Name: RNA荧光 原位 杂交（FISH）可视化 秀丽隐杆线虫 肠道中的微生物定植和感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习使用RNA荧光原位杂交技术检测和定量分析秀丽隐杆线虫肠道中的微生物定植与感染，包括肠道菌群细菌和Orsay病毒等细胞内病原体，该方法简单快速且稳健。

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感谢Marie-Anne Félix博士为我们提供野生线虫品系。本研究工作由美国国家科学基金会（NSF）CAREER奖2143718项目、加州州立大学CSUPERB新研究者奖（授予RJL）、美国国立卫生研究院（NIH）R01 AG052622和R01 GM114139项目（授予ERT）以及美国心脏协会博士后奖学金（授予VL）资助。

注意：线虫可使用多聚甲醛溶液（PFA）或丙酮进行固定。与丙酮相比，PFA 能更好地保持形态结构，并可保留转基因绿色荧光蛋白（GFP）的信号，而该信号会被丙酮破坏。然而，为了使微孢子虫孢子通透以实现对该生活阶段的标记，必须采用丙酮固定。此外，丙酮比 PFA 更为方便，因其毒性较低，且样品可在 -20 °C 冰箱中于丙酮中保存数天，无需去除固定剂。以下是分别使用 PFA 溶液或丙酮作为固定剂的两种独立方案。有关实验步骤的图示，请参见图1。
1. 使用PFA固定的FISH染色
<ol>
	<li>制备携带相关微生物的线虫
	<ol>
		<li>在接种了适当食物来源的标准线虫生长培养基（NGM）平板上，用目标微生物培养线虫。将线虫在20 °C条件下孵育，直至达到所需的生活阶段。</li>
		<li>加入2 mL M9最低盐培养基（42 mM Na2HPO4，22 mM KH2PO4，8.6 mM NaCl，19 mM NH4Cl) + 0.1% Tween 20 加入含于 NGM 平板中的 秀丽隐杆线虫 感染或定植有待观察微生物的菌株。 
		&#8203;注意：添加去垢剂可防止线虫黏附在移液器和微量离心管上，并有助于沉淀L1-L2期线虫。可使用0.1% Triton-X替代Tween 20。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管和洗耳球从培养板中吸取线虫，并转移至已标记的1.5 mL离心管中。 
		注意：首选玻璃移液管，因为线虫容易黏附在塑料移液管上，但添加去垢剂（Tween 20 或 Triton-X）可减轻此问题。</li>
		<li>使用微型离心机，以 2,000 x g 离心含有定植或感染线虫的样品 g 60秒（适用于L1期动物）或500 × g 60秒，适用于L4或成虫期动物。所有后续离心步骤均以选定速度进行。</li>
		<li>用移液器从微量离心管中移除上清液。小心吸取上清液，避免扰动线虫沉淀，保留约100 µL上清液于沉淀上方。可通过带有刻度的1.5 mL微量离心管估算剩余液体体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洗线虫以去除外部污染
	<ol>
		<li>加入1 mL 1×PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4) 加 0.1% 吐温 20（PBS-T）至微量离心管中。</li>
		<li>在微量离心机中以适当速度离心样品（参见步骤1.1.4）。使用移液器吸除上清液，仅保留100 µL。可通过带刻度的1.5 mL微量离心管估测剩余体积。</li>
		<li>重复上述两个步骤 2-3 次。 
		注意：通常总共洗涤三次已足够；然而，可根据需要增加洗涤次数，以去除任何过量的外部污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用PFA固定线虫
	<ol>
		<li>在通风橱中，向含有步骤1.2.3所得线虫沉淀物上清液100 µL的微量离心管中加入33 µL 16% PFA，终浓度为4% PFA。 
		警告：PFA 为致癌物。接触 PFA 可能导致皮肤致敏和刺激以及眼部损伤。PFA 会释放有毒烟雾，可能引起呼吸道刺激或致敏。使用 PFA 时，应在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备，使用前请参阅相应的安全数据表。</li>
		<li>将含有目标微生物定植或感染的线虫样品在室温下孵育30–45分钟。孵育结束后，将样品置于4 °C条件下保存于70%乙醇中，直至继续进行实验方案。 
		注意：由于多聚甲醛（PFA）会随时间降解GFP，较短的孵育时间更有利于在转基因品系中维持GFP信号。较长的孵育时间则有助于固定剂更好地渗透样品。最佳孵育时间应根据样品情况通过实验经验确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>除去PFA溶液
	<ol>
		<li>在微量离心机中以适当速度离心样品（参见步骤 1.1.4）。使用移液器尽可能吸除上清液，注意勿扰动沉淀。 
		警告：上清液含有有毒的PFA。请在通风橱内将上清液以及至少前两次洗涤液作为有毒废物丢弃。</li>
		<li>向微量离心管中的样品加入 0.5 mL PBS-T。</li>
		<li>用 PBS-T 重复步骤 1.4.1 和 1.4.2，重复 2–3 次。 
		注意：增加洗涤次数有助于降低背景信号。建议至少进行四次洗涤。</li>
		<li>最后一次洗涤后，离心样品并弃去上清液，保留沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备杂交缓冲液（HB）并洗涤线虫
	<ol>
		<li>每份样品准备 1 mL HB 缓冲液（900 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.5，0.01% SDS）。 
		注意：每次使用前应新鲜配制 HB，以避免沉淀。然而，可预先配制通用缓冲液（900 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.5），并在室温下保存，直至需要使用 HB 时再取出。使用前，按每份样品 1 mL 量取通用缓冲液，并加入 SDS 至终浓度为 0.01%。</li>
		<li>向含有线虫沉淀的微量离心管中加入 800 µL HB。在微量离心机中离心收集沉淀（见步骤 1.1.4）。去除上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将FISH探针与目标序列杂交
	<ol>
		<li>每份样品取100 µL制备好的HB，加入所需FISH探针，使探针终浓度为5-10 ng/µL。 
		注意：FISH 探针为 15-23 个核苷酸长度的寡核苷酸，与目标微生物 SSU 的反义链互补，并在 5' 或 3' 端标记有彩色荧光染料（参见 表1 （此处所用探针）。通常，FISH 探针储备液的储存浓度为 1 mg/mL。</li>
		<li>向每个样本中加入含有FISH探针的100 µL HB。通过轻轻弹击或倒置试管进行混匀。 
		注意：可同时添加不同颜色的FISH探针，以在同一份样本中可视化多个荧光信号（参见 图1B).</li>
		<li>在46–54 °C的干浴仪中或在46–54 °C、1,200 rpm的恒温混匀仪中孵育样品过夜（6–24小时）。 
		注意：通常使用 46–48 °C 进行杂交孵育。然而，该温度可能需要根据 FISH 探针的熔解温度进行调整。一般情况下，杂交温度比熔解温度低 4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除FISH探针并清洗线虫
	<ol>
		<li>每份样品准备 3 mL 洗涤缓冲液（WB）（900 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.5，5 mM EDTA，0.01% SDS）。 
		注意：WB 缓冲液应在每次使用前新鲜配制，以避免产生沉淀。然而，通用缓冲液（900 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.5）可预先配制，并在室温下保存，待需要洗涤缓冲液时再使用。使用前，按每份样品 3 mL 量配制通用缓冲液，并加入 EDTA 至终浓度为 5 mM，以及 SDS 至终浓度为 0.01%。</li>
		<li>以适当速度离心样品（参见步骤 1.1.4）。使用移液器小心吸除上清液（HB），注意保持线虫沉淀物不受扰动。</li>
		<li>向每个样品中加入 1 mL 配制好的 WB。</li>
		<li>以适当转速离心样品（参见步骤 1.1.4）。使用移液器小心吸除上清液，注意保持沉淀物不受扰动。</li>
		<li>向每个样品中加入 1 mL 已配制好的 WB。</li>
		<li>在干浴器中于 48–56 °C 孵育样品 1 小时（或在 48–56 °C、1200 rpm 条件下使用恒温混匀仪孵育）。若使用干浴器孵育，每 15–20 分钟轻轻翻转试管一次。 
		注意：通常以 48 °C 作为标准洗涤温度；但如果背景信号较高，可能需要调整该温度。洗涤温度通常比杂交温度高 2 °C。在 WB 中，孵育时间可缩短至 30 分钟以进一步降低背景，之后应重复步骤 1.7.4 和 1.7.5。随后进行一次（针对细菌）或两次（针对微孢子虫孢原质）在 48 °C 下各 30 分钟的孵育。</li>
		<li>以适当速度离心样品（参见步骤 1.1.4）。使用移液器小心吸除洗涤缓冲液，注意保持沉淀物不受扰动。</li>
		<li>向每个样本中加入100–500 µL PBS-T。此时，样本可在4 °C条件下于PBS-T中保存长达一周，直至准备继续进行实验步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定线虫
	<ol>
		<li>以适当转速离心样品（参见步骤 1.1.4）。尽可能吸除 PBS-T，注意勿扰动线虫沉淀。</li>
		<li>（可选）加入 20 µL 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂（材料表) 加入样品中。</li>
		<li>使用20 µL移液器配200 µL吸头，用剪刀剪去吸头尖端，以便吸取较大的线虫。</li>
		<li>用剪去尖端的移液器吸头，将5–10 µL沉淀转移至显微镜载玻片上，盖上22 mm × 22 mm的盖玻片。如需保存，用指甲油密封盖玻片边缘，置于暗盒中，4 °C避光保存，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用丙酮固定的FISH染色
<ol>
	<li>按照步骤1.1所述方法制备带有相关微生物的线虫。</li>
	<li>按照步骤1.2所述方法清洗线虫，以去除外部污染。</li>
	<li>用丙酮固定线虫
	<ol>
		<li>移除上清液时勿扰动沉淀，向样品中加入1 mL实验级丙酮。 
		警告：丙酮是一种高度易燃的液体和蒸气。尽管可作为洗甲水在市面上购买，但需注意丙酮会引起严重的眼部刺激，并可能导致嗜睡或头晕。</li>
		<li>将含有目标微生物定植或感染的线虫样品在室温下孵育15分钟。孵育结束后，样品可在-20 °C条件下保存于丙酮中，最长可保存2周，直至继续进行后续实验步骤。 
		注意：请勿将本方案用于转基因样本 秀丽隐杆线虫 若需保持荧光信号，应使用表达GFP（或其等位突变形式）的菌株，因为丙酮会破坏该信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>除去丙酮
	<ol>
		<li>在微量离心机中以适当转速离心样品（参见步骤 1.1.4）。使用移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀。 
		警告：上清液含有丙酮。请在通风橱中将上清液以及至少前两次洗涤液作为有毒废物丢弃。</li>
		<li>向微量离心管中的样品加入 0.5 mL PBS-T。</li>
		<li>用 PBS-T 按照步骤 2.4.1 和 2.4.2 重复操作 2–4 次。 
		注意：增加洗涤次数有助于降低背景信号。建议总共进行四次洗涤。</li>
		<li>最后一次洗涤后，离心样品并弃去上清液，确保沉淀物不受扰动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备杂交缓冲液（HB），并按照步骤1.5所述洗涤线虫。</li>
	<li>按照步骤1.6所述，将FISH探针杂交至目标序列。</li>
	<li>去除FISH探针并清洗线虫
	<ol>
		<li>每份样品准备 1.1 mL 洗涤缓冲液（WB）（900 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.5，5 mM EDTA，0.01% SDS）。 
		注意：WB 缓冲液应在每次使用前新鲜配制，以避免产生沉淀。然而，通用缓冲液（900 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.5）可预先配制，并在室温下保存，待需要洗涤缓冲液时再行使用。使用前，按每份样品 1.1 mL 量取通用缓冲液，并加入 EDTA 至终浓度为 5 mM，加入 SDS 至终浓度为 0.01%。</li>
		<li>以适当速度离心样品（参见1.1.4）。使用移液器小心吸除上清液（HB），注意保持线虫沉淀物不受扰动。</li>
		<li>向每个样品中加入 100 µL 已配制好的 WB。</li>
		<li>以适当转速离心样品（参见1.1.4）。使用移液器小心吸除上清液，注意保持沉淀物不受扰动。</li>
		<li>向每个样品中加入 1 mL 已配制好的 WB。</li>
		<li>在干浴器中于 48-56 °C 孵育样品 1 小时（或在 48-56 °C、1,200 rpm 条件下使用恒温混匀仪孵育）。若使用干浴器孵育，每 15-20 分钟轻轻翻转试管一次。 
		注意：通常以 48 °C 作为标准洗涤温度；但如果背景信号较高，可能需要调整该温度。洗涤温度通常比杂交温度高 2 °C。</li>
		<li>以适当转速离心样品（参见步骤 1.1.4）。使用移液器小心吸除洗涤缓冲液，注意保持沉淀物不受扰动。</li>
		<li>向每个样本中加入100–500 µL PBS-T。此时，样本可在4 °C的PBS-T中保存最多一周，直至继续进行实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤1.8所述方法固定线虫。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

野生型 秀丽隐杆线虫 天然与多种微生物相关联。研究人员可利用RNA FISH技术检测并鉴定这些微生物，同时获得其在完整动物体内的定位信息。通过该方法可识别具有理想或有趣表型的微生物，随后将其分离以进行进一步的表征和测序。从野外分离出的大量细菌表明 秀丽隐杆线虫 也可进行定量分析 通过 RNA 荧光原位杂交29通过采用此处所述的方案，还可以观察宿主内部已知的微生物，并进一步了解它们之间的相互作用。尤为重要的是，奥尔赛病毒（Orsay virus）和微孢子虫（microsporidia）为专性寄生生物，无法脱离宿主进行独立培养，因此荧光原位杂交（FISH）是其标准的可视化工具。通过在接种了目标可培养细菌的培养板上培养线虫，并结合RNA荧光原位杂交（RNA FISH），还可对定植或感染程度进行定量分析。此外，该方法还可用于对微生物进行染色 秀丽隐杆线虫 肠道，本方案也可用于其他线虫品系，如 C. tropicalis 或 Oscheius tipulae19,23.
FISH 实验方案的主要优势在于，它提供了一种简单、快速且稳健的方法，用于对与 C. elegans 相关的微生物进行染色。FISH 染色所获得的图像具有较高的信噪比，这是通过使用靶向样本中 SSU 内丰富 RNA 的 FISH 探针实现的。由于 rRNA 的含量通常比 rDNA 高出 30 倍或更多，因此使用靶向 rRNA 的探针进行 FISH 染色所产生的信号主要来自 rRNA，而非 rDNA30。此外，RNA FISH 使得在完整动物背景下观察感染或定植过程成为可能。这种可视化可通过使用 DAPI 共染宿主细胞核和/或使用荧光标记的 C. elegans 品系来进一步增强，从而更清晰地显示感染或定植在样本中的定位。例如，研究人员曾利用针对微孢子虫特异性的 FISH，并结合一组在不同组织中表达 GFP 的 C. elegans 品系，确定了 Nematocida displodere 的组织嗜性20。此外，该实验方案易于调整，研究人员可根据自身特定需求优化实验条件（如调整固定时间、提高杂交温度）。
FISH 实验方案中的一个关键步骤是样品的固定。加入固定剂后需要进行孵育，以确保固定剂有足够时间渗透样品。对于含有转基因荧光蛋白的样品，过长的孵育时间并不理想，因为随着时间推移，PFA 会导致荧光蛋白降解。对于含有 GFP 的样品，必须确定最佳的固定时间，以实现充分的通透性，同时仍能保持 GFP 信号。
荧光原位杂交（FISH）可用于对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的细菌、病毒或微孢子虫进行染色。然而，FISH所使用的最佳固定剂类型取决于样本特性及后续实验需求。本实验方案采用多聚甲醛（PFA）溶液作为染色细菌和病毒的主要固定剂。然而，PFA不足以用于微孢子虫孢子的观察，因其无法穿透孢子壁。若需观察孢子，应改用丙酮进行固定。尽管如此，PFA固定法适用于微孢子虫其他生活阶段的FISH标记，包括孢原质体（sporoplasms）、裂殖体（meronts）和孢子母细胞（sporonts）。丙酮固定与PFA固定之间还存在其他主要差异：丙酮使用更为便捷，样品加入丙酮后可直接快速冷冻保存，无需洗涤步骤。然而，丙酮会迅速淬灭转基因宿主中现存的任何绿色荧光蛋白（GFP）信号。若需保留宿主中的某些生理结构，PFA是更优的固定剂，因为经丙酮固定的动物样本降解程度更高，导致某些组织的识别更加困难。由于样本经过固定处理，本FISH方案无法实现对宿主-微生物相互作用的活体实时成像（in vivo）。然而，通过脉冲-追踪感染时间序列实验，并在不同时间点对样本进行FISH染色，仍可观察到微生物感染过程中的部分动态变化19,20,31。
在整个实验流程中，杂交前后对样品进行彻底清洗是另一个关键步骤。在杂交前收集线虫至微量离心管时，NGM 平板上的过量细菌或其他微生物可能随线虫样品被带入。标准操作是用 PBS-T 清洗三次；然而，为了充分去除外部微生物，特别是使用污染较严重的野生分离的 C. elegans 时，可能需要进行更多次清洗。在 FISH 染色后观察封片样品时，可能会有部分残留的 FISH 探针导致样品背景产生较强的信号。清洗温度和清洗次数对于去除过量及非特异性结合的探针至关重要。为降低背景荧光，可改为每 30 分钟用 1 mL WB 溶液清洗一次，共清洗两到三次，而不是用 1 mL WB 溶液清洗一小时。不同的 FISH 探针可能需要不同的清洗温度。通常情况下，清洗温度比杂交温度高 2 °C，但如果背景荧光过高（噪声过大），可适当提高清洗温度。
FISH 实验方案利用设计用于靶向物种特异性微生物 RNA 的荧光探针，但也可针对其他高拷贝转录本设计 FISH 探针。不同 FISH 探针的熔解温度可能有所不同，因此孵育步骤可能需要在高于或低于所述温度的条件下进行。FISH 染色可识别微生物在宿主内定植或感染的空间分布，从而实现对宿主-微生物及微生物-微生物相互作用的表征。其局限性之一是&#160;只有少数几种常规荧光染料可同时使用，这&#160;减少可检测到的不同微生物的数量 通过 同时进行FISH。这&#160;限制了其在复杂微生物组研究中的应用 秀丽隐杆线虫然而，多色rRNA靶向FISH利用带有非经典荧光染料标记的探针，可增加可区分的微生物类群标签数量15另一个局限性在于，难以区分具有高度相似SSU序列的亲缘关系较近的物种，尤其是细菌。然而，微孢子虫物种之间显著的序列差异有助于利用本方案对其进行有效区分。图3)32,33.
总体而言，该FISH方案描述了一种在秀丽隐杆线虫（C. elegans）体内检测微生物的技术。该方法使研究人员能够利用一种透明且遗传操作简便的模式系统，在完整动物体内检测并量化定植与感染情况，同时识别微生物在宿主内的独特行为或形态特征。本论文的手稿预印本在审稿期间已发布34。

Caenorhabditis elegans 已成为研究肠道上皮细胞中先天免疫和宿主-微生物相互作用的有力模型系统1,2。由于其身体透明且仅有20个肠道细胞，C. elegans 为在完整生物体背景下监测微生物肠道定植和感染过程提供了一个便捷的系统。线虫的肠道细胞在形态和功能上与哺乳动物肠道上皮细胞具有多种相似性，使其成为解析微生物组定植和病原体感染相关机制的可行的 体内 模型3,4,5,6。
野生 C. elegans 以多种定植并感染其肠道的微生物为食，对这些线虫的采样已发现了多种天然与该宿主相关的病毒、真核生物（真菌、卵菌）和细菌7,8,9,10。其中，奥尔塞病毒（Orsay virus）被发现可感染线虫肠道，是目前唯一已知的 C. elegans 天然病毒9。微孢子虫是一类与真菌相关的专性胞内病原体，在野外捕获的 Caenorhabditis 线虫中最为常见，已有多个物种被发现可感染 C. elegans 及其近缘线虫8,11。许多细菌常存在于野外捕获的 C. elegans 肠道腔内，其中多个菌种已被确立为 C. elegans 微生物组（CeMbio）的天然研究模型6,12,13,14。发现并鉴定天然定植和/或感染 C. elegans 的微生物，对于理解调控宿主-微生物相互作用的遗传机制，以及揭示仅在完整宿主动物背景下才会发生的新型微生物过程至关重要。
采样后，对野生线虫进行筛选 通过 微分干涉对比（DIC）显微镜用于观察提示感染或定植的表型。例如，肠道细胞典型的颗粒状外观变化可能与胞内寄生虫感染的存在相关8具体而言，肠道颗粒的丢失和胞质黏度降低是病毒感染的征兆，而肠道颗粒重组形成“沟槽”状结构则可能提示感染了微孢子虫纲中的微孢子虫。 Nematocida8,9. 由于野生环境中存在种类繁多的微生物 秀丽隐杆线虫 样本中，通过微分干涉差显微镜观察难以区分不同微生物。由于许多微生物体积微小，其在宿主内的空间分布信息也可能难以检测。15此外，培养任何特定的目标微生物 体外 并不总是可行的，导致检测和/或定量存在困难。
RNA 荧光原位杂交（FISH）通过使用可与固定细胞中微生物小亚基核糖体RNA（SSU）结合的荧光探针，实现对微生物的荧光标记。如果形态学特征分析提示某一特定类群的微生物，可选用针对该类群或更广泛类群的FISH探针。例如，EUB338 被认为是细菌SSU的通用探针，常用于检测多种细菌16。本文所述方案采用末端标记荧光染料的单链DNA探针，该探针经特异性设计，可与目标微生物的SSU RNA互补配对，尽管已有预先设计好的探针可供使用16。以微生物SSU为靶点的主要优势在于该RNA在细胞内含量较高，通常占细胞总RNA的80%–90%，因而可获得信噪比极高的染色效果17。此外，也可设计靶向病毒RNA的探针以检测病毒，例如奥尔塞病毒（Orsay virus）9,18，当病毒处于活跃复制状态时，其在感染细胞中的拷贝数通常非常高。
根据已知探针的检测结果，可能需要获取更多的序列信息，以设计更具特异性的探针用于物种确认 原位一种常用的方法是使用针对SSU（细菌的16S和真核生物的18S）保守区域的通用引物进行扩增（通过 PCR扩增区域中更为多变的区段8利用该序列信息，可设计出更具物种特异性的探针。这些FISH探针随后能够以无需培养的方式实现对微生物的鉴定。8此外，RNA FISH 可揭示独特的形态学定植和感染特征，包括丝状结构或组织定位模式19,20可以同时使用不同颜色的FISH探针，从而在野生线虫样品中直观区分不同的微生物，并观察宿主内微生物与微生物之间的相互作用动态。15,20此外，RNA FISH染色可应用于宿主-病原体相互作用研究，通过手动或自动化方法可轻松定量已知物种的感染与定植情况，从而提供关于病原体载量的见解，例如在比较中 秀丽隐杆线虫 对感染具有增强或降低抗性的突变体21.

<table><tbody><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11-1</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂（Vectashield）</td><td>Vectalab</td><td>NC9524612</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>FISH 探针（见表1）</td><td>LGC Biosearch Technologies</td><td></td><td>FISH 探针通过商业定制寡核苷酸合成获得</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P-286</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S375-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-671</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-661</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>50-980-487</td><td>警告：PFA 为致癌物，需妥善操作</td></tr><tr><td>温控混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-151</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

rna荧光 原位 杂交（fish）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

野生动物的肠道 秀丽隐杆线虫 线虫体内栖居着多种微生物，包括肠道微生物组细菌以及微孢子虫和病毒等病原体。由于这些微生物与 秀丽隐杆线虫 以及哺乳动物肠道细胞，和该方法的强大之处 秀丽隐杆线虫 该宿主已成为研究宿主肠道-微生物相互作用的模式系统 体内虽然可以通过明场显微镜观察这些相互作用的某些方面，但在缺乏更精确工具的情况下，准确分类微生物并表征定植或感染程度仍具有挑战性。RNA荧光 原位 杂交（FISH）可作为识别和可视化野生线虫中微生物的工具，也可用于在实验室条件下对感染微生物的线虫进行实验性表征与定量分析。针对高度丰富的核糖体小亚基RNA设计的FISH探针，可使细菌和微孢子虫细胞产生明亮的信号。针对核糖体RNA中多个物种共有的保守区域设计的探针可用于广泛检测多种微生物，而针对核糖体RNA变异区域设计的探针则适用于更特异性的检测。类似地，也可设计用于标记病毒RNA的探针。本文提供了一种RNA FISH染色方案，适用于经多聚甲醛（PFA）或丙酮固定的样本。PFA固定适用于与细菌、微孢子虫及病毒相关的线虫，而丙酮固定则是可视化微孢子虫孢子所必需的。实验动物首先经洗涤后，用多聚甲醛或丙酮进行固定。固定完成后，将FISH探针与样本共孵育，以实现探针与目标序列的杂交。随后再次洗涤样本，并在显微镜载玻片上观察，或采用自动化方法进行分析。总体而言，该FISH方案可实现对定植于线虫体内微生物的检测、鉴定与定量 秀丽隐杆线虫 肠道，包括那些尚无遗传工具可用的微生物。

为了分析微生物组细菌，对野生分离的动物使用了针对细菌16S rRNA的特异性和通用FISH探针。野生型Caenorhabditis tropicalis菌株（JU1848）采自法属圭亚那Nouragues森林一条小河附近腐烂的棕榈树果实22。在微分干涉差（DIC）显微镜下观察，发现该线虫菌株的肠道上皮存在一种具有定向黏附特征的细菌（图2A）。随后对JU1848进行选择性清洗，以去除其他微生物污染物，并富集目标黏附细菌23。通过通用PCR方法，鉴定该细菌为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）的一个新物种。随后针对该细菌的16S rRNA序列设计了一种特异性FISH探针，并用Cal Fluor Red 610标记，以便在C. tropicalis体内荧光可视化其定植情况（图2B）。同时，还加入了一种可结合多种细菌16S rRNA的通用FISH探针（EUB338），该探针以6-羧基荧光素（FAM）标记。绿色和红色荧光信号完全重叠，表明定植于肠道内的大多数细菌均为该黏附性α-变形菌。这些样本在染色前经PFA固定处理。
为了在实验室中分析已知身份的胞内病原体感染情况，对野生型背景的 C. elegans 使用了奥赛病毒（Orsay virus）和微孢子虫特异性荧光原位杂交（FISH）探针。奥赛病毒属于正链RNA病毒，隶属于 Nodaviridae 科，是目前在 C. elegans 中发现的唯一一种天然病毒病原体。该病毒的基因组由两段RNA组成，即RNA1和RNA2，目前已开发出可靶向这两个片段的FISH探针（图3A、B）9,18。在肠道中，病毒RNA由RIG-I同源蛋白DRH-1感知24，该蛋白对于激活名为“胞内病原体应答”（Intracellular Pathogen Response, IPR）的转录防御程序至关重要25,26,27。抗病毒IPR基因的转录至少部分由转录因子ZIP-1调控21。在此，可见ZIP-1::GFP的表达定位于细胞质中呈现奥赛病毒FISH染色阳性的肠细胞核内（图3A）21。多个经奥赛病毒特异性FISH染色的动物样本展示了该信号的强度，便于进行定量分析（图3B）。图3A、B中所示动物均经PFA固定处理。
名为微孢子虫的寄生虫 Nematocida parisii，意为巴黎线虫杀手，是一种肠道专性胞内病原体。几种FISH探针可标记其18S rRNA N. parisii 已使用包括荧光标记的MicroA和MicroB探针在内的多种探针。展示了多只经MicroB FISH染色的动物，以显示该信号的强度，便于定量分析（图3C。此外， 秀丽隐杆线虫 会受到其他亲缘关系较近的微孢子虫感染。N2与 N. parisii 以及相关的 N. ausubeli 可通过设计物种特异性的FISH探针来区分，这些探针相互竞争结合于18S rRNA的差异区域图3D)28。在此示例中， N. parisii FISH探针与目标序列完全碱基配对 N. parisii 18S rRNA，但存在7个碱基对的错配 N. ausubeli 18S rRNA。相反的情况适用于 N. ausubeli 探针。因此，每种物种特异性的FISH探针将优先结合其对应的物种18S rRNA，而非非对应物种的18S rRNA。此外，使用DAPI染色细胞核可更准确地定位整个动物体内感染的位置，尤其适用于具有较大且易于识别细胞核的肠道组织。 图 3C，D 包含用PFA固定的动物。后续感染 N. parisii 导致裂殖体发育为孢子。为观察可视化 N. parisii 孢子，动物必须用丙酮固定，因为丙酮比PFA更易穿透孢子壁（图3E，F)8. 最终的FISH染色显示了小的和大的杆状结构，这些结构可能对应于 N. parisii 孢子，经染色后 N. parisii特异性探针（红色）。
<img alt="使用线虫样品、缓冲液配制和孵育步骤的荧光原位杂交（FISH）示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63980/63980fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：FISH实验流程的可视化示意图。 使用 Biorender.com 制作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63980/63980fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像，线虫中的荧光染色，细菌定位，细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63980/63980fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：野生型 C. tropicalis JU1848 菌株肠道内定植并黏附细菌的 FISH 染色结果。（A）微分干涉差显微镜（Nomarski）图像显示数千根细长的杆菌（bac）沿特定方向结合于 JU1848 菌株的肠道（in），在肠腔（lu）内形成毛发样表型。该图改编自 Morgan, E. 等人（2021）23。（B）对经多聚甲醛（PFA）固定的 JU1848 菌株进行 FISH 染色，使用红色标记探针（b002_16S_A-CF610）特异性靶向黏附细菌的 16S rRNA 序列（上图），以及绿色标记的通用 FISH 探针（EUB338-FAM）靶向细菌的 16S rRNA（下图）。宿主细胞核的 DAPI 染色呈蓝色。探针序列见表 1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63980/63980fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="秀丽隐杆线虫荧光显微镜观察；示意图；蛋白质定位；细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63980/63980fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：荧光原位杂交染色 秀丽隐杆线虫 感染了细胞内病原体。 (A，B) FISH染色 C. elegans 表达 ZIP-1::GFP 并感染奥尔塞病毒的样本，经 PFA 固定后进行染色以保存 GFP 信号。使用 Orsay 1 Red 和 Orsay 2 Red 探针进行病原体染色。A复合图像由红色和绿色荧光通道合并而成。Orsay病毒感染后诱导出细胞核内ZIP-1::GFP表达，以绿色显示。肠道颗粒的自发荧光呈黄色，用黄色箭头标示。虚线勾勒出线虫体轮廓。比例尺 = 25 µm. (B复合图像由红色荧光与微分干涉相差（DIC）通道合并而成。比例尺 = 200 µm. (C，D野生型的FISH染色 秀丽隐杆线虫 感染微孢子虫并用PFA固定的样本。C) 野生型的FISH染色 秀丽隐杆线虫 感染了 N. parisii 并用PFA固定。使用MicroB-CF610探针进行病原体染色。复合图像由红色荧光与DIC通道合并而成。比例尺 = 100 µm. (D) 野生型的FISH染色 C. elegans 共感染 N. parisii 和 N. ausubeli 在肠道中，使用一对特异性的FISH探针对两种病原体进行共染色，这些探针竞争结合18S rRNA的同一区域。 N. parisii 使用 MicroF-CF610（红色）进行染色 N. ausubeli 使用 MicroSp1A-FAM（绿色）进行染色。宿主细胞核的 DAPI 染色呈蓝色。比例尺 = 25 µm. (E) 野生型样本的丙酮固定FISH染色 C. elegans 感染了 N. parisii 孢子。使用 MicroA-CF610（红色）进行染色（红色）。比例尺 = 15 µm. (F微分干涉相差图像显示 N. parisii 孢子见于（E。比例尺 = 15 µm。在（E）和（F），小的和大的杆状结构分别用小箭头和大箭头标记，对应于N. parisii孢子。参见 表1 用于探针序列。图中所示为（A) 改编自 Lažetić, V. 等人 (2022)21. （中所示的图像B）和（C）改编自 Reddy, K. C. 等人（2019）26. 图中所示为（E）和（F) 改编自 Troemel, E. R. 等人 (2008)8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63980/63980fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>探针名称</td>
			<td>探针特异性</td>
			<td>探针荧光素</td>
			<td>探针序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EUB338-FAM</td>
			<td>细菌16S（通用）</td>
			<td>5' 6-荧光素（FAM）</td>
			<td>GCTGCCTCCCGTAGGAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b002_16S_A-CF610</td>
			<td>α-变形菌16S</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>TGTACCGACCCTTAACGTTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orsay1 Red</td>
			<td>Orsay病毒RNA1</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>GACATATGTGATGCCGAGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orsay2 Red</td>
			<td>Orsay病毒RNA2</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>GTAGTGTCATTGTAGGCAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroA-CF610</td>
			<td>Nematocida parisii 18S</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>CTCTGTCCATCCTCGGCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB-CF610</td>
			<td>Nematocida parisii 18S</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroF-CF610</td>
			<td>Nematocida parisii 18S</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>AGACAAATCAGTCCACGAATT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSp1A-FAM</td>
			<td>Nematocida ausubeli 18S</td>
			<td>5' 6-荧光素（FAM）</td>
			<td>CAGGTCACCCCACGTGCT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：FISH探针序列列表 所有FISH探针均购自商业供应商，荧光素标记在5'端通过 定制寡核苷酸合成；参见 材料表）并通过反相高效液相色谱法纯化寡核苷酸。

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C. elegans线虫的微生物的实验方案，以及在实验室可控感染后测定病原体载量的方法。

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

野生秀丽隐杆线虫的肠道中栖息着多种微生物，包括肠道微生物组细菌和病原体，例如……

RNA FISH 染色可用于可视化、鉴定和定量自然定植或感染秀丽隐杆线虫（C.elegans）的微生物，包括微生物组细菌和胞内病原体。该技术简单、快速且可靠，能够在完整动物个体背景下有效染色并观察微生物。我们可以利用 RNA FISH 检测并可视化野生型秀丽隐杆线虫肠道微生物组中的细菌。这有助于我们理解哺乳动物系统中类似的相互作用。将含有目标微生物的线虫从NGM平板转移至微量离心管后，向微量离心管中加入1毫升1×PBST洗涤线虫。在微量离心机或Nano离心机中以适当转速离心样品。用移液器吸除上清液，仅保留100微升。用PBST重复洗涤两到三次。用多聚甲醛固定线虫时，先向含有线虫沉淀物及100微升上清液的微量离心管中加入33微升16%多聚甲醛，使终浓度为4%多聚甲醛。将含有被目标微生物定植或感染的线虫的样品在室温下孵育30至45分钟。去除多聚甲醛溶液，并向样品中加入0.5毫升PBST。根据文本稿件中所述的适当转速，在微量离心机中离心样品。用移液器尽可能吸除上清液，注意不要扰动沉淀。向微量离心管中的样品加入 0.5 毫升 PBST。用 PBST 重复洗涤两到三次。最后一次洗涤后，离心样品并弃去上清液，保留沉淀不受扰动。接着，每份样品准备一毫升杂交缓冲液。向含有线虫沉淀的微量离心管中加入800微升杂交缓冲液。在微量离心机中离心收集样品。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。按每份样品100微升的量配制杂交缓冲液，加入所需浓度的FISH探针，使探针终浓度为每微升5至10纳克，涡旋混匀。向每个样本中加入含有FISH探针的100微升杂交缓冲液。通过轻轻弹动或颠倒试管进行混匀。将样本在46至54摄氏度的干浴或46至54摄氏度、每分钟1,200转的恒温混匀仪中孵育过夜。每个样品准备三毫升洗涤缓冲液。以适当速度离心样品。使用移液器小心移除杂交缓冲液，注意保持线虫沉淀物不受扰动。向每个样品中加入1毫升已配制的洗涤缓冲液。以适当转速离心样品。用移液器小心吸除洗涤缓冲液，注意保持沉淀物不受扰动。向每个样品中加入一毫升已配制好的洗涤缓冲液。将样品在干浴仪或恒温混匀仪中于 48 至 56 摄氏度孵育一小时，转速为每分钟 1,200 转。若在干浴仪中孵育，每 15 至 20 分钟轻轻翻转试管一次。将样品以适当速度离心。使用移液器小心吸除洗涤缓冲液，注意保持沉淀物不受扰动。向每个样品中加入100至500微升PBST。此时，样品可在 4 摄氏度的 PBST 中保存长达一周，直至准备继续实验步骤。以适当转速离心样品，形成沉淀。尽可能吸除 PBST，注意不要扰动线虫沉淀。向样品中加入 20 微升含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。使用 200 微升移液枪头装载 20 微升移液器，并用剪刀剪去枪头尖端，以便移取较大的线虫。用剪切后的移液枪头将 5 至 10 微升沉淀转移至显微镜载玻片上。用 22×22 的盖玻片封片。若需保存载玻片，可用指甲油密封盖玻片边缘，并置于 4°C 的暗盒中，直至后续使用。在微分干涉相差显微镜下观察发现，一株野生的热带隐杆线虫（Caenorhabditis tropicalis）被一种细菌定植，该细菌表现出对肠上皮的定向黏附特性。绿色通用16S rRNA探针与红色Alphaproteobacteria物种探针的荧光信号完全重叠，表明定植于肠道中的大多数细菌为黏附性Alphaproteobacteria细菌。Orsay病毒的双组分RNA基因组由RNA1和RNA2两个片段组成，已针对这两个片段开发了FISH探针。在细胞质中显示Orsay病毒FISH染色阳性的细胞中，可见与绿色荧光蛋白标记的ZIP1蛋白定位于肠细胞核内。展示了经Orsay特异性或N.parisii特异性FISH染色的多种动物，以说明该信号的强度，便于定量分析。利用针对18S的物种特异性探针竞争性结合，使C.elegans同时感染两种微孢子虫；使用DAPI染色细胞核，可在整体动物背景下更准确地定位感染部位，尤其是具有较大且易于识别的细胞核的肠道。N.parisii感染会导致裂殖体发育为孢子。最终的FISH染色结果显示了大小不一的杆状结构，这些结构很可能对应于N.parisii孢子，它们被N.parisii特异性探针染成红色。在选择固定剂时需注意，PFA固定能更好地保持形态结构以及转基因GFP的信号，而丙酮固定则是观察孢质（sporoplasms）所必需的。RNA FISH可用于鉴定并可视化定植于C.elegans肠道内的细菌。研究人员可进一步开展遗传筛选，以鉴定参与这些宿主-微生物相互作用的因子。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

这一简化的实验方案详细描述了从组织固定到利用荧光标记微生物，以检测和成像复杂组织样本中细菌的工作流程 原位 杂交...

通过荧光技术可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis...

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

学习使用RNA荧光原位杂交技术检测和定量分析秀丽隐杆线虫肠道中的微生物定植与感染，包括肠道菌群细菌和Orsay病毒等细胞内病原体，该方法简单快速且稳健。

RNA荧光原位杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染秀丽隐杆线虫肠道

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