2022年7月27日
肠道微生物,包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫(真菌)等胞内病原体,常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C. elegans线虫的微生物的实验方案,以及在实验室可控感染后测定病原体载量的方法。
RNA FISH 染色可用于可视化、鉴定和定量自然定植或感染秀丽隐杆线虫(C.elegans)的微生物,包括微生物组细菌和胞内病原体。该技术简单、快速且可靠,能够在完整动物个体背景下有效染色并观察微生物。我们可以利用 RNA FISH 检测并可视化野生型秀丽隐杆线虫肠道微生物组中的细菌。
这有助于我们理解哺乳动物系统中类似的相互作用。将含有目标微生物的线虫从NGM平板转移至微量离心管后,向微量离心管中加入1毫升1×PBST洗涤线虫。在微量离心机或Nano离心机中以适当转速离心样品。
用移液器吸除上清液,仅保留100微升。用PBST重复洗涤两到三次。用多聚甲醛固定线虫时,先向含有线虫沉淀物及100微升上清液的微量离心管中加入33微升16%多聚甲醛,使终浓度为4%多聚甲醛。
将含有被目标微生物定植或感染的线虫的样品在室温下孵育30至45分钟。去除多聚甲醛溶液,并向样品中加入0.5毫升PBST。根据文本稿件中所述的适当转速,在微量离心机中离心样品。
用移液器尽可能吸除上清液,注意不要扰动沉淀。向微量离心管中的样品加入 0.5 毫升 PBST。用 PBST 重复洗涤两到三次。
最后一次洗涤后,离心样品并弃去上清液,保留沉淀不受扰动。接着,每份样品准备一毫升杂交缓冲液。向含有线虫沉淀的微量离心管中加入800微升杂交缓冲液。
在微量离心机中离心收集样品。弃去上清液,注意不要扰动沉淀。按每份样品100微升的量配制杂交缓冲液,加入所需浓度的FISH探针,使探针终浓度为每微升5至10纳克,涡旋混匀。
向每个样本中加入含有FISH探针的100微升杂交缓冲液。通过轻轻弹动或颠倒试管进行混匀。将样本在46至54摄氏度的干浴或46至54摄氏度、每分钟1,200转的恒温混匀仪中孵育过夜。
每个样品准备三毫升洗涤缓冲液。以适当速度离心样品。使用移液器小心移除杂交缓冲液,注意保持线虫沉淀物不受扰动。
向每个样品中加入1毫升已配制的洗涤缓冲液。以适当转速离心样品。用移液器小心吸除洗涤缓冲液,注意保持沉淀物不受扰动。
向每个样品中加入一毫升已配制好的洗涤缓冲液。将样品在干浴仪或恒温混匀仪中于 48 至 56 摄氏度孵育一小时,转速为每分钟 1,200 转。若在干浴仪中孵育,每 15 至 20 分钟轻轻翻转试管一次。
将样品以适当速度离心。使用移液器小心吸除洗涤缓冲液,注意保持沉淀物不受扰动。向每个样品中加入100至500微升PBST。
此时,样品可在 4 摄氏度的 PBST 中保存长达一周,直至准备继续实验步骤。以适当转速离心样品,形成沉淀。尽可能吸除 PBST,注意不要扰动线虫沉淀。
向样品中加入 20 微升含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。使用 200 微升移液枪头装载 20 微升移液器,并用剪刀剪去枪头尖端,以便移取较大的线虫。用剪切后的移液枪头将 5 至 10 微升沉淀转移至显微镜载玻片上。
用 22×22 的盖玻片封片。若需保存载玻片,可用指甲油密封盖玻片边缘,并置于 4°C 的暗盒中,直至后续使用。在微分干涉相差显微镜下观察发现,一株野生的热带隐杆线虫(Caenorhabditis tropicalis)被一种细菌定植,该细菌表现出对肠上皮的定向黏附特性。
绿色通用16S rRNA探针与红色Alphaproteobacteria物种探针的荧光信号完全重叠,表明定植于肠道中的大多数细菌为黏附性Alphaproteobacteria细菌。Orsay病毒的双组分RNA基因组由RNA1和RNA2两个片段组成,已针对这两个片段开发了FISH探针。在细胞质中显示Orsay病毒FISH染色阳性的细胞中,可见与绿色荧光蛋白标记的ZIP1蛋白定位于肠细胞核内。
展示了经Orsay特异性或N.parisii特异性FISH染色的多种动物,以说明该信号的强度,便于定量分析。利用针对18S的物种特异性探针竞争性结合,使C.elegans同时感染两种微孢子虫;使用DAPI染色细胞核,可在整体动物背景下更准确地定位感染部位,尤其是具有较大且易于识别的细胞核的肠道。N.parisii感染会导致裂殖体发育为孢子。
最终的FISH染色结果显示了大小不一的杆状结构,这些结构很可能对应于N.parisii孢子,它们被N.parisii特异性探针染成红色。在选择固定剂时需注意,PFA固定能更好地保持形态结构以及转基因GFP的信号,而丙酮固定则是观察孢质(sporoplasms)所必需的。RNA FISH可用于鉴定并可视化定植于C.elegans肠道内的细菌。
研究人员可进一步开展遗传筛选,以鉴定参与这些宿主-微生物相互作用的因子。
本文介绍了一种用于检测和定量定植及感染秀丽隐杆线虫(C. elegans)的微生物(包括细菌和奥赛病毒等胞内病原体)的实验方案。该方法利用RNA荧光原位杂交(FISH)染色技术,在整个线虫体内进行可视化和定量分析。
RNA FISH 能够直接可视化并定量秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)肠道内的微生物定植与感染情况,为研究与哺乳动物系统相关的宿主-微生物相互作用提供了可靠的模型。该方法通过阐明遗传上易于操作的生物体中的微生物动态,支持早期阶段的发现研究,为以微生物组为靶点的治疗策略的转化研究和机制性风险降低提供依据。该技术能够检测多种微生物(包括缺乏遗传操作工具的微生物),从而提高临床前模型选择和靶点验证的预测可信度。
该RNA FISH方案通过实现假设验证、靶点确认以及对秀丽隐杆线虫(C. elegans)中微生物定植的定量评估,可整合到从发现到临床前研究的连续流程中。本方案适用于早期发现、检测方法开发及转化医学研究工作流程。