成年小鼠大脑中诱导荧光标记干细胞的谱系示踪
May 20th, 2022
使用诱导的转基因谱系追踪小鼠系，用荧光团永久标记干细胞及其后代的能力允许对 体内的活化，增殖，迁移和/或分化进行空间和时间分析。谱系追踪可以揭示有关谱系承诺、对干预的反应和多能性的新信息。
用可诱导的转基因谱系追踪小鼠系标记干细胞及其后代，可以对体内大脑中成体干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间分析。谱系追踪可以揭示有关谱系承诺、对干预措施的反应和多效性的新信息。转基因谱系示踪方法的优点包括追踪特定细胞谱系的特异性，无论细胞更新或分化如何，荧光蛋白的不可磨灭表达，多西环素的低毒性，条件激活以及易于与谱系痕量组织（包括免疫染色和免疫荧光）的常见下游测定一起使用。
由于可塑性和细胞在成人大脑中的广泛影响，成体干细胞的表征和分析将有助于研究神经退行性疾病，代谢对大脑可塑性的影响，衰老和其他相关条件。首先，将温玻片加热至室温，并用冰冷的丙酮后固定15分钟。在1X冲洗缓冲液中洗涤载玻片五分钟，每步之间在室温下以每分钟60转的速度摇动。
在室温下用0.3%Triton X-100透化核抗原10分钟。在室温下用0.3%吐温-20透化细胞质抗原静置10分钟。在 50 至 100 毫升的 1x DAKO 抗原检索溶液中，通过微波载玻片进行抗原检索，低速 10 分钟，两次。
接下来，用缓冲液在室温下冲洗五分钟。将载玻片在室温下在0.3%酪氨酸黑中与70%乙醇孵育20分钟，然后用冲洗缓冲液洗涤。在组织周围绘制疏水屏障。
用封闭试剂在37摄氏度下封闭20分钟。并与稀释的一抗一抗在抗体稀释液中在4摄氏度下孵育过夜。在室温下清洗载玻片10分钟。
第二天，在室温下将Alexa Fluor二抗切片孵育10分钟。然后在冲洗缓冲液中洗涤载玻片两次，持续 10 分钟。将100微升与AlexaFluor 488偶联的1至500个抗GFP抗体覆盖脑切片，并在4摄氏度下孵育过夜以增强内源性Fluor4，标记迹线细胞。
第二天，用冲洗缓冲液清洗两次。然后在流动的DI水中洗涤五分钟。用每毫升100纳克4'6-二氨基-2-苯基吲哚复染五分钟。
然后在流动的去离子水中洗涤五分钟。在每个组织切片的顶部添加一滴荧光安全安装介质，并用22毫米×22毫米的盖玻片密封。建议在安装当天进行成像，以确保获得最佳信号。
在经心灌注后开始固定和切片，在4%PFA中在4摄氏度下过夜。然后在室温下再呆一个小时。在室温下用1x PBS清洗大脑一小时两次。
使用矢状脑块将大脑切成一毫米厚的部分，并放入含有1x PBS的五毫升微离心管中。对于甲醇预处理，首先在室温下用1x PBS洗涤一小时两次。在室温下用50%甲醇洗涤一小时。
在室温下用80%甲醇洗涤一小时。在室温下用100%甲醇洗涤一小时，两次。用5%过氧化氢在20%二甲基亚砜和甲醇中在4摄氏度下漂白过夜。
漂白后，在甲醇中洗涤样品两次，室温下洗涤两次。在室温下用20%二甲基亚砜和甲醇洗涤两次，每次。在室温下用80%甲醇洗涤一小时。
在室温下用50%甲醇洗涤一小时。在室温下在PBS中洗涤两次，每次一小时。在PBS 0.2%曲拉子X-100中洗涤一小时，在室温下洗涤两次。
对于清除大脑的免疫染色，首先将样品在1x PBS，0.2%Triton X-100，20%DMSO，0.3摩尔甘氨酸中，在37摄氏度的眼眶振荡器中孵育过夜。在轨道振荡器上阻断1x PBS，0.2%曲拉通X-100，10%DMSO，6%山羊血清，在37摄氏度下停留三天。将样品从猪粘膜中洗涤1x PBS，0.2%吐温-20，每毫升肝素钠盐10微克，在37摄氏度下洗涤两次，每次一小时。
接下来，在1x PBS，0.2%吐温-20，每毫升肝素10微克，5%DMSO，3%山羊血清中含有1至500浓度的兔抗GFP AlexaFluor 488在轨道振荡器上孵育两天。在1x PBS，0.2%吐温-20中用每毫升肝素10微克在37摄氏度下在轨道振荡器上洗涤样品一小时三次，然后每天一次，持续两天。将样品在一毫升50%四氢呋喃和水中孵育过夜。
将样品在一毫升80%THF四氢呋喃和水中孵育一小时。将样品在100%四氢呋喃中孵育两次，持续一小时。用无菌擦拭干燥样品，并在二氯甲烷中孵育，直到它们沉入小瓶底部。
不要孵育超过60分钟。将样品在一毫升二苄基醚中孵育至澄清。将样品在室温下储存在二苄基醚中，直到准备好成像。
为了对免疫染色的脑切片进行成像，通过共聚焦显微镜分析载玻片，其中可以确认多种抗体的共同表达。我们使用徕卡恒星五显微镜和HyD S混合探测器。要对清除的大脑进行成像，请使用具有自动载物台和自动平铺功能的倒置共聚焦显微镜。
首先将一个清除的大脑切片平放在玻璃底皿上，淹没在二苄醚中。在谱系追踪的大脑中，在脉搏追逐期之后，观察到不同大脑区域和各种细胞类型的荧光强度的显着差异。脉络丛中的脉络膜上皮细胞具有厚厚的细胞膜和强烈的绿色荧光信号，表明它们来自Tert阳性细胞，很容易与周围细胞区分开来。
脉络丛基质中的其他较小细胞类型具有较弱的GFP信号。在小脑中，伯格曼胶质细胞表达的GFP水平高于篮细胞，并且单个篮细胞之间也存在GFP表达的变化。对于工厂感觉神经元轴突，嗅球肾小球内腺小球内也表达高水平的GFP嗅觉神经元轴突，填充嗅球肾小球层的嗅球表达高水平的番茄膜，或红色荧光与大多数其他大脑区域相比，即使相同的神经元为GFP阳性，表明一些细胞在谱系追踪过程中似乎更慢地失去mTomato信号。
相反，在脉络丛中GFP阳性细胞表达的m托马托低。在大多数其他大脑区域，番茄信号在大多数细胞类型中以低水平表达，内皮细胞是唯一一些荧光信号足够亮的细胞，可以从脑组织的红色荧光背景中脱颖而出。要记住的最重要的事情是，清除后的大脑中的荧光信号比大多数其他免疫测定的衰减速度更快。
请记住，请尽快在七天内对样品进行成像。接下来，可以使用软件程序进行脑切片或透明大脑的成像，使用GFP信号对标记物进行着色以及我们对萤光的量化。
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概述
本研究利用可诱导的转基因谱系追踪小鼠模型，永久标记干细胞及其后代。研究重点是对成体干细胞在体内的激活、增殖、迁移和分化进行空间和时间分析，为谱系决定和对干预的反应提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 谱系追踪
背景
- 谱系追踪提供了关于干细胞行为的重要信息。
- 对细胞谱系的特异性追踪有助于理解神经退行性疾病。
- 尽管细胞更新，荧光标记保持一致，提高了研究的可靠性。
- 对成体干细胞的关注暗示了对大脑可塑性和衰老的影响。
研究目的
- 研究大脑中成体干细胞的激活、增殖、迁移和分化。
- 更好地理解对干预的反应和谱系决定。
- 为研究神经退行性疾病和代谢对大脑可塑性的影响提供框架。
使用的方法
- 研究采用可诱导的转基因谱系追踪小鼠模型。
- 大脑中的成体干细胞作为生物模型。
- 主要方法包括免疫染色和共聚焦显微镜分析。
- 样本制备包括固定、切片和广泛的洗涤协议。
- 通过特定抗体孵育优化成像，以便对追踪细胞进行稳健的可视化。
主要结果
- 结果显示关于成体干细胞行为和命运的重要发现。
- 增强对神经发生反应和谱系追踪对神经退行性疾病研究的影响的理解。
- 荧光标记显示脑区之间的不同强度，表明多样的干细胞活动。
- 方法通过标记细胞一致的荧光表达验证了追踪效果。
结论
- 本研究展示了转基因谱系追踪在理解成体干细胞功能方面的有效性。
- 洞见促进了对神经退行性疾病和衰老相关研究的未来探索。
- 开发的方法为评估大脑可塑性的细胞动态提供了一个稳健的方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Inducible fluorescent lineage tracing in adult mouse brain stem cells enables precise mapping of stem cell fate, activation, and differentiation, supporting mechanistic de-risking in neurobiology discovery. This approach enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for neurodegenerative and brain plasticity research. The method's specificity and temporal control position it as a reusable capability for portfolio-wide interrogation of adult stem cell dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stem cell activation, proliferation, and lineage commitment in vivo.
- Supports functional target validation by tracking cell fate over time with indelible fluorescent markers.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing multipotency and response to interventions.
- Provides predictive confidence for advancing neurobiological targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain tissue systems for downstream immunofluorescence and imaging workflows.
- Standardizes lineage tracing outputs for reproducible quantification of cell behavior.
- Enables scalable, high-content imaging for screening stem cell responses across brain regions.
- Supports reliable evaluation of compound effects on stem cell fate and differentiation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying neurodegeneration, aging, and brain plasticity.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling long-term tracking of marked cells.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying lineage outcomes post-intervention.
- Provides translational biomarker insights through spatial and temporal mapping of stem cell-derived populations.
Pipeline & Workflow Integration
This inducible lineage tracing system integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, pathway clarification, and translational continuity.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of stem cell activation and differentiation mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of lineage commitment and cell migration.
- Analytics: Enables spatial quantification and fluorescence intensity analysis for comparative studies.
- Translational Research: Connects stem cell fate mapping to disease models and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any rtTA mouse line for broad application across neurobiology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in stem cell research.
- Operational Value: Offers standardized, scalable protocols for reproducible lineage tracing and imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target biology early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurobiological targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic mouse handling and immunofluorescence imaging.
- Needs access to confocal microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of pulse-chase timing and tissue processing protocols.
- Adaptable across brain regions and cell types with appropriate reporter and antibody selection.
- Fluorescent signal stability limits imaging window, necessitating prompt data acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:19
Standard Immunostaining Procedure of Thinly Sliced Brain Sections on Slides
3:36
Alternate Processing of Lineage-Traced Brains by iDISCO Brain Clearing and Whole Mount Imaging
6:53
Imaging of Stained Slides or Cleared Brains
7:27
Results: Lineage Tracing of Adult mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG Mouse Brains
9:04
Conclusion
