Name: 自由移动小鼠中肠道来源的微生物代谢物的脑室内递送 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 了解通过脑室内导管向自由移动小鼠精确递送肠道微生物代谢物的方法。该技术为研究肠脑轴相互作用及其对神经功能的影响提供了可靠的实验框架。

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我们感谢中国台湾国立成功大学（NCKU）实验动物中心工作人员对实验动物的悉心照料。本研究得到了中国台湾振兴医院教授黄昆彦教育基金为C.-W.L.提供的奖学金支持；中国台湾科技部（MOST）经费支持：为T.-H.Y.提供的大学生研究计划项目（MOST 109-2813-C-006-095-B）；为W.-L.W.提供的项目（MOST 107-2320-B-006-072-MY3；109-2314-B-006-046；110-2314-B-006-114；110-2320-B-006-018-MY3）；以及中国台湾教育部高等教育深耕计划对国立成功大学大学发展总部为W.-L.W.提供的经费支持。

所有实验方案和动物护理程序均经中国台湾国立成功大学（NCKU）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 实验动物的准备
<ol>
	<li>从供应商处获取6-8周龄的野生型C57BL/6JNarl雄性小鼠。</li>
	<li>将小鼠饲养在标准小鼠笼中，提供标准小鼠饲料和灭菌水 随意摄取. 
	&#8203;注：国立成功大学实验动物中心的饲养条件为温度22 ± 1 °C，湿度55% ± 10%，光照周期为13小时光照/11小时黑暗。</li>
</ol>
2. 立体定位手术
<ol>
	<li>准备并灭菌立体定位仪、手术器械及相关物品。 
	注意：所有将直接接触手术部位的物品均应灭菌，以避免感染。</li>
	<li>将小鼠置于含1%-5%异氟烷的氧气中，放入聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）麻醉箱内进行麻醉。 
	注意：密切观察小鼠，确保其呼吸频率维持在每秒约一次。</li>
	<li>将小鼠从麻醉 chamber 中取出。使用宠物修剪器剃除手术部位（小鼠头部）的毛发。将小鼠的门齿固定在立体定位仪的门齿夹具杆上，将其置于立体定位仪框架中。用鼻罩覆盖小鼠的鼻部。</li>
	<li>在整个立体定位手术过程中，使用1%-2.5%异氟烷与氧气混合对小鼠进行麻醉。评估小鼠的痛觉反应 通过 趾部捏压反射并确保呼吸频率恒定，然后切开手术部位。</li>
	<li>将加热垫（37.0 °C）放置在立体定位仪上的小鼠下方，以维持其术中体温。或者，可通过连接程序控温加热装置与加热垫的直肠温度探针来维持核心体温。</li>
	<li>使用胶带去除头部修剪后的毛发。皮下注射酮洛芬（Ketoprofen，5 mg/kg）以缓解小鼠疼痛。涂抹眼膏以防止眼睛干燥。</li>
	<li>将尖头耳棒插入耳道以固定头部。</li>
	<li>通过调节耳杆的刻度来使头部居中。</li>
	<li>用门齿固定器上的鼻夹夹紧，以避免垂直移动。轻轻按压头部，确认头部已固定牢固，防止后续手术过程中头部松动。</li>
	<li>使用棉签，以氯己定进行三次交替擦拭消毒头皮。每次擦拭均从中央区域向外侧进行（从消毒最彻底的中心区域向消毒程度较低的周边区域）。 
	注意：从中间向外围擦拭有助于科研人员尽量减少毛发带来的感染和污染。外周区域靠近未剃毛的头部区域，仍存在大量毛发，难以彻底消毒。</li>
	<li>沿前后方向切开头皮（&#60;使用手术刀切开约1厘米的切口。撑开切口，用显微镊夹持棉签擦拭颅骨。 
	注意：显微解剖镊子、手术刀片和棉签必须在手术前通过高压灭菌进行消毒。在手术过程中，每次处理每只动物前后，均须使用玻璃珠灭菌器（150 °C）对所有手术器械灭菌至少5秒。准备一个已灭菌的烧杯，用于在手术过程中以及动物间歇期间放置手术刀片和镊子。</li>
	<li>确定颅骨上的前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。以前囟（Bregma）为参考点，定位目标区域。
	<ol>
		<li>可选：将立体定位钻安装在立体定位钻 holder 上，使用钻头尖端指向前囟作为参考点。使用玻璃珠灭菌器（150 °C）对立体定位钻进行灭菌，时间不少于 5 s。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过前囟/后囟校准并调整颅骨水平面在左右和前后方向上的位置。 
	&#8203;注意：若未处于正确的水平面，请将小鼠重新固定在立体定位仪上。</li>
</ol>
3. 商业化定制导管套管植入
<ol>
	<li>根据立体定位坐标确定右侧脑室的位置并进行标记：前囟（Bregma）前后方向（A/P）距离为 0.26 mm，内外侧方向（M/L）为 -1.0 mm，背腹方向（D/V）为 -2.0 mm20。 
	注意：可根据感兴趣区域调整坐标。上述脑室坐标基于体重为 26–30 g 的成年 C57BL/6J 小鼠。若使用更年轻的小鼠，请参见讨论部分。</li>
	<li>使用立体定位钻在已标记的位置钻孔（直径 = 1.5 mm），用于植入商用导向套管。</li>
	<li>使用立体定位钻在颅骨上再钻 2 至 4 个孔（直径 = 1.5 mm），用于安装不锈钢螺钉。 
	注意：每次操作动物前后，均需使用玻璃珠灭菌器（150 °C）对立体定位钻灭菌至少 5 秒。</li>
	<li>用棉签清除骨屑并止血。</li>
	<li>用棉签将利多卡因（1 mg/kg）涂抹于颅骨表面，以发挥局部麻醉、止痒和镇痛作用。若钻孔后出血不止，可将棉签轻压于孔口以实现止血。</li>
	<li>在钻孔处安装 2 至 4 枚不锈钢螺钉，作为牙科丙烯酸树脂的固定锚点。</li>
	<li>将商用导向套管安装至立体定位套管夹持器上，并使用玻璃珠灭菌器（150 °C）进行消毒。 
	注意：商用导向套管、商用假芯和商用注射器（图 2A）为定制产品，其规格详见材料表。</li>
	<li>将立体定位套管夹持器移至为脑室钻好的孔位，缓慢将商用导向套管插入孔中，直至达到目标深度（2.5 mm）。 
	注意：背腹方向坐标可通过将商用导向套管尖端作为参考点来确定，当尖端刚刚插入孔中时即为起始位置。</li>
	<li>滴加 10 µL 正丁基氰基丙烯酸酯粘合剂（组织胶）以固定商用导向套管于钻孔中，静置 3–4 分钟。&#160;随后轻柔地从立体定位套管夹持器上释放导向套管，并移开夹持器。</li>
	<li>在切开的头皮处涂抹牙科丙烯酸树脂以进一步固定商用导向套管，静置至少 5 分钟。将商用假芯插入商用导向套管中，防止血液或体液堵塞套管（图 2B）。</li>
	<li>松开耳杆，从立体定位仪框架上取下小鼠。</li>
	<li>将小鼠放入带有底部加热垫的新笼子中，使其从麻醉中恢复，并持续观察直至完全清醒。 
	&#8203;注意：在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不应与其他动物合笼饲养。</li>
	<li>根据机构 IACUC 规定和实验设计，将小鼠单独饲养或群养。若采用群养，应减少每笼小鼠数量，以尽量避免意外伤害或套管脱落。</li>
	<li>术后护理期间，在饮水中添加布洛芬（0.2 mg/mL）至少 3 天，并每天两次监测疼痛和痛苦迹象至少 3 天。
	<ol>
		<li>术后护理期间，可在小鼠皮肤周围涂抹罗红霉素软膏，以预防炎症和感染。</li>
		<li>持续监测动物状态，并及时给予腹腔注射 5% 葡萄糖和/或 0.9% 氯化钠溶液，以提供充足能量。</li>
		<li>若疼痛、痛苦或感染状况持续恶化，应通过 CO2 吸入法实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后等待 1 周，待小鼠恢复后即可进行短链脂肪酸的脑室内递送及行为学测试。</li>
</ol>
4. 短链脂肪酸的制备
<ol>
	<li>将乙酸钠、丁酸钠和丙酸钠溶解于人工脑脊液（ACSF）中（参见材料表）。</li>
	<li>确保化学物质完全溶解后，调节pH至7.4，并将短链脂肪酸混合物经0.22 μm滤膜过滤以实现灭菌。</li>
</ol>
5. 在行为学测试期间建立用于向脑室内递送短链脂肪酸的输注系统
<ol>
	<li>安装一个天花板摄像头以记录行为。将摄像头连接到计算机，以控制视频录制软件（图3）。</li>
	<li>用蒸馏水填充一支10 μL的微量注射器。 
	注意：避免微量注射器中产生气泡。</li>
	<li>将微量注射泵与微注射控制器连接。</li>
	<li>将微量注射器安装到微量注射泵上。安装时，按下按钮松开夹具，将注射器安装到相应位置。关闭夹具，并拧紧微量注射泵上的推杆固定螺钉（图4A）。</li>
	<li>将商用注射装置插入聚乙烯管中（图2A）。</li>
	<li>将聚乙烯管悬挂在测试区域上方的天花板摄像头处。</li>
	<li>使用胰岛素注射器向聚乙烯管中注满蒸馏水。将微量注射器连接至悬挂的聚乙烯管。 
	&#8203;注意：确保聚乙烯管足够长，以便小鼠能够在整个测试区域内自由活动。</li>
</ol>
6. 显微注射控制器的系统设置
<ol>
	<li>打开显微注射控制器，点击 显示所有通道 进入 命令 界面（图4C）。点击 配置 ，将 目标体积 设置为 9,800 nL，输送速率 设置为 100 nL/s。从连接至微量注射器的聚乙烯管中注入 9,800 nL 蒸馏水（点击 方向 切换至 注入 模式，然后点击 运行）（参见 图4C 中 命令 界面上的红色方框）。</li>
	<li>点击 配置 ，将 目标体积 设置为 3,000 nL，输送速率 设置为 100 nL/s。从聚乙烯管中回抽 3,000 nL 矿物油（点击 方向 切换至 回抽 模式，然后点击 运行）（参见 图4C 中 命令 界面上的红色方框）。 
	注意：应在聚乙烯管中观察到清晰的油-水相分离。</li>
	<li>将聚乙烯管从微量注射器针头拆下。从微量注射器针头中排出 3,000 nL 蒸馏水（点击 方向 切换至 注入 模式，然后点击 运行）。</li>
	<li>将微量注射器重新插入聚乙烯管中。点击 配置 ，将 目标体积 设置为 9,500 nL，输送速率 设置为 100 nL/s。回抽 9,500 nL 短链脂肪酸（SCFAs）（点击 方向 切换至 回抽 模式，然后点击 运行）。标记油-SCFAs 相，以确认 SCFAs 是否成功注入。</li>
	<li>点击 配置 ，根据需要设置 目标体积，并将 输送速率 设置为 7 nL/s。点击 方向 切换至 注入 模式（参见 图4C 中 命令 界面上的红色方框）。 
	注意：根据输注时间确定体积。例如，若输注时间为 3 分钟，输送速率为 7 nL/s，则目标体积 = 1,260 nL。</li>
	<li>点击 运行 ，向前推动微量注射器，直至液体从商用注射器前端流出，然后再将注射器插入套管中进行 SCFAs 注射。</li>
</ol>
7. 通过商品化导向套管向自由活动小鼠的侧脑室灌注短链脂肪酸
<ol>
	<li>将小鼠放入含有1%-5%异氟烷的氧气环境中的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）笼内，使其麻醉。 
	注意：密切观察小鼠，确保其呼吸频率维持在每秒约一次。</li>
	<li>固定小鼠颈部皮肤，将商用注射器插入商用导向套管中（图4B）。 
	注意：若商用导向套管被血液或体液堵塞，可用镊子轻轻疏通。</li>
	<li>在进行行为学测试前，将小鼠置于笼中恢复麻醉状态15分钟。</li>
	<li>在基础运动测试中，将小鼠放入一个新笼子中，使其自由探索35分钟。在前5分钟内以7 nL/s的输注速率输注短链脂肪酸（SCFAs），目标体积为2,100 nL（将方向设为输注模式，然后按下运行）。 
	注意：可使用动物行为视频追踪软件分析小鼠在新笼子中的运动情况21,22。</li>
	<li>再次麻醉小鼠（重复步骤7.1），并将商用注射器从商用导向套管中取出。 
	&#8203;注意：在给予足够时间使前一次注射物质充分洗脱后，可对小鼠重复注射不同的对照物或代谢物。只要套管固定在小鼠头部，便可反复使用不同代谢物进行测试。</li>
</ol>
8. 显微注射系统的恢复
<ol>
	<li>将聚乙烯管从微量注射器上拆下。</li>
	<li>使用胰岛素注射器向管内注入空气，以排出聚乙烯管中的蒸馏水。清空微量注射器。</li>
	<li>在配置界面按下重置位置，进入注射器止点定义界面（图4C）。</li>
	<li>持续按下回吸按钮直至发出蜂鸣声，将显微注射泵复位至完全回吸位置（图4C）。</li>
	<li>返回命令界面，若屏幕上显示**到达终点**，则关闭显微注射控制器（图4C）。</li>
</ol>
9. 可选：通过神经示踪剂验证脑室内注射
<ol>
	<li>以 7 nL/s 的 输送速率 注入 2,100 nL 神经示踪剂，以验证注射位点。 
	注意：注射器在引导套管中保留 5 分钟，以防止回流。</li>
	<li>在注射神经示踪剂后 30 分钟，使用过量异氟烷（5%）麻醉小鼠。</li>
	<li>检查麻醉小鼠的呼吸频率以及尾部/足部夹捏反射。 
	注意：在进行下一步操作前，小鼠必须无反应。</li>
	<li>在肋骨下方的皮肤、肌肉和腹壁上做 4–5 cm 的切口。</li>
	<li>小心地将肝脏从膈膜处轻轻移开。</li>
	<li>切开膈膜以暴露小鼠心脏。</li>
	<li>通过心脏灌注磷酸盐缓冲液（PBS）以及冰冻的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。</li>
	<li>将小鼠断头，使用显微镊子和显微剪刀小心解剖取出全脑23。将脑组织样本置于冰冻的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中固定 3–4 天，并用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将脑组织置于小鼠脑切片固定器中，从前往后方向进行第八次切割（1 mm/片），将脑组织切成两部分。将脑组织放入包埋模具中，并用低熔点琼脂糖（PBS 中 4%）包埋脑样本。</li>
	<li>使用速干胶将包埋在琼脂糖中的脑组织粘附至振动切片机载物台上。使用振动切片机将脑组织冠状切片为 50 µm 厚的脑片。</li>
	<li>将脑片在阻断缓冲液中稀释的靶向神经示踪剂的一抗（1:1,000 稀释）中室温孵育过夜。 
	注意：阻断缓冲液包含 10% 马血清、0.1% Triton X-100 和 0.02% 叠氮化钠。</li>
	<li>用 PBST（含 0.1% Triton X-100 的 PBS）洗涤脑片 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将脑片在阻断缓冲液中稀释的荧光染料标记的二抗（1:500 稀释）中室温孵育 2 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤脑片 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>使用含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂将脑片封固于载玻片上。</li>
	<li>用显微镜盖玻片覆盖载玻片。</li>
	<li>在载玻片边缘涂抹指甲油，防止封片剂泄漏。</li>
	<li>在室温下避光孵育过夜后，使用荧光显微镜成像注射部位的荧光信号。</li>
</ol>
10. 可选：通过定制的不锈钢导向套管向小鼠侧脑室输注代谢物
<ol>
	<li>遵循第1至第8步实验步骤，将商用导管套管替换为不锈钢导管套管，通过不锈钢注射器向小鼠体内注入化学物质。 
	注意：不同商用和不锈钢套管针的优缺点在讨论部分进行了详细阐述。</li>
	<li>以不锈钢导管替代商用导管套管，其余手术操作步骤均按照第2和第3部分所述方案进行图5B). 
	注意：不锈钢导向套管、不锈钢假插管和不锈钢注射器（图 5A）根据所示规格进行了定制 材料表将定制的不锈钢导管插入孔中，直至达到所需深度（2.0 mm）。</li>
	<li>灌注短链脂肪酸（SCFAs） 通过 使用由微注射控制器和微注射泵组成的微注射系统，将不锈钢导管套管图4B）（与方案第4-7节相同）。对于不锈钢导向套管的不锈钢假性注入器，将不锈钢注入器的一端轻轻弯曲，使另一端的尖端比不锈钢导向套管长1 mm。</li>
	<li>通过不锈钢导向套管将2,100 nL神经示踪剂注入小鼠侧脑室（同第9节实验步骤）。</li>
	<li>在神经示踪剂灌注后30分钟采集样本（与第9个实验步骤相同）。</li>
	<li>在神经示踪剂灌注的脑切片中进行图像采集（与方案第9节相同）。</li>
</ol>

作者与本工作无利益冲突。

肠道来源的代谢物已被发现与脑部介导的疾病相关，但其精确机制尚不明确，部分原因在于这些代谢物在体内具有多个结合位点6,12,24。先前的研究表明，短链脂肪酸（SCFAs）可在体内多个部位作为G蛋白偶联受体的配体、表观遗传调控因子以及能量生成的来源6,12。为了规避来自外周系统（如免疫细胞、激素和自主神经系统）的混杂因素，本研究建立了一种方法，即通过植入导向套管，对自由活动的小鼠进行脑室内注射短链脂肪酸。此外，还对套管植入位置和灌注靶区进行了验证，以探索可能受短链脂肪酸影响的脑区。综上所述，本文提供了一种精确、细致且经过验证的方法，可用于将肠道来源的代谢物递送至脑内，推动肠-脑轴相关研究。
通过导管套管向动物脑室内递送药物和化学物质的方法已得到充分建立<sup class="xref"...

人体胃肠道内栖息着多种多样的微生物，这些微生物影响着宿主1,2,3这些肠道细菌在利用宿主摄入的膳食成分时，可分泌肠道来源的代谢产物4,5有趣的是，肠道代谢物中未在周围组织被代谢的部分可被转运至其他器官 通过 循环6值得注意的是，这些分泌的代谢物可作为肠-脑轴的介质，肠-脑轴是指中枢神经系统与肠道之间存在的双向通信。7先前的研究表明，肠道来源的代谢物能够调节动物的复杂行为和情绪8,9,10,11.
短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物群在发酵膳食纤维和不可消化碳水化合物过程中产生的主要代谢产物6。乙酸、丙酸和丁酸是肠道中最丰富的三种SCFAs12。SCFAs可作为胃肠道细胞的能量来源。未被代谢的SCFAs可通过门静脉被运输至大脑，从而调节大脑功能和行为6,12。既往研究表明，SCFAs可能在神经精神疾病中发挥关键作用6,12。例如，在自闭症谱系障碍（ASD）的动物模型BTBR T+ Itpr3tf/J（BTBR）小鼠中，腹腔注射丁酸可改善其社交缺陷13。接受抑郁症患者菌群移植的抗生素处理大鼠表现出类焦虑行为增加，同时粪便中SCFAs水平升高14。临床研究发现，与正常发育对照人群相比，ASD个体的粪便SCFAs水平发生改变15,16。抑郁症患者的粪便SCFAs水平低于健康个体17,18。这些研究提示，SCFAs可通过多种途径改变动物和人类的行为。
微生物代谢物在体内多个位点发挥多样化作用，影响宿主生理功能和行为4,19，包括胃肠道、迷走神经和交感神经。在给予代谢物的情况下，很难精确定位肠道来源的代谢物在大脑中的确切作用 通过 外周途径。本文提供了一种基于视频的实验方案，用于研究自由活动小鼠肠道来源代谢物对大脑的影响（图1我们证明了短链脂肪酸（SCFAs）可在行为学测试期间通过导管套管急性给予。根据实验目的，可调整代谢物的种类、体积和输注速率。通过调整套管植入位点，可研究肠道代谢物对特定脑区的影响。本研究旨在为科研人员提供一种方法，用于探索肠道来源的微生物代谢物对大脑和行为的潜在影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41</td><td>Pfizer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>抗荧光金抗体（兔多克隆）</td><td>Millipore</td><td>AB153-I</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶式真空滤器，500 mL，0.22 &amp;mu;m，PES，无菌</td><td>NEST</td><td>121921LA01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>ACSF：0.14 g/L</td></tr><tr><td>氯己定擦洗液 2%</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-611-09</td><td></td></tr><tr><td>氯己定溶液</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-599-09</td><td></td></tr><tr><td>商用假插管</td><td>RWD Life Science</td><td>62004</td><td>Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm</td></tr><tr><td>商用导引套管</td><td>RWD Life Science</td><td>62104</td><td>Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>商用注射器</td><td>RWD Life Science</td><td>62204</td><td>Single_OD 0.21 mm-33G/ 与 M3.5 配合使用/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>ACSF：0.61 g/L</td></tr><tr><td>牙科丙烯酸树脂</td><td>HYGENIC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>固定螺钉</td><td>RWD Life Science</td><td>62521</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BBraun</td><td>XG-LBB-9151133S-1BX</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;</td><td>Panion &amp;amp; BF biotech</td><td>DG-4900-250D</td><td></td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>ACSF：0.19 g/L</td></tr><tr><td>酮洛芬&amp;nbsp;</td><td>Swiss Pharmaceutical</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因&amp;nbsp;</td><td>AstraZeneca</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>ACSF：0.19 g/L</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>MARIENFELD</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4951PLUS-001E</td><td></td></tr><tr><td>轻质矿物油，白色 NF</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MA-6358-04</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>ACSF：7.46 g/L</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>ACSF：0.18 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>ACSF：1.76 g/L</td></tr><tr><td>n-丁基氰基丙烯酸酯粘合剂（组织粘合胶）</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>3M Vetbond</td></tr><tr><td>神经示踪剂&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-358883</td><td>FluoroGold</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>RWD Life Science</td><td>62329</td><td>外径 1.50 mm，内径 0.50 mm；外径 1.09 mm，内径 0.38 mm</td></tr><tr><td>Puralube Vet（眼用）软膏</td><td>Dechra&amp;nbsp;</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>SCFAs：13.5 mM</td></tr><tr><td>叠氮化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>SCFAs：8 mM</td></tr><tr><td>丙酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1880</td><td>SCFAs：5.18 mM</td></tr><tr><td>不锈钢导引套管</td><td>Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.</td><td>n/a</td><td>外径 0.63 mm；本地供应商</td></tr><tr><td>不锈钢注射器</td><td>Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.</td><td>n/a</td><td>外径 0.3 mm；假插管由注射器制成；本地供应商</td></tr><tr><td>强力胶</td><td>Krazy Glue</td><td>KG94548R</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Merck</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>套管固定架</td><td>RWD Life Science</td><td>B485-68217</td><td></td></tr><tr><td>天花板摄像头</td><td>FOSCAM</td><td>R2</td><td></td></tr><tr><td>数字立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>INNOVIEW</td><td>SEM-HT/TW</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器</td><td>RWD Life Science</td><td>RS1501</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Stoelting</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>Leica 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>显微镊</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>带齿，轻微弯曲；超精细；尖端宽度 0.5 mm；4&quot; 长度&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5918</td><td>4.5&quot; 角度锋利</td></tr><tr><td>微量注射控制器</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>MICRO2T</td><td>SMARTouch 控制器</td></tr><tr><td>微量注射泵</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>UMP3T-1</td><td>UltraMicroPump3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微升注射器</td><td>Hamilton</td><td>80014</td><td>10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>双光纤冷光源光纤</td><td>Step</td><td>LGY-150</td><td>本地供应商</td></tr><tr><td>宠物修剪器</td><td>WAHL</td><td>09962-2018</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发器</td><td>Step</td><td>AS-01</td><td>本地供应商</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>动物行为视频追踪软件</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>版本：15.0.1416</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X 软件</td><td>Leica</td><td>LASX</td><td>版本：3.7.2.22383</td></tr></tbody></table>

自由活动小鼠脑室内给药肠道来源微生物代谢物

Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice

肠道微生物群及其代谢物对宿主生理和行为的影响在本十年内得到了广泛研究。大量研究表明，肠道微生物群衍生的代谢物通过复杂的肠-脑通路调节宿主大脑介导的生理功能。短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物组在发酵膳食纤维过程中产生的主要细菌代谢产物。肠道分泌的SCFAs可在外周多个部位发挥作用，由于SCFAs受体分布广泛，可影响免疫、内分泌和神经反应。因此，通过口服或腹腔注射SCFAs的方式，难以区分其对中枢和外周的作用。本文介绍了一种基于视频的方法，用于探究SCFAs在大脑中的功能作用

关键词：肠道微生物群，短链脂肪酸，肠-脑轴，代谢物，神经功能，免疫调节，内分泌反应 通过 在自由活动的小鼠中植入引导套管。通过控制灌注体积和速率，可调节脑内短链脂肪酸（SCFAs）的含量和类型。该方法可为科学家提供一种研究肠道来源代谢物在脑功能中作用的途径。

在小鼠完成脑部侧脑室植入导管并恢复1周后，通过注入短链脂肪酸（SCFAs）来评估其在新环境笼子中的运动活动。将小鼠置于新环境笼子中，并在前5分钟内通过已植入侧脑室的商用导管以7 nL/s的输送速率向脑内注入2,100 nL的SCFAs或人工脑脊液（ACSF）。注入完成后，继续记录30分钟的新环境笼子中的运动活动。注入SCFAs与ACSF后，小鼠在新环境笼子中的运动活动未见显著差异（图6）（每组n = 2只小鼠；数据以均值±标准误表示，采用双因素方差分析进行统计分析）。
为验证引导套管在脑区植入的准确性，将荧光神经示踪剂注入小鼠体内 通过 以与短链脂肪酸相同的体积和输注速率（2,100 nL，5 分钟内；7 nL/s）注入示踪染料。注药30分钟后取脑组织进行组织学分析。荧光染料在小鼠脑侧脑室及周围区域被检测到。图7A）。在相同条件下，将不锈钢导管植入小鼠脑侧脑室，用于神经示踪剂的灌注。与导管类似，结果表明，即使通过不锈钢导管灌注，荧光染料信号仍可在...

肠道来源的微生物代谢物具有多方面的影响，可导致动物产生复杂的行为变化。本文旨在提供一种逐步解析肠道来源微生物代谢物对大脑作用的方法 通过 脑室内给药 通过 引导套管

近年来，肠道微生物群及其代谢产物对宿主生理和行为的影响已得到广泛研究。大量研究表明……

肠道微生物群释放的代谢物对宿主产生复杂的影响。本方案介绍了一种研究肠道代谢物在小鼠大脑和行为中作用的方法。该技术提供了一种精确、细致且经过验证的方法，可在自由活动的小鼠中将肠道代谢物递送至大脑。我们提供了一种全面且符合生理条件的最佳方法，以深入研究肠脑轴。将小鼠放置于立体定位仪上，并将其门齿固定在立体定位仪的门齿夹门齿杆上。用鼻罩覆盖小鼠的鼻子。然后通过足底夹捏反射评估小鼠的伤害性感受，并在切开手术部位前确保其呼吸频率恒定。用粘性胶带去除头部修剪过的毛发后，皮下注射镇痛剂酮洛芬以缓解疼痛，并涂抹眼膏。接着，将尖头耳棒插入耳道以固定头部。拧紧门齿固定器上的鼻夹，并轻轻按压头部，确保头部固定牢固。使用氯己定棉签交替擦拭头皮三次，进行消毒。接着，使用解剖手术刀沿前后方向在头皮上做一个小于一厘米的切口。打开切口后，用显微解剖镊夹持的棉签擦拭颅骨。根据立体定位坐标，参照文稿中的描述，确定并标记右侧脑室的位置。接着，使用立体定位钻在已标记的位置钻穿颅骨，随后再在颅骨上钻2至4个孔。用利多卡因棉签擦拭颅骨，并在钻孔处安装2至4个不锈钢螺钉。将商用导向套管置于立体定位套管夹持器上，使用玻璃快速灭菌器在150摄氏度下进行消毒。然后，将立体定位套管夹持器移至侧脑室钻孔位置，缓慢将商用导向套管插入孔中，直至达到预定深度。现在将 10 µL 的正丁基氰基丙烯酸酯粘合剂涂抹于钻孔处，以固定商用引导套管，静置 3 至 4 分钟。轻轻从立体定位套管夹持器上松开商用引导套管，然后在切开的头皮处涂抹牙科丙烯酸树脂，以进一步固定商用引导套管，并至少等待 5 分钟。将商用假芯植入商用引导套管中。然后，将小鼠放入一个新笼子中，笼子下方放置加热垫，以促进其从麻醉状态恢复，并持续观察直至小鼠完全苏醒。将装有10微升蒸馏水的微量注射器安装到微注射泵上。使用胰岛素注射器用蒸馏水填充聚乙烯管，并将微量注射器连接到悬挂的聚乙烯管上。打开显微注射控制器，按下“显示所有通道”以进入命令界面。接着，按下“配置”，将目标体积设为9,800纳升，输送速率为每秒100纳升。然后按下“方向”切换至注入模式，再按下“运行”，从连接至微量注射器的聚乙烯管中注入9,800纳升蒸馏水。现在，将注射器放入含有矿物油的小瓶中，按下配置按钮，将目标体积设为 3,000 纳升，输送速率为每秒 100 纳升。为吸取 3,000 纳升矿物油，按下方向按钮切换至吸取模式，然后按下运行按钮。将聚乙烯管从微升注射器针头上拆下。要从微升注射器针头中推出 3,000 纳升蒸馏水，请按方向键切换至注入模式，然后按运行。接着将微升注射器重新插入聚乙烯管中。将注射器放入含有短链脂肪酸（SCFAs）的样品瓶中。设置注射器参数，将目标体积设为9,500纳升，输送速率为每秒100纳升。按下方向键切换至抽取模式，按运行键抽取9,500纳升短链脂肪酸（SCFAs）。标记油相中的SCFAs层，以确认SCFAs是否成功注入。设置配置，设定目标体积，并将输送速率设为每秒7纳升。按下方向键切换至注入模式。按下运行键，使微升注射器向前推进，直至商用注射器前端有液体流出，然后将注射器插入套管中进行短链脂肪酸（SCFAs）注射。在麻醉小鼠后，将商用注射器插入商用导向套管中。待小鼠从麻醉状态恢复后，将其放入一个新的笼子中，自由探索35分钟。在前5分钟内，以每秒7纳升的输送速率灌注短链脂肪酸（SCFAs），目标体积为2,100纳升。然后将方向调至注入模式并按下运行。行为学测试结束后，将商用注射器从商用导向套管中取出。以每秒 7 纳升的输送速率注入 2 次，每次 100 纳升的中性示踪剂，以验证注入位点。使用荧光显微镜对灌注部位的荧光信号进行成像。ACSF 和短链脂肪酸（SCFAs）灌注的小鼠均在新环境中笼内活动，总时长为 35 分钟。在新环境笼中的运动活动方面，短链脂肪酸（SCFAs）灌注与 ACSF 灌注之间未观察到差异。当使用商用导管套管向小鼠脑内灌注时，荧光染料在侧脑室及周围区域被检测到。同样，通过不锈钢导管套管进行灌注也会在小鼠脑的侧脑室及其周围区域检测到信号。将该方法与基于神经环路的技术相结合，将有助于科学家深入了解肠道代谢物在脑功能和行为的环路调控中所起的作用。该技术为研究人员探索微生物群及其代谢物在复杂的肠脑轴中的作用开辟了道路。

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Neuroscience

神经科学

自由移动小鼠中肠道来源的微生物代谢物的脑室内递送

本文展示了两种截然不同的注射方法：1）脑内注射（脑室内注射）和...

通过脑室内（ICV）和静脉内（IV）注射在小鼠中递送治疗剂

本视频演示了脑室内注射以研究小鼠巨细胞病毒（MCMV）在新生小鼠脑组织中的分布。经基因工程改造后可表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）以便观察的MCMV，被注射至幼鼠脑的侧脑室。注射后的病毒通过脑脊液循环，感染脑室周围区域的细胞，包括边缘带、脉络丛和室下区。...

通过脑室内注射分析新生小鼠脑内小鼠巨细胞病毒分布

来源：Liou, C. et al. 在自由活动小鼠中进行脑室内给予肠道来源微生物代谢物。 J. Vis. Exp.

小鼠模型中脑内注射肠道来源的微生物代谢物

已建立一种用于人类内窥镜下颅底重建的小鼠模型，该模型利用鼻黏膜移植物在脑组织与鼻腔之间构建一个半透性界面。此方法可使研究人员研究大分子治疗药物向中枢神经系统的递送，这类药物在全身给药时通常因血脑屏障的存在而无法进入中枢神经系统。...

小鼠脑部直接给药的异位黏膜移植术

在此，我们介绍一种向新生小鼠脑内进行脑室内和血管内注射病毒颗粒或荧光微珠的简单方法。通过显微镜观察或 原位 杂交。...

新生小鼠脑室内及血管内注射病毒颗粒与荧光微珠

本研究详细阐述了向新生小鼠灌胃精确剂量益生菌的操作过程。实验方案经过优化，包括但不限于益生菌给药、给药方法以及肠道内细菌的定量分析。...

使用灌胃法在新生小鼠中进行益生菌研究

本研究的目的是概述一种用于探究心血管疾病中菌群失调机制的实验方案。本文介绍了如何无菌采集和移植小鼠粪便样本、分离肠道组织，以及采用“瑞士卷”法处理肠道，随后结合免疫染色技术分析胃肠道中的病理变化。...

小鼠粪便分离与微生物群移植

迷走神经介导的肠-脑通信对于胃肠道内分泌系统与大脑之间的信息传递至关重要。然而，胃内注射葡萄糖是否能够改变皮层活动仍不清楚。本文提供了一种全面的实验方案，用于观察葡萄糖注入十二指肠后皮层活动的变化。...

肠道-脑神经通讯的实时分析：肠道葡萄糖刺激下的全皮层钙动力学

该方案演示了一种依次从小鼠门静脉和下腔静脉采集血液的方法，以评估肠道微生物代谢物的产生与吸收情况。...

从小鼠下腔静脉依次采集血液，随后采集门静脉血，以评估肠道微生物代谢物

建立小鼠阴道上行感染、早产及新生儿发病模型

本文描述了：（1）从出生后第6天（DOL 6）起对新生小鼠进行口服灌胃给药；（2）通过Ussing chamber评估出生后第10天至断奶期（出生后第20天）幼鼠结肠上皮屏障功能的离体（ex...

新生小鼠口服灌胃及利用尤斯室功能评估肠道屏障完整性的方法

了解通过脑室内导管向自由移动小鼠精确递送肠道微生物代谢物的方法。该技术为研究肠脑轴相互作用及其对神经功能的影响提供了可靠的实验框架。

自由活动小鼠脑室内给药肠道来源微生物代谢物

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