Name: 成年小鼠大脑中诱导荧光标记干细胞的谱系示踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 了解利用可诱导转基因谱系示踪小鼠模型对成年大脑干细胞进行荧光标记的方法。该技术通过免疫染色和共聚焦显微镜分析，揭示干细胞活化、增殖与分化的时空动态，为神经退行性疾病研究提供重要框架。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者谨感谢 Diana Carlone 博士（哈佛医学院波士顿儿童医院）和 Matthew Lynes 博士（乔斯林糖尿病中心；缅因医学中心研究所）在使用 mTert-rtTA 动物模型方面提供的指导。

本文所述所有方法均已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 构建谱系示踪Tet-On小鼠品系、繁育策略及实验队列小鼠的基因分型
注意：此处我们概述了以 Rosa-mTmG 作为荧光报告基因并发生 Cre 重组的 Tet-On 小鼠系统的构建方法，但 Tet-On 系统也可与其他多种由 Cre 重组驱动的报告基因小鼠品系联合使用。
<ol>
	<li>将一只 oTet-Cre (+/-) 雄鼠与一只或多只 R26 (mTmG) (+/+) 雌鼠放入同一交配笼中进行交配。实验小鼠交配设置的概览见图1。</li>
	<li>子代幼鼠（F1）基因型为 oTet-Cre (+/-) 或 oTet-Cre (-/-)，且均为 R26 (mTmG) (+/-)。根据补充表1中的引物和补充表2中的方案进行基因分型。</li>
	<li>断奶时，通过采集每只断奶小鼠的耳组织样本进行生殖系检测。在GFP/FITC荧光光谱下使用落射荧光显微镜观察耳组织样本，以确定动物在发育过程中是否发生了生殖系重组。若发生重组，该动物所有细胞均会表达GFP，耳组织样本将显示出mGFP荧光信号。此类动物不可用于后续交配或实验。 
	注意：非生殖系重组小鼠的耳组织在显微镜下仅显示内源性荧光（图1C），而生殖系重组动物则显示强烈的GFP信号（图1D）。对照耳组织可取自不含荧光转基因的小鼠。需注意，耳毛具有较强的内源性荧光，不能作为判断依据（图1C）。此外，白毛与黑毛小鼠之间的内源性荧光存在差异，因此分析时应使用与待测小鼠毛色相同的对照小鼠。</li>
	<li>将一只雄性 oTet-Cre (+/-) × R26 (mTmG) (+/-) 小鼠与一只或多只雌性 oTet-Cre (-/-) × R26 (mTmG) 小鼠进行交配。</li>
	<li>所得子代（F2）中，¼ 为 R26 (mTmG) (+/+)，½ 为 Cre (+/-)。将这些小鼠与 mTert-rtTA (+/+) 小鼠交配，即一只 oTet-Cre (+/-) × R26 (mTmG) (+/+) 小鼠与一只或多只 mTert-rtTA (+/+) 小鼠交配。 
	注意：本研究使用了 mTert-rtTA (+/+) 小鼠，但该流程也可适用于任何 rtTA 小鼠品系30。</li>
	<li>对于实验用动物，设置交配以获得 mTert-rtTA (+/+) 或 (+/-) × oTet-Cre (+/-) × R26 (mTmG) (+/+) 或 (+/-) 基因型的小鼠。</li>
</ol>
2. Cre 的多西环素诱导及脉冲-追踪实验设计
<ol>
	<li>当动物达到实验所需的合适年龄时，将其饮用水更换为含多西环素的水（dox水）：即含有5%蔗糖和2 mg/mL盐酸多西环素的饮用水。使用与实验动物接受相同多西环素脉冲-追踪处理但不携带Cre基因的动物作为对照组，以对照分析所产生的荧光表达模式。
	<ol>
		<li>配制完成后，将dox水在4 °C条件下保存，最长可保存1个月。更多信息请参见表1。dox水可通过饮水瓶给予动物，每瓶最多使用5天即需更换，因为若将dox水在室温下放置过久，可能发生真菌污染。 
		注意：当使用mTmG转基因时，至少需要2天的多西环素脉冲处理才能有效诱导mGFP信号（参见最初的mTmG研究论文）。 
		注意：我们未测试过除2 mg/mL以外的多西环素浓度。已有文献表明，通过饮水途径给药时，该浓度的效果最佳29。由于每只动物的饮水量可能存在差异，实际摄入的多西环素剂量也可能有所不同。为确保动物间给药剂量一致，也可采用多西环素注射或灌胃方式给药40。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脉冲期结束后，从动物笼具中移除dox水，并更换为普通饮用水。此后动物即进入“追踪”阶段，直至实验终点处死。</li>
</ol>
3. 经心灌注与脑组织解剖
<ol>
	<li>将小鼠从笼中取出，用左手拇指和食指固定动物。对动物进行注射 通过 腹腔内（腹腔注射) 注射含有100 mg/mL氯胺酮和20 mg/mL赛拉嗪的0.9%无菌生理盐水溶液，终浓度为200 mg/kg氯胺酮和20 mg/kg赛拉嗪。参见 表1 如需更多信息。 
	警告：麻醉方案可能因国家而异。此外，在进行用于脑组织采集和分析的灌注操作时，必须了解麻醉剂对大脑的影响，包括小胶质细胞形态与功能的变化以及皮质酮水平的改变。41,42.</li>
	<li>大约1-2分钟后，动物将失去翻正反射。检测方法为将动物翻转至仰卧位，若其无法自行翻回俯卧位，则表明已丧失翻正反射。</li>
	<li>大约5-10分钟后，动物将失去足底反射。检查足底反射时，用拇指和食指捏压动物的每只脚。若无跳跃或肌肉痉挛等反应，再用拇指和食指的指甲捏压动物的每只脚。若仍无反应，则表明动物已丧失足底反射。 
	注意：如果动物在注射后对足底反射的反应持续超过15分钟，则需追加一次注射 &#189; 可能需要补充初始的氯胺酮/赛拉嗪注射剂量。动物的年龄、性别、基因型、表型和处理方式可能影响其对该药物混合物的反应。</li>
	<li>当小鼠的翻正反射和足底反射消失后，用戴着手套的手指轻轻接触小鼠眼球以检测角膜反射。若无反应，则表明角膜反射已消失。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定，四肢用针固定于可插针的操作台面上。</li>
	<li>使用手术剪沿胸骨中线在剑突下方约1-2厘米处切开皮肤，向上剪至剑突。</li>
	<li>用镊子夹住剑突软骨。将剪刀插入，沿小鼠右侧身体斜向剪开肌肉和肋骨，直至锁骨水平。
	<ol>
		<li>用镊子提起胸肌，切开膈肌，直至可视心脏。然后沿小鼠左侧做相同的斜切口，注意避免接触心脏。使用止血钳将胸肌固定于体腔外侧。 
		注意：此时小鼠将无法继续呼吸，因此需迅速操作，以防在下一步之前死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用钝头镊子固定跳动的心脏，将移液针从主动脉弓基部插入左心室。</li>
	<li>将针头基部夹紧在插入部位上方的左心室。</li>
	<li>在右心房做一切口，一旦出现血液流出，即以8.11 mL/分钟的速度开始用20 mL 1×PBS灌注动物。</li>
	<li>当1×PBS灌注完机体后，更换为适用于下游应用的固定液，用20 mL固定液灌注小鼠。
	<ol>
		<li>对于冰冻切片和免疫染色，先用乙二醛固定液灌流动物以进行脑组织透明化处理，再用含4%多聚甲醛的1x PBS（pH 7.4）灌流动物。 
		注意：灌注成功的迹象包括动物身体僵硬（使用乙二醛时为轻度僵硬，使用PFA时为明显僵硬）以及组织中无可见的血管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠断头，用剪刀从脑干处插入，沿两侧鳞状缝剪至额上颌缝，切开颅骨。然后横穿鼻额缝剪开以取下颅顶，注意避免损伤嗅球。随后将颅骨翻转至倒置位置，使用弯头镊子取出脑组织，并确保切断视神经。</li>
	<li>将灌注后的脑组织放入组织包埋盒中，置于用于灌注动物的固定液中，于4℃过夜浸泡固定。 &#176;C.</li>
</ol>
4. 脑组织处理、切片与免疫染色
<ol>
	<li>脑组织处理与切片
	<ol>
		<li>从乙二醛固定液中取出脑组织盒，转入含15%蔗糖的1×PBS溶液中，4 °C孵育2天或直至脑组织沉底。</li>
		<li>从15%蔗糖溶液中取出脑组织盒，转入含30%蔗糖的1×PBS溶液中，4 °C孵育2天或直至脑组织沉底。 
		注：更多信息请参见表1。</li>
		<li>从30%蔗糖的1×PBS溶液中取出脑组织，使用冠状面或矢状面脑组织切块模具将脑组织分割为多个“组织块”。</li>
		<li>将冠状面或矢状面脑组织切片置于OCT包埋剂中，并放置于干冰与乙醇（EtOH）混合物上进行速冻。待OCT变为白色并完全凝固后，从干冰-乙醇混合物中取出，用Parafilm膜包裹后，置于密封袋中于-20 °C保存。</li>
		<li>从冰箱中取出冷冻组织块，放入设定内部温度为-20 °C的冷冻切片机中。使用OCT将组织块固定于金属持片夹上，确保组织牢固附着。静置约5分钟，使组织完全冻结于持片夹上。以7 µm厚度切片，并将每一片组织切片置于带电荷的玻璃载片上。</li>
		<li>将载片于37 °C烘烤过夜，随后置于-20 °C保存，直至用于免疫染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色
	<ol>
		<li>将载片恢复至室温（RT），并用预冷的丙酮后固定15分钟。</li>
		<li>用1×洗涤缓冲液（例如IHC Select TBS洗涤缓冲液）洗涤载片5分钟，每步之间在室温下以60 rpm振荡。</li>
		<li>如需对核抗原染色，使用0.3% Triton X-100在室温下透化10分钟；如需对胞质抗原染色，使用0.3% Tween-20在室温下透化10分钟。</li>
		<li>将载片置于50–100 mL的1×DAKO抗原修复液中，低火微波加热10分钟，重复两次。随后在室温下用洗涤缓冲液冲洗5分钟。</li>
		<li>将载片在含0.3% Typogen Black的70% EtOH溶液中室温孵育20分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤。</li>
		<li>在每份组织周围绘制疏水性屏障，避免组织干燥。随后每份组织加入1滴Millipore封闭试剂，于37 °C封闭20分钟。再向每份组织中加入100 μL用抗体稀释液稀释的一抗，于4 °C孵育过夜。</li>
		<li>次日，将切片与Alexa Fluor二抗在室温下孵育10分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤载片。</li>
		<li>每份脑组织切片覆盖100 μL以1:500稀释的、偶联AlexaFluor 488的抗-GFP抗体&#160;，以增强标记示踪细胞的内源性GFP信号，并于4 °C孵育过夜。</li>
		<li>次日，用洗涤缓冲液洗涤2次，再用流动的去离子水冲洗5分钟。 
		注：&#160;用去离子水洗涤时应轻柔操作，注意避免水流直接冲刷载片表面，以防脑组织切片从载片上脱落。</li>
		<li>用100 ng/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染5分钟，随后用流动的去离子水冲洗5分钟。</li>
		<li>在每份组织切片上滴加一滴封片剂，并用22 mm × 22 mm的盖玻片封片。建议在封片当天进行成像，以确保信号最佳。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. iDISCO 脑组织透明化（改编自39）
<ol>
	<li>固定与切片
	<ol>
		<li>4%多聚甲醛中4℃过夜后固定脑组织 &#176;C，然后在室温下再次孵育1小时。</li>
		<li>在室温下用1×PBS洗涤脑组织，每次1小时，共洗涤两次。然后使用相应的脑组织切块器将脑组织切成1 mm厚的切片，放入含有1×PBS的5 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲醇预处理（使用甲醇） 
	注意：由于甲醇可能影响某些蛋白质的免疫染色，作者建议读者参考 Renier 等人 2014 年发表的研究，以获取一种不含甲醇的 iDISCO 透明化方案替代方法39。参见 表 1 有关本节中以下溶液的更多信息。
	<ol>
		<li>在室温下，用1×PBS振荡洗涤两次，每次1小时。</li>
		<li>在室温下，用 PBS 配制的 50% 甲醇洗涤 1 小时（震荡）。</li>
		<li>在室温下用80%甲醇振荡洗涤1小时。</li>
		<li>在室温下，用100%甲醇振荡洗涤两次，每次1小时。</li>
		<li>用5%过氧化氢（H₂O₂）漂白样本2O2) 溶于 20% 二甲基亚砜（DMSO）/甲醇（1 体积 30% H2O2/1 体积 DMSO/4 体积甲醇，冰上预冷）于 4&#160;&#176;4°C 过夜（振荡）。</li>
		<li>漂白后，在室温下用甲醇振荡洗涤样本两次，每次1小时。</li>
		<li>在室温下，用 20% DMSO/甲醇溶液振荡洗涤 1 小时，重复两次。</li>
		<li>在室温下用80%甲醇洗涤1小时（振荡）。</li>
		<li>在室温下用50%甲醇振荡洗涤1小时。</li>
		<li>在室温下用 PBS 振荡洗涤，每次 1 小时，共两次。</li>
		<li>在 PBS/0.2% Triton X-100 中室温振荡洗涤，每次 1 小时，重复两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透明化脑组织的免疫染色
	<ol>
		<li>在37℃下，将样品孵育于1x PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M甘氨酸中 &#176;在旋转摇床上于4°C过夜孵育。</li>
		<li>在37℃下用1x PBS/0.2% Triton X-100/10% DMSO/6%山羊血清封闭 &#176;在旋转摇床上于4°C孵育3天。</li>
		<li>用 1× PBS/0.2% Tween-20/10 洗涤样品 &#181;37℃下，用来自猪黏膜的肝素钠盐（g/mL）处理1小时，重复两次 &#176;C，然后在 1x PBS/0.2% Tween-20/10 &#181;g/mL 肝素/5% DMSO/3% 山羊血清，含 1:500 稀释度的兔抗 GFP AlexaFluor 488 &#176;在轨道摇床上孵育 2 天。</li>
		<li>用含 0.2% Tween-20 的 1x PBS 洗涤样品 10 次 &#181;g/mL 肝素，37℃孵育 1 h &#176;在轨道摇床上振荡，每次三遍，然后每天一次，持续两天。</li>
		<li>在10 mL 50% v/v 四氢呋喃（THF）/H中于4°C孵育样品过夜2在15 mL锥形管中。</li>
		<li>在 10 mL 80% 四氢呋喃/水溶液中孵育样品 1 小时2O.</li>
		<li>用100% THF孵育样品，每次1小时，重复两次。</li>
		<li>用无菌擦拭纸擦干样品，并在二氯甲烷中孵育至样品沉入瓶底（约40分钟）。不要过度孵育 &#62;60 分钟 
		注意：务必在通风橱中操作二氯甲烷。</li>
		<li>将样品置于18 mL二苄基醚（DBE）中孵育至透明（&#62;2 小时。</li>
		<li>将样品在DBE中于室温下保存，直至准备成像。 
		&#8203;注意：为获得最佳结果，样品在透明化完成后应尽快进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 染色切片或透明化脑组织的成像
<ol>
	<li>对免疫染色的脑切片进行成像并分析载玻片 通过 共聚焦显微镜，可用于确认多种抗体的共表达。我们使用配备 HyD S 混合探测器的 Leica Stellaris 5 显微镜，但任何点扫描共聚焦显微镜均可适用。所用物镜包括 HC PL APO 10x/0.40 CS2、HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 和 HC PL APO 63x/1.40。
	<ol>
		<li>配置正确的激光线和发射滤光片。所需的激光及其对应的激光强度取决于所使用的显微镜和荧光染料组合。 
		注意：我们采用405 nm二极管激光器与白光激光器组合，针对所使用的每种荧光染料或荧光染料组合精细调节激发和发射光谱，以减少并消除串扰。使用传统的激光器/滤光片组合也可实现类似效果，但需密切注意通道间的信号渗漏。可通过依次单独开启每条激光线，并结合各目标发射滤光片组合，观察哪些通道受到特定激光的影响，从而识别信号渗漏。例如，若405 nm二极管激光器在GFP发射滤光片通道中产生可见荧光信号，则表明存在信号渗漏。为最大程度减少信号渗漏，应确保多个通道按帧依次连续成像。</li>
		<li>对于使用 mTmG 报告基因的 Tet-On 脑组织共染色样本，选择 DAPI（激发波长 405 nm，发射波长 450 nm）、GFP（激发波长 488 nm，发射波长 509 nm）、tdTomato（激发波长 555 nm，发射波长 582 nm），以及与二抗所用荧光染料相匹配的远红荧光染料。我们推荐使用 Alexa Fluor 647（激发波长 651 nm，发射波长 667 nm）。</li>
		<li>首先使用经GFP和荧光二抗染色的Cre-对照脑组织设定参数。这些脑切片可用于控制荧光抗体产生的背景荧光，并且不会显示真实的GFP信号。</li>
		<li>从上到下、从左到右逐一分析每张脑切片，以确保分析过程中未遗漏任何信号。若对同一脑切片在不同放大倍数下进行成像，建议先使用较低放大倍数，因为较高放大倍数会更快地淬灭mTomato信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了成像透明化的大脑样本，使用配备自动载物台和自动拼图功能的倒置共聚焦显微镜。我们采用徕卡Stellaris 5显微镜。由于样本较厚（&#62;500 &#181;m）时，需要更大的工作距离，这限制了可有效实现的放大倍数。我们对所有透明化脑组织成像均使用 HC PL APO 10x/0.40 CS2 物镜。
	<ol>
		<li>首先将清理好的脑切片平铺于玻璃底培养皿上，并浸入二苄基醚中。 
		注意：二苄基醚对大多数物镜镜头和大多数塑料具有腐蚀性。因此，玻璃底培养皿内的任何塑料部件均需涂覆快干型硅酮弹性体。</li>
		<li>配置正确的激光线和发射滤光片。对于使用 mTmG 报告基因共染色的 Tet-On 脑组织，选择 DAPI、GFP、tdTomato 以及与二抗所用荧光染料相匹配的相应远红荧光染料。设定所需分辨率，建议至少为 1024 × 1024。将针孔设为 1 AU。</li>
		<li>首先使用经GFP和荧光二抗染色的Cre-对照脑组织确定激光强度和检测器增益。这些脑切片可用于控制荧光抗体产生的背景荧光，且不应显示真实的GFP信号。</li>
		<li>在激光强度和探测器增益优化后，对脑组织进行成像区域的定位。首先，找到脑切片的完整边缘，以确定图像采集的X轴和Y轴范围；接着，将焦平面设定至组织中心深度附近，以确定Z轴方向，并利用Z轴位置控制功能定位 &#34;最高&#34; 组织的最高点（Z值最大处）。根据需要逐步增加Z轴最大高度，扫描组织的多个区域。
		<ol>
			<li>重复上述步骤 &#34;最低&#34; （最负的Z值）点，以获得组织的完整厚度。Stellaris 5 的限制为 &#177; 250 微米的焦平面。这将光学切片限制为 500 &#181;Z轴方向厚度为m。现在已知脑切片的三维区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将Z步进尺寸设置为6 &#181;m 并开始采集图像。采集时间取决于多个因素，根据所需参数的不同，可能从数小时到数天不等。为缩短图像采集时间，可尝试降低分辨率、提高激光扫描速度或增大步进间距。</li>
		<li>一旦获取了整个透明化脑切片的拼接图像，即可根据需要进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

一种用于构建、应用与分析三重转基因谱系示踪小鼠品系的方法，用于标记成年小鼠大脑中的干细胞 体内 描述了该方法。当与免疫染色或脑组织透明化技术结合时，可实现对全脑范围内示踪的荧光标记细胞进行识别与表征。该技术能够用于研究标记的干细胞在激活、迁移、分化或增殖过程中所表现出的可塑性、再生能力或重塑潜能。尽管先前获得的数据 通过 胸腺嘧啶脱氧核苷标记保留3 BrdU 研究得出结论，成年哺乳动物大脑中仅有的神经发生区域为侧脑室下区（V-SVZ）、嗅球以及齿状回的颗粒下区2,3,4,5,6,7,8,<sup c...

谱系示踪小鼠品系的价值 
干细胞分析 体内 由于许多检测这类细胞的方法仅关注动物死亡时的细胞特征，而这仅代表一个时间终点的静态快照，因此研究这些细胞可能较为困难。为了更深入地理解前体细胞、中间/过渡细胞类型以及成熟细胞在时间进程中的增殖、分化和迁移过程，需要采用纵向分析方法。这可以通过谱系示踪研究实现，即对干细胞/前体细胞进行永久性标记，并可在之后任意时间段内对其进行追踪。1.
在成年哺乳动物大脑中，成年出生神经元由干细胞和前体细胞生成的神经发生过程首次被分析 通过 胸腺嘧啶-脱氧核苷标记保留3&#160;2,3,4 或5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）5,6,7,8在这些研究中，增殖细胞通过胸腺嘧啶类似物进行标记，该类似物在细胞复制和分裂/增殖过程中被整合到细胞的DNA中。因此，被标记的细胞及其子代均含有该类似物，并可在死后鉴定。然而，尽管胸苷-H3 以及 BrdU 可用于标记增殖细胞及其子代细胞，从而研究干细胞功能尚不明确的脑区，但这些研究受限于上述工具的缺点。Thymidine-H3 诱导细胞周期阻滞、凋亡及剂量依赖性的DNA合成抑制9，而BrdU的标记水平因给药途径不同而有所差异10 并在细胞修复、凋亡以及细胞分裂过程中被细胞摄取11近年来已采用更高效的标记方法，例如使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）进行标记，但许多与BrdU相同的问题仍然存在12这些方法的局限性在于它们标记的是所有增殖细胞，而不仅仅是干细胞，因此结果的解读可能受到干扰。在神经发生谱系中，所有的干细胞和前体细胞都保持有丝分裂能力，只有终末分化/成熟的神经元不再增殖。对于星形胶质细胞和小胶质细胞（少突胶质细胞除外），增殖能力可无限期维持。13,14,15.
在研究干细胞及其后代细胞时，用于谱系示踪的转基因小鼠——仅对标记特定目的蛋白（例如本文所用的、已证实可识别成体干细胞的蛋白）的细胞进行追踪——已变得越来越普遍。尽管通过传统的转基因小鼠技术构建此类模型较为困难，但谱系示踪小鼠品系能够实现对脑内特定标记细胞的追踪，且不依赖于细胞增殖作为唯一依据。在 Tet-On 转基因小鼠系统中，给予四环素或其衍生物多西环素（doxycycline），可诱导那些携带反向四环素转录激活因子（rtTA）的细胞表达 Cre 重组酶，而 rtTA 的表达受特定启动子驱动。随后，由 Tet 诱导的 Cre 介导的重组将激活 Rosa 报告小鼠系统中不可逆的荧光或发光蛋白的表达，具体表达何种报告蛋白取决于所使用的 Rosa 报告小鼠品系。这些被永久标记的细胞在分裂、分化或迁移后仍持续表达该报告蛋白，从而实现对这些细胞及其后代在时间进程或不同干预条件下的动态追踪16。转基因谱系示踪方法的优势包括：1）仅特异性地追踪由 rtTA 标记的特定细胞谱系或前体细胞/干细胞；2）即使在细胞更替或分化后，荧光或发光蛋白仍能持续稳定表达；3）毒性低；4）可在动物生命周期的任意阶段进行条件性激活；5）易于与常规实验方法（如免疫染色/免疫荧光）结合使用16。
在小鼠中实现时间可诱导报告工具的其他方法包括使用 Cre-ERT2 小鼠，这些小鼠可与 ROSA-GFP、ROSA-mTmG 或其他荧光报告转基因小鼠联合使用。在这些动物中，细胞特异性调控元件（例如感兴趣的启动子或增强子区域）驱动 Cre 重组酶的表达，该酶仅在特定条件下被激活 通过 他莫昔芬的给药。尽管Cre-ERT2小鼠品系能够实现特定细胞系中Cre重组酶的诱导表达，但已有大量研究详细阐述了他莫昔芬对成年神经发生的各种影响。17,18此外，还存在许多由ROSA启动子驱动的荧光报告基因可用于替代GFP或mTmG，例如YFP或CFP，从而可在其他荧光波长下实现不同的荧光标记。这些荧光报告基因可与Tet-On或Cre-ERT2系统联合使用。
端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶全酶的限速组分，可在细胞分裂导致端粒缩短后，发挥延长端粒的作用。19,20TERT 已被确定为肠道成体组织干细胞的标志物21,22骨髓21肝脏23，脂肪组织24子宫内膜25,26，和骨1这些成体干细胞中的TERT表达是否仅用于端粒酶的延伸活性，还是也执行TERT的非经典功能27 仍不明确。已利用转基因谱系示踪小鼠在全身体内鉴定并追踪了表达TERT的静息态成体干细胞（qASCs），以研究这些干细胞的多能性与自我更新能力，以及其活化、增殖、分化和迁移的潜能1,22,23,28Tert-rtTA 转基因的构建此前已有报道1本文将描述使用谱系示踪的TERT小鼠品系来研究TERT+ qASCs，我们已鉴定出这类细胞为成年小鼠脑中一种新型的ASC群体。
转基因谱系示踪小鼠品系的建立 
为了利用Tet-On系统建立谱系示踪小鼠品系，需通过小鼠交配将三种转基因组合于同一动物体内。第一种是rtTA，其表达受目的基因启动子的调控（本研究中为TERT-rtTA）。在表达该目的基因的细胞中，rtTA随之表达。第二种是oTet-Cre基因，其包含四环素反应元件（TRE），可在rtTA融合转录本与四环素或强力霉素同时存在的情况下启动Cre重组酶的转录。四环素或强力霉素可通过给药方式施予动物 通过 饮用水或饲料29最后，必须存在一个能够被Cre重组酶切割后激活的基因。在本文中，我们将描述的标记基因为Rosa26-mTmG基因，在发生Cre重组之前，该基因会持续表达mTomato（在所有细胞中产生膜定位的红色荧光）。然而，如果某个细胞表达rtTA转录产物并存在四环素或强力霉素，则在mTomato与mGFP序列之间的loxP位点会发生Cre介导的重组，从而改变R26位点，使该细胞转而表达膜定位的EGFP（mGFP，即膜定位的绿色荧光），而非膜定位的番茄红荧光蛋白。这种mGFP信号的不可逆特性将使得 体内 细胞增殖、迁移和分化过程中的标记与示踪。通过示踪可分析细胞中GFP的表达情况 通过 标准冷冻切片或经光学透明化处理的较厚脑组织中的免疫荧光染色。
本文将介绍特定小鼠品系 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 的使用方法。为构建该三重转基因小鼠品系，我们首先将 oTet-Cre 小鼠（杰克逊实验室品系 #006234）与 Rosa-mTmG 小鼠（杰克逊实验室品系 #007676）杂交，以获得 oTet-Cre::Rosa-mTmG 双重转基因小鼠。这些小鼠的基因型鉴定采用 补充表 1 和 2 中所示的引物和 PCR 模板。随后将 mTert-rtTA 小鼠（由 David Breault 构建1）与 oTet-Cre::Rosa-mTmG 小鼠杂交，以生成 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 小鼠（图 1A）1,30。mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 小鼠品系的作用机制如 图 1B 所示。
多西环素诱导与脉冲-追踪实验设计 
在规划实验时，必须考虑若干会影响谱系示踪实验结果的因素，包括动物接受多西环素诱导时的年龄、多西环素给药的持续时间（即&#34;脉冲&#34;期）、停用多西环素后至组织采集前的时间长度（即&#34;追踪&#34;期），以及在这些过程中任何干预措施的时间安排。这些研究设计因素对于理解实验结束时被标记细胞及其子代细胞的状态至关重要。该过程的第一步是确定目标动物的年龄以及多西环素给药的持续时间。较长的脉冲期有助于更多细胞表达与rtTA相连的启动子，从而使更多目标细胞被永久标记。对于目标基因呈短暂表达的细胞类型，可能需要比持续表达该基因的细胞更长的脉冲期。然而，如果研究目的是探究目标细胞的短期效应或急性干预的影响，则脉冲期不能过长，因为一旦细胞被标记，在后续的脉冲期内其任何变化都将被持续追踪。在我们的一些研究中，采用了为期2天的脉冲且无追踪期的设计，以更接近TERT的直接报告系统。这是因为Rosa-mTmG基因发生重组所需的最短时间为2天31。
脉冲追踪实验中的下一个关键阶段是撤除强力霉素与动物灌注之间的时间长度，也称为“追踪”阶段。无论给药途径如何，强力霉素在小鼠体内的半衰期约为170分钟，因此可以推断，在撤除强力霉素数小时后，其诱导作用很可能已不再发生32。然而需要注意的是，在老年小鼠中，强力霉素的代谢速度较慢，可能导致有效的“脉冲”期比年轻动物更长33。
在追踪期间，即使细胞发生增殖、分化或迁移，已被标记的细胞仍将持续保持标记状态。这些细胞的子代也将被标记。研究目的将决定脉冲-追踪实验方案的持续时间。如果研究目标是了解特定细胞在较长时间内对组织再生的作用，则可能需要较长的追踪期。最后，还需确定任何干预或处理措施的时间安排。在脉冲期间施加干预会影响表达目标基因的细胞及其在此期间产生的所有子代细胞；而在追踪期间施加干预则主要影响目标细胞的子代细胞，不过这也取决于被标记细胞分裂或分化的速度。我们所采用的一些脉冲-追踪实验设计示例见图2A。
还应注意背景 GFP 信号可能因泄漏表达而产生。泄漏表达是由于在无多西环素的情况下，rtTA 与 Otet 序列之间存在固有的结合能力，以及在无 rtTA 时 Otet 转基因仍具有残余活性所致（详见文献34）。泄漏表达是 Tet 系统的一个缺陷，尽管这种泄漏通常被视为系统可接受的副作用，但在某些情况下，泄漏表达可能导致毒性甚至死亡，例如在 Otet-DTA 动物中表达白喉毒素（DTA）时，会限制这些系统的应用35。
大脑处理、切片及薄切片免疫荧光显微镜检测 
在进行谱系示踪实验后，若要分析小鼠的大脑，需首先对小鼠进行灌注 通过 经心灌注以清除可能引起脑组织高自发荧光的血液和脑脊液。常用的灌注固定液有两种：Histochoice 组织固定液（一种乙二醛固定液，GF）或 4% 多聚甲醛（PFA）。乙二醛固定液的固定过程相对温和，交联程度低于 PFA，可减少组织僵硬，降低抗原修复的需求，并在免疫染色过程中允许使用较低浓度的抗体溶液。然而，若其中含有甲醇，则可能增加自发荧光。36另一方面，多聚甲醛（PFA）通常可实现更牢固的固定效果；尽管在免疫染色过程中需要进行抗原修复，但有些抗体仅适用于PFA固定的组织，且后续所述的光学透明化技术必须采用4% PFA灌注固定。
灌注后需进行后固定步骤，即将脑组织浸入与灌注时所用相同的固定液中过夜。这一步骤可确保在灌注过程中可能未完全固定的脑区继续完成固定。接下来，脑组织将在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育蔗糖，以在冷冻前尽可能去除水分，防止组织内形成冰晶（&#34;cryo-preservation&#34;）。随后，脑组织可被切成任意数量的矢状面、冠状面或横断面组织切片用于后续处理。为了保证精确性和可重复性，必须使用校准的脑切片模具，以确保不同动物之间的前囟位置切面保持一致。影响脑组织切片方式的最重要因素是所关注的脑区。例如，虽然矢状面切片可在单个组织切片中分析更多的脑区，但该切面无法有效分析脑室-脑室下区（V-SVZ）的神经发生/胶质发生区域，因为在该维度下难以区分侧脑室的外侧和内侧部分，而这些结构在冠状面上观察更为清晰。在成年神经发生研究中，这一区别尤为重要，因为侧脑室外侧壁含有具有神经发生能力的V-SVZ，而侧脑室内侧壁则是一个更倾向于胶质发生的微环境37。
将组织切成冠状面、矢状面或横断面后，需使用最佳冷冻温度（OCT）包埋剂将其冷冻成组织块。此处，脑组织在包埋介质中通过干冰与乙醇混合物进行冷冻。若需进行薄切片分析，可在冷冻切片机上将组织块切片，并根据后续分析需求，将薄切片（&#60;20 µm）贴附于带正电荷的玻璃载片上。也可使用未带电荷的玻璃载片，但使用未带电荷载片可能导致组织从载片上脱落38。若需要中等厚度的游离切片（&#62;20 µm），则应以游离切片形式收集组织。若需要厚切片（0.5–4 mm），则必须使用振动切片机切割未冷冻的脑组织。需要注意的是，载片上的切片需在 -20 至 -80 °C 冷冻保存，而游离切片则在 4 °C 保存，两者储存条件不同。
脑组织透明化与整体免疫荧光共聚焦显微镜成像 
如果希望对小鼠脑中谱系示踪细胞进行更广泛但细节较少的分析，可通过iDISCO脑组织透明化方法39结合免疫染色及拼接式z轴层扫共聚焦显微镜或光片显微镜，对较厚的脑组织片段进行系统性分析。在此过程中，小鼠脑组织的大片区域将经过光学透明化处理（即去脂化过程39），从而更有利于在1 mm厚的组织切片中实现荧光信号的成像。该方法的缺点是自发荧光较强，且由于工作距离较传统方法（如薄层冷冻切片或游离漂浮切片）更长，导致对细胞形态的高分辨率成像以及精细的共染分析能力下降。因此，我们建议将脑组织透明化技术用于分析多个脑区内的大范围谱系示踪结果，而不宜用于单个细胞的表征或详细分析。

<table><tbody><tr><td>抗体稀释液</td><td>安捷伦</td><td>S080983-2</td><td></td></tr><tr><td>抗原修复液</td><td>安捷伦</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A2311</td><td>以1:500-1:1000的比例使用</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX:006234</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX:007676</td><td></td></tr><tr><td>封闭液（免疫组化）</td><td>Millipore Sigma</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>钝针</td><td>BSTEAN</td><td>X0012SYHIV</td><td></td></tr><tr><td>冠状脑组织切块</td><td>布雷恩特里</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>康宁</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D564</td><td></td></tr><tr><td>二苄基醚</td><td>默克生命科学</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>猪黏膜来源肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice 分子生物学组织固定液</td><td>Amresco</td><td>H120</td><td>该产品现已停产，但可用 Glyo-Fixx（Thermo Scientific，6764265）替代</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516813</td><td></td></tr><tr><td>IHC Select TBS 洗涤缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>向西</td><td>0143-95095-10</td><td>此产品储存和使用需要 DEA 许可证。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Milipore 封闭剂</td><td>默克密理博</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度溶液</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS溶液（10倍浓缩）</td><td>Teknova</td><td>P0496</td><td></td></tr><tr><td>矢状面脑组织块</td><td>布雷恩特里</td><td>RBM-2000S</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>布劳恩</td><td>S8004-5264</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>苏丹黑（Typogen）</td><td>Millipore Sigma</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Simport</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>默克生命科学</td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>AnaSed</td><td>sc-362950Rx</td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

一种端粒酶逆转录酶（Tert）谱系示踪小鼠品系被开发用于研究成体组织干细胞的行为与命运，该品系通过将“Tet-On”系统oTet-Cre小鼠与一种新型反向四环素转录激活因子（rtTA）转基因小鼠杂交而获得，后者携带与Tert启动子相连的rtTA，我们已证实该系统可标记一类新型的成体脑干细胞群体。在此模型中，向mTert-rtTA::oTet-Cre小鼠给予四环素衍生物多西环素，将永久性地标记表达Tert基因启动子区4.4 kb片段的一群细胞。当与Rosa-mTmG报告小鼠联合使用时，mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG三重转基因小鼠的细胞在未给予多西环素时表达膜定位的tdTomato（mTomato），而在多西环素处理后，表达Tert的细胞中mTomato的表达将被膜定位的EGFP（mGFP）所取代。因此，当这些三重转基因谱系示踪小鼠接受多西环素（ &#34;脉冲&#34; 在TERT表达细胞被标记的时间段内，这些细胞将被永久性地标记为mGFP+细胞，在撤除多西环素后可对其进行任意时长的追踪（该 &#34;追踪&#34; 时期），即使随后Tert表达丢失。然后对脑组织进行灌注固定，并进行免疫荧光及其他下游应用处理，以解析干细胞激活、增殖、谱系承诺、向不同脑区微环境迁移以及分化为成熟细胞类型等方面的变化。利用该系统，任何rtTA小鼠均可与oTet-Cre及Rosa报告小鼠杂交，从而实现强力霉素诱导的 &#34;脉冲-追踪&#34; 谱系&#160;使用干细胞标记物进行示踪实验。

尽管由带有荧光报告基因的Tet-On系统产生的荧光信号会因所研究的启动子和所用荧光团的不同而有所变化，我们将以mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG动物为例说明结果的分析方法。在进行脉冲-追踪实验后，成年动物脑组织中多个解剖学区域均可见表达膜定位GFP的细胞。不同细胞类型之间的荧光强度差异需特别注意。影响荧光强度的一个因素是细胞膜的大小。例如，脉络丛中的脉络丛上皮细胞（CPECs）具有较厚的细胞膜，荧光信号强，易于与周围细胞区分（图4A，B）。然而，脉络丛间质中其他一些体积较小且目前尚未明确鉴定的细胞类型则表现出较弱的GFP信号（图4C）。在小脑中，伯格曼胶质细胞（Bergmann glial cells）的mGFP表达水平高于篮状细胞（basket cells），甚至在单个篮状细胞之间也存在mGFP表达水平的差异（图4D）。嗅球的嗅小球层内，嗅觉感觉神经元的轴突也表现出高水平的mGFP表达（<stro...

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel 信息。

一种端粒酶逆转录酶（Tert）谱系示踪小鼠品系被建立，用于通过……研究成体组织干细胞的行为与命运

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系对干细胞及其子代细胞进行标记，可在活体条件下对脑内成体干细胞的激活、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析。谱系示踪能够揭示有关谱系承诺、对干预措施的响应以及多能性等方面的全新信息。转基因谱系示踪方法的优势包括：能够特异性地追踪特定细胞谱系；荧光蛋白的表达不可逆，不受细胞更替或分化的影响；多西环素毒性低；可条件性激活；并且易于与多种下游检测技术联用，例如对谱系示踪组织进行免疫染色和免疫荧光分析。由于可塑性及细胞在成年大脑中的广泛意义，对成年干细胞的表征与分析将有助于神经退行性疾病、代谢对脑可塑性的影响、衰老及其他相关状况的研究。首先，将载玻片升温至室温，并用预冷的丙酮在冰上固定15分钟。随后在1X漂洗缓冲液中洗涤载玻片5分钟，每步之间于室温下以每分钟60转的速度振荡。对于核抗原的检测，使用0.3% Triton X-100在室温下孵育10分钟进行透化处理。对于细胞质抗原的检测，使用0.3% Tween-20在室温下孵育10分钟进行透化处理。将切片置于50至100毫升的1×DAKO抗原修复液中，低火微波加热10分钟，重复两次，以完成抗原修复。接着，在室温下用缓冲液冲洗五分钟。将切片在含有0.3%明胶黑的70%乙醇溶液中室温孵育20分钟，然后用冲洗缓冲液洗涤。在组织周围绘制疏水性屏障。用封闭剂在37摄氏度下封闭20分钟。然后在4摄氏度下，用抗体稀释液稀释的一抗溶液孵育过夜。室温下洗涤载玻片10分钟。第二天，在室温下用 Alexa Fluor 二抗孵育切片 10 分钟。然后用漂洗缓冲液洗涤载玻片两次，每次 10 分钟。在脑切片上覆盖 100 微升 1:500 稀释的与 AlexaFluor 488 偶联的抗 GFP 抗体，4 摄氏度下孵育过夜，以增强内源性 Fluor4 信号，标记被示踪的细胞。第二天，用漂洗缓冲液洗涤两次，然后在流动的去离子水中洗涤五分钟。用100纳克/毫升的4'6-二脒基-2-苯基吲哚（4'6-diamidino-2-phenylindole）复染五分钟。然后用流动的去离子水冲洗5分钟。在每张组织切片上加入一滴荧光安全封片剂，并用22毫米×22毫米的盖玻片封片。建议在封片当天进行成像，以确保最佳信号。在经心脏灌注后，将脑组织在4%多聚甲醛（PFA）中于4°C下固定过夜，随后在室温下继续固定1小时。再用1×PBS在室温下洗涤脑组织，每次1小时，共洗涤两次。使用矢状面脑组织切块装置将脑组织切成一毫米厚的切片，并放入含有1×PBS的5毫升微量离心管中。进行甲醇预处理时，先在室温下用1×PBS洗涤两次，每次一小时；然后在50%甲醇中室温洗涤一小时。在室温下用 80% 甲醇洗涤一小时。在室温下用 100% 甲醇洗涤两次，每次一小时。在 4°C 条件下，用含 5% 过氧化氢的 20% 二甲基亚砜甲醇溶液过夜漂白样品。漂

lineage-tracing-inducible-fluorescently-labeled-stem-cells-adult

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成年小鼠大脑中诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

可诱导的遗传谱系示踪（GIFM）可实现对细胞的精细时空控制下的标记与追踪 体内...

一种用于遗传诱导命运图谱绘制的实用方法：标记与追踪细胞的可视化指南 体内

本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。...

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

本视频演示了利用EdU掺入法对脑组织切片中新生增殖的神经干细胞进行染色，随后通过免疫荧光技术可视化特定蛋白，以增强对细胞动态及增殖过程的理解。...

小鼠脑切片中增殖神经干细胞的免疫荧光染色可视化

来源： Gómez-Villafuertes, R., et. al., 通过活体成像结合单细胞追踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学特性及谱系进展. J. Vis. Exp. (2017)...

活体成像与单细胞追踪监测成年神经干细胞中的神经谱系

来源：Daynac, M., et. al．从小鼠成年脑室下区分离神经干细胞与前体细胞及其细胞周期动态的活体成像．J. Vis. Exp.

小鼠神经干细胞分裂的共聚焦显微镜延时成像

我们报告了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠脑的脑室下区（SVZ）分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞。该方法应用于荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）转基因小鼠时，可实现通过活细胞成像来研究细胞周期进程。...

成年小鼠侧脑室下区神经干细胞与前体细胞的分选及细胞周期动态的活体成像

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

本文介绍了使用R26R-Confetti小鼠进行多色谱系示踪实验的设计与操作原理，并提供了一种针对角膜上皮细胞追踪的具体实验方案，该方案可经修改后适用于其他感兴趣的组织。...

使用多色荧光报告小鼠对角膜细胞进行谱系示踪的方法

本文介绍了一种通过延时视频显微镜监测神经细胞群体，并结合基于软件的后期处理的稳健方案。该方法是一种强大的工具，可用于在活体成像实验中识别特定细胞群体内的生物学事件。...

活体成像联合单细胞示踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学与谱系进展

本文介绍了一种利用双标记嵌合分析（MADM）在单细胞水平上对候选基因进行谱系示踪和功能遗传学分析的实验方案。MADM克隆分析提供了一个定量框架，用于测量单个前体细胞及其子代细胞的增殖行为、细胞产出及谱系关系。...

利用双标记嵌合体分析技术（MADM）对发育中大脑皮层进行谱系追踪与克隆分析

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

了解利用可诱导转基因谱系示踪小鼠模型对成年大脑干细胞进行荧光标记的方法。该技术通过免疫染色和共聚焦显微镜分析，揭示干细胞活化、增殖与分化的时空动态，为神经退行性疾病研究提供重要框架。

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

探索更多视频