RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

RNA FISH 染色可用于可视化、鉴定和定量自然定植或感染秀丽隐杆线虫（C.elegans）的微生物，包括微生物组细菌和胞内病原体。该技术简单、快速且可靠，能够在完整动物个体背景下有效染色并观察微生物。我们可以利用 RNA FISH 检测并可视化野生型秀丽隐杆线虫肠道微生物组中的细菌。

这有助于我们理解哺乳动物系统中类似的相互作用。将含有目标微生物的线虫从NGM平板转移至微量离心管后，向微量离心管中加入1毫升1×PBST洗涤线虫。在微量离心机或Nano离心机中以适当转速离心样品。

用移液器吸除上清液，仅保留100微升。用PBST重复洗涤两到三次。用多聚甲醛固定线虫时，先向含有线虫沉淀物及100微升上清液的微量离心管中加入33微升16%多聚甲醛，使终浓度为4%多聚甲醛。

将含有被目标微生物定植或感染的线虫的样品在室温下孵育30至45分钟。去除多聚甲醛溶液，并向样品中加入0.5毫升PBST。根据文本稿件中所述的适当转速，在微量离心机中离心样品。

用移液器尽可能吸除上清液，注意不要扰动沉淀。向微量离心管中的样品加入 0.5 毫升 PBST。用 PBST 重复洗涤两到三次。

最后一次洗涤后，离心样品并弃去上清液，保留沉淀不受扰动。接着，每份样品准备一毫升杂交缓冲液。向含有线虫沉淀的微量离心管中加入800微升杂交缓冲液。

在微量离心机中离心收集样品。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。按每份样品100微升的量配制杂交缓冲液，加入所需浓度的FISH探针，使探针终浓度为每微升5至10纳克，涡旋混匀。

向每个样本中加入含有FISH探针的100微升杂交缓冲液。通过轻轻弹动或颠倒试管进行混匀。将样本在46至54摄氏度的干浴或46至54摄氏度、每分钟1,200转的恒温混匀仪中孵育过夜。

每个样品准备三毫升洗涤缓冲液。以适当速度离心样品。使用移液器小心移除杂交缓冲液，注意保持线虫沉淀物不受扰动。

向每个样品中加入1毫升已配制的洗涤缓冲液。以适当转速离心样品。用移液器小心吸除洗涤缓冲液，注意保持沉淀物不受扰动。

向每个样品中加入一毫升已配制好的洗涤缓冲液。将样品在干浴仪或恒温混匀仪中于 48 至 56 摄氏度孵育一小时，转速为每分钟 1,200 转。若在干浴仪中孵育，每 15 至 20 分钟轻轻翻转试管一次。

将样品以适当速度离心。使用移液器小心吸除洗涤缓冲液，注意保持沉淀物不受扰动。向每个样品中加入100至500微升PBST。

此时，样品可在 4 摄氏度的 PBST 中保存长达一周，直至准备继续实验步骤。以适当转速离心样品，形成沉淀。尽可能吸除 PBST，注意不要扰动线虫沉淀。

向样品中加入 20 微升含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。使用 200 微升移液枪头装载 20 微升移液器，并用剪刀剪去枪头尖端，以便移取较大的线虫。用剪切后的移液枪头将 5 至 10 微升沉淀转移至显微镜载玻片上。

用 22×22 的盖玻片封片。若需保存载玻片，可用指甲油密封盖玻片边缘，并置于 4°C 的暗盒中，直至后续使用。在微分干涉相差显微镜下观察发现，一株野生的热带隐杆线虫（Caenorhabditis tropicalis）被一种细菌定植，该细菌表现出对肠上皮的定向黏附特性。

绿色通用16S rRNA探针与红色Alphaproteobacteria物种探针的荧光信号完全重叠，表明定植于肠道中的大多数细菌为黏附性Alphaproteobacteria细菌。Orsay病毒的双组分RNA基因组由RNA1和RNA2两个片段组成，已针对这两个片段开发了FISH探针。在细胞质中显示Orsay病毒FISH染色阳性的细胞中，可见与绿色荧光蛋白标记的ZIP1蛋白定位于肠细胞核内。

展示了经Orsay特异性或N.parisii特异性FISH染色的多种动物，以说明该信号的强度，便于定量分析。利用针对18S的物种特异性探针竞争性结合，使C.elegans同时感染两种微孢子虫；使用DAPI染色细胞核，可在整体动物背景下更准确地定位感染部位，尤其是具有较大且易于识别的细胞核的肠道。N.parisii感染会导致裂殖体发育为孢子。

最终的FISH染色结果显示了大小不一的杆状结构，这些结构很可能对应于N.parisii孢子，它们被N.parisii特异性探针染成红色。在选择固定剂时需注意，PFA固定能更好地保持形态结构以及转基因GFP的信号，而丙酮固定则是观察孢质（sporoplasms）所必需的。RNA FISH可用于鉴定并可视化定植于C.elegans肠道内的细菌。

研究人员可进一步开展遗传筛选，以鉴定参与这些宿主-微生物相互作用的因子。