少数能够通过重建其正常细胞组成、排列方向和力学强度来实现自我修复的结构之一，具有显著的再生能力，但这种能力仅在达到临界缺损尺寸之前有效，超过该尺寸后内源性愈合能力将受损1。骨骼与软骨和韧带共同作用，支撑并促进身体运动，同时还储存矿物质和脂肪，并生成血细胞。作为一种坚硬致密的结缔组织，骨骼主要由无机相、水以及以胶原纤维为主的有机成分构成2。细胞嵌于由I型胶原纤维和羟基磷灰石（HA）晶体组成的高度矿化基质中，形成一种层级结构3。
该组织复杂的结构使得构建能够复制异质性骨组织微环境和纳米环境的合成替代物极具挑战性3。为此，已有多种材料被提出用于构建骨基质，包括生物陶瓷、含细胞水凝胶以及合成材料。在支架制备技术中，基于3D打印的技术近年来崭露头角，并因其能够制造高度复杂且精确的结构，在组织工程领域受到广泛关注，展现出实现个体化治疗的巨大潜力4,5,6。水凝胶由于可与细胞及生物活性分子共同打印，生成具有功能性的结构，因而成为基质模拟物和生物墨水的首选6。然而，水凝胶缺乏骨组织的功能特性，例如机械强度以及含有代谢活跃细胞的高度钙化无机相。
3D打印陶瓷支架通常需要进行后处理步骤，包括烧结、高温处理或使用强腐蚀性化学试剂，这些试剂在使用前必须彻底清洗干净 体外 或 体内 应用5为了解决这些局限性，Lode 等人7 最近开发出一种以羟基磷灰石形成的磷酸三钙-α基糊状物，可在生理条件下打印并固化。然而，该材料仍无法与活细胞共同打印，因其需要在潮湿环境中进行后处理，并随后长时间浸入水溶液中。
或者，已有研究提出将含有无机颗粒的细胞负载型水凝胶作为三维骨基质的替代物8,9尽管它们具有显著支持细胞存活的能力，但无法重现高度矿化的骨组织环境。Thrivikarman 等10 采用了一种仿生方法，使用过饱和的钙和磷酸盐溶液，并结合非胶原蛋白类似物，以更好地模拟纳米级羟基磷灰石的沉积。然而，他们的构建物仍无法生成具有类似骨组织的微米和宏观结构的刚性三维构建物。
本研究通过开发一种打印策略来解决上述不足，该策略可制造出具有无机相和有机相的仿骨结构，能够同时整合细胞和生长因子11。COBICS 利用基于微凝胶的生物打印技术，独特地重现了骨的矿物成分和细胞结构。本文所述方案详细介绍了陶瓷骨墨和明胶基微凝胶的合成过程，并进一步结合细胞以实现 COBICS。该过程首先合成骨墨的主要前驱材料，随后合成可交联水凝胶并将其制成微凝胶；最后，在负载细胞的微凝胶支撑浴中以多向方式沉积骨墨（图 1）。
骨墨可打印至任何具有合适屈服应力特性的微凝胶悬浮液中，即在特定剪切速率下能够液化并随后支撑所沉积结构的悬浮液。已有两种灵活的方法被证实可行：一种为明胶微凝胶悬浮液，另一种为甲基丙烯酰化明胶（GelMA）微凝胶悬浮液。前者悬浮液在温度升高时会溶解 37 °C自由形式可逆嵌入悬浮水凝胶（FRESH）技术12，而后者可在打印后进行光交联，有效“缝合”微凝胶并固定打印的骨墨。本研究重点采用 GelMA 作为基质，因其具有支持细胞生长的独特优势 原位 打印复杂的仿生骨结构。最终，该方法能够生成具有高度生物模拟特性的复杂组织模型，对疾病建模、药物发现和再生工程具有广泛意义。
<img alt="骨墨制备流程、α-TCP合成、微凝胶水合示意图、骨墨3D打印。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：工作流程示意图。 （A）骨墨的合成始于α-磷酸三钙（α-TCP）的制备，随后将其与甘油、聚山梨酯80和磷酸氢二铵混合。（B）采用水包油乳化法制造GelMA微凝胶。所得微凝胶随后（C）进行水合，并（D）与细胞混合。将细胞-微凝胶复合物作为颗粒浴，用于沉积骨墨。（E）整个结构经紫外光交联后，转移至培养箱中进行培养。缩写：α-TCP = α-磷酸三钙；GelMA = 甲基丙烯酰化明胶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>

<table><tbody><tr><td>3D打印机挤出机</td><td>Hyrel3D</td><td>EMO-25</td><td></td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>Falcon</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇 100% 变性</td><td>Chem-Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Chem-Supply</td><td>154871</td><td></td></tr><tr><td>氧化铝坩埚</td><td>Coors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二铵 (NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>A5764</td><td></td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二级生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸钙</td><td>Sigma</td><td>239216</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢钙 (CaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C7263</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td></td><td>使用多种规格</td></tr><tr><td>纤维素透析管，截留分子量14 kDa</td><td>Sigma</td><td>D9777</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sigma</td><td>3-16KL</td><td></td></tr><tr><td>点样针头，23 G</td><td>Nordson</td><td>7018302</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，低糖，含丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>升降炉</td><td>Labec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Engine HR多头打印机</td><td>Hyrel3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Bovogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>明胶A型，来源于猪皮</td><td>Sigma</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>通用不锈钢针头</td><td>Nordson EF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>人脂肪来源干细胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800共聚焦显微镜</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机（Alpha 1-4 LDplus）</td><td>Christ</td><td>101541</td><td></td></tr><tr><td>磁力加热搅拌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸酐</td><td>Sigma</td><td>276685</td><td></td></tr><tr><td>Mini 2桌面式3D打印机</td><td>LulzBot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>行星式球磨机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>行星式球磨机研磨罐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯 Tween-80</td><td>Sigma</td><td>P6224</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtech科学级精密擦拭纸</td><td>Kimtech</td><td>18813156</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢标准试验筛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>葵花籽油</td><td>Community Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含酚红的0.25%胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ZEN显微镜软件</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>哺乳动物细胞活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，低糖，不含酚红</td><td>Thermo Fisher</td><td>11054020</td><td></td></tr></tbody></table>

在含细胞悬浮液中进行陶瓷全向生物打印以生成骨类似物

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

从结构上看，骨组织是一种无机-有机复合材料，其中包含嵌入在具有层级结构的高矿化基质中的代谢活跃细胞。由于骨组织环境具有异质性，这种结构难以复制。基于细胞悬浮液的陶瓷全向生物打印技术（COBICS）是一种基于微凝胶的生物打印方法，能够独特地复制骨组织的矿化成分和细胞结构。COBICS能够在无需牺牲性支撑材料或剧烈后处理步骤（如辐射和高温烧结）的情况下，打印出复杂且具有生物学意义的结构，而这正是骨仿生结构增材制造中面临的两大主要挑战。该技术通过在明胶基微凝胶悬浮体系中自由挤出一种新型磷酸钙基油墨来实现。该悬浮体系的屈服应力特性可支持打印结构的沉积与维持。随后通过紫外光交联和纳米沉淀过程将其“固定”到位。在含细胞生物材料中直接打印纳米结构的骨仿生陶瓷，实现了对宏观与微观结构的时空精确控制，并有助于在临床环境中实时构建复杂的骨组织结构。

COBICS 能够打印复杂且具有生物学意义的结构，无需使用牺牲性支撑材料或苛刻的后处理步骤（例如辐射和高温烧结），而这正是骨仿生结构增材制造中最大的两个挑战。为了展示 COBICS 形成复杂骨结构的能力以及在微凝胶悬浮液中共打印细胞的效果，研究人员拍摄了由骨墨水制成的类骨复合材料的代表性图像，并对 ADSC 在 COBICS 中长达 7 天的存活率进行了半定量分析。图 4 展示了通过将骨墨水沉积到由明胶微凝胶组成的支撑浴中来制造复杂类骨结构的能力，该支撑浴表现为非牛顿流体，在高剪切应力下会像粘性流体一样开始流动的固体。随后可将打印出的结构从粘性浴中分离出来（图 4A、B）。
用于制备图4中仿骨结构的打印机为配备定制挤出装置的多喷头打印机。将1 mL骨墨装入3 mL打印注射器中，并安装至挤出装置内。所用所有针头的内径为0.2–0.8 mm。通过CAD建模软件建立仿骨结构的计...

本方案描述了一种3D打印技术，通过在明胶基颗粒支撑材料中沉积磷酸钙墨水来制备类似骨组织的结构。所打印的骨类似物可实现自由成形，并具有灵活性，既可直接取出打印产物，也可在含活细胞的基质中进行交联，以构建多相复合结构。

从结构上看，骨组织是一种无机-有机复合物，其中含有代谢活跃的细胞，这些细胞嵌入在具有层级结构的高度矿化的基质中……

本方案可在无需加热或有毒化学试剂的条件下制备骨类似物。通过该方法，可构建具有临床应用潜力的骨结构，利用患者自体细胞修复骨缺损。该技术的主要优势在于，骨墨可与活细胞共同打印，形成任意复杂的类骨结构，并可引导细胞向成骨谱系分化。此外，可将药物载入骨墨中，以同时促进伤口愈合、骨再生，并治疗癌症等疾病。本实验操作将由我实验室的博士生Gagan Jalandhra和Sara Romanazzo博士进行演示，Sara Romanazzo博士曾与我和Jalandhra博士共同开展多个项目，包括此项技术的开发。首先，将磷酸氢钙与碳酸钙粉末的混合物加入氧化锆坩埚中，加入量不得超过坩埚容量的75%。将坩埚转移至马弗炉中，以每分钟5 °C的升温速率加热至1,400 °C，并在此温度下保温3小时。通过将坩埚从炉中取出并置于耐火砖顶部进行淬冷。待其完全冷却后方可进行后续操作。使用研钵和研杵将α-磷酸三钙块体破碎并研磨，使所得颗粒的最大尺寸不超过200微米。向研磨后的混合物中加入三个毫米级氧化钇稳定氧化锆球，随后加入100%乙醇。盖紧盖子，在每分钟180转的条件下研磨两小时。收集悬浮液，并用100%乙醇洗涤以分离小球。将悬浮液置于120摄氏度的烘箱中干燥24小时。将干燥后的粉末加入研磨罐中，同时加入1毫米的氧化锆小球和100%乙醇，其质量比与第一阶段相同。以每分钟180转的速度研磨两小时。然后分离并在烘箱中干燥。从烘箱中取出样品。制备骨墨时，将630 µL甘油和130 µL聚山梨酯80加入球磨罐中。然后向其中加入100 mg磷酸氢二铵和2 g α-磷酸三钙粉末，用刮刀持续搅拌使其混合均匀。加入一个直径25 mm的氧化锆球，盖紧罐盖，置于行星式球磨机中以每分钟180转的速度研磨60分钟，研磨至一半时间时暂停，用刮刀刮下罐壁上的物料。将墨水装入一个1毫升的注射器中。按照文本手稿中的描述，配制10%的A型明胶在1×PBS中的溶液。将锥形瓶放在搅拌器上。然后加入 5.796 毫升甲基丙烯酸酐，在避光条件下继续于 50 摄氏度搅拌 90 分钟。用 PBS 将锥形瓶中的内容物稀释至两倍体积以终止反应。将溶液倾入 50 毫升离心管中，于室温下以 3000 ×g 离心 3 分钟，去除未反应的甲基丙烯酸酐，并收集上清液。将上清液装入截留分子量为14千道尔顿的纤维素透析管中，于40摄氏度下对去离子水透析五天，期间轻轻搅拌。每天更换一次去离子水。将透析后的液体倾注至50毫升离心管中，拧紧管盖，置于冰箱中冷藏12小时，以备储存。然后使用液氮冷冻样品，并立即在-54摄氏度和0.4毫巴条件下冻干五天。将所得泡沫在-20摄氏度冰箱中保存。为合成GelMA微凝胶，称取冻干的GelMA，加入PBS溶液中，配制成10%（重量/重量）的GelMA PBS溶液，并在50摄氏度水浴中加热至完全溶胀。向烧杯中加入油，每1毫升 GelMA 溶液加入37毫升油，确保总体积不超过烧杯容量的65%。将盛有油的烧杯放入一个较大的烧杯中，在加热板上搭建双烧杯体系，并配备磁力搅拌。边搅拌边加热至40摄氏度。将 GelMA 溶液装入注射器，通过 0.45 微米滤膜逐滴加入搅拌的油相中。让乳液平衡 10 分钟。将乳液温度降低至 15 摄氏度以实现热固化。通过在两个烧杯之间的空隙中加入碎冰来稳定球体。将丙酮加入旋转的 GelMA 乳液中。将烧杯中的内容物倾倒入 50 毫升离心管中，并确保用丙酮冲洗烧杯内壁。静置20分钟，使脱水微凝胶沉降至底部。弃去上清液，用丙酮洗涤微凝胶两次。合并至同一离心管中，加满丙酮，超声处理10秒。再次用丙酮洗涤两次。在室温下用丙酮储存，直至打印时使用。为制备用于打印的 GelMA 微凝胶悬浮液，按照文稿中所述方法，配制 1%（质量分数）的 GelMA DMEM 溶液。将脱水后的微凝胶中的丙酮蒸发，称取所得粉末放入离心管中。加入丙酮并转移至无菌环境。为制备微凝胶悬浮液，需在生物安全柜内将粉末中的丙酮蒸发。蒸发后，加入DMEM、含1% GelMA的DMEM溶液以及2.5% LAP引发剂溶液，使终末填充分数达到30%。室温下充分水化至少12小时。将脂肪来源的间充质干细胞在低糖DMEM培养基中培养，培养基中添加10% FBS和1%青霉素-链霉素，于37°C及5%二氧化碳条件下培养至细胞融合。通过移除培养基并用无菌PBS洗涤，从组织培养瓶中去除脂肪来源的间充质干细胞。将细胞在室温下以150 RCF离心5分钟，使其沉淀。计数细胞，并计算每毫升GelMA微凝胶至少需要5 × 10⁵个细胞。取所需体积的细胞悬液置于单独的离心管中，按前述方法离心沉淀。用移液器小心吸出尽可能多的上清液，仅留下细胞沉淀。向沉淀中加入所需体积的微凝胶悬浮液，并轻轻吹打混匀，以确保细胞均匀分布。用移液器将含有细胞的微凝胶悬浮液加入反应器中。使用配备23号针头的1毫升注射器，将骨墨沉积到负载细胞和骨墨的GelMA微凝胶结构中，并在405纳米波长下用紫外交联仪照射90秒以完成交联。立即将微凝胶悬液转移至含有完全DMEM培养基的适当规格的孔板中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。24小时后更换培养基，之后根据需要每48至72小时更换一次。通过扫描电子显微镜分析骨墨的微观结构，结果显示墨水固化后形成了羟基磷灰石晶体，尤其在干燥条件下更为明显。本研究中，将细胞与GelMA微凝胶混合后进行培养，培养时间最长为五天，培养方式包括仅微凝胶悬浮培养或在COBICS系统中培养。细胞在骨墨存在条件下，无论是在第一天还是第五天均表现出良好的活性，证实该墨水的浸出产物对细胞无不利影响。在合成微凝胶时，控制搅拌速度至关重要，因为搅拌速度的微小变化都可能导致微凝胶尺寸差异。同时，确保细胞在微凝胶悬浮液中均匀分布也非常重要。相同的方案也可用于在明胶微凝胶悬浮液内部进行打印，这些微凝胶可作为牺牲性支撑材料，最终留下独立的骨结构。而使用 GelMA 则为进一步构建一体化的多相结构（如骨软骨或骨-肌腱界面）提供了可能。

ceramic-omnidirectional-bioprinting-cell-laden-suspensions-for

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于生成骨类似物的细胞悬浮液中的陶瓷全向生物打印

本文所述方法展示了如何将商用喷墨打印机改装为具有同步紫外光聚合功能的生物打印机。该打印机能够利用细胞和生物材料构建三维组织结构。本研究成功构建了三维新生软骨。...

利用三维喷墨打印技术制备人类软骨组织

本文介绍了一种逐步构建具有工程化微通道的类骨模板的通用方法。通过微通道的毛细作用，展示了该模板的高吸收和高保留能力。...

类骨模板中微通道的独特毛细作用可增强细胞募集以修复大段骨缺损

设计并制造了一种笛卡尔式生物打印机，可实现多种材料在精确且可重复的几何形状中的沉积，同时允许对环境因素进行控制。利用该三维生物打印机，可打印出复杂且具有活性的结构，并能够轻松实现重复制备。...

使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

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本方案描述了一种使用自动化机器人沉积系统的生物打印方法，该方法结合了刻蚀的拓扑引导线索与承载细胞的水凝胶生物墨水的精确沉积。打印的细胞被直接递送至刻蚀结构中，并能够感知并沿其定向排列。...

用于细胞表面引导与生物打印的自动化机器人分配技术

使用基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水对软骨和皮肤类似物进行生物打印。打印前通过单步被动混合装置对生物墨水进行细胞接种。结果显示，所构建的组织结构细胞分布均匀，细胞活力高，并表现出良好的分化标志物。...

利用新型被动混合单元技术实现生物墨水预细胞化的软骨与皮肤组织类似物生物打印

我们开发了一种异质性乳腺癌模型，该模型由永生化的肿瘤细胞和成纤维细胞嵌入可生物打印的海藻酸盐/明胶生物墨水中构成。该模型可重现 体内...

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。...

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

本方案重点介绍了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料油墨与小鼠骨髓来源肥大细胞生物相容性的方法，主要考察细胞活力以及细胞表面受体Kit（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。...

用于骨髓来源肥大细胞培养的结晶纳米纤维素嵌入琼脂糖生物材料油墨的制备

一个 体外 通过将间充质细胞和内皮细胞接种到预先制备的三维聚乙二醇水凝胶上，建立骨髓血管微环境模型。该微环境中的内皮网络、细胞外基质成分以及碱性磷酸酶活性会因所使用的生长因子不同而发生变化。该平台可用于构建高级癌症模型。 <br...

利用预铸聚乙二醇（PEG）水凝胶在成像微孔板中简便构建血管化成骨骨髓微环境

本方案描述了利用嵌入甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶并添加脱细胞外基质的人类成骨细胞构建三维骨组织的方法。该方法成本低、可扩展，并且兼容基础实验室设备，为研究肌肉骨骼疾病过程提供了一个具有转化潜力的平台。...

一种利用人成骨细胞和脱细胞细胞外基质建立骨骼肌肉疾病模型的三维骨培养平台

学习使用磷酸钙墨水在明胶颗粒支撑中进行三维全向生物打印技术，制备含活细胞的骨类似物结构。该方法无需加热或有毒化学品，可用于骨组织工程和再生医学的临床应用。

在含细胞悬浮液中进行陶瓷全向生物打印以生成骨类似物

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