Name: 化验粘附和酿酒酵母琼脂入侵 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: 学习使用定性化验方法检测酿酒酵母的粘附和琼脂入侵能力，评估不同突变株的侵袭表型及环境信号对酵母分化的影响。该方法为研究酵母生理学和细胞生物学提供了重要工具。

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我们感谢 Lisa Schneper 和 Katrin Duevel 在开发本实验方法过程中提供的见解。

<ol>
<li>取200 µl处于生长状态的待测菌液，点样于含有相应饥饿条件的合成培养基平板上（例如，SC培养基含2%葡萄糖 versus SC培养基含0.2%葡萄糖）。若各菌液密度差异较大，请调整每200 µl菌液中的细胞数量，使每个点样液滴含有大致相同数量的细胞。</li>
<li>务必记录平板上每个点样位置所对应的菌株。</li>
<li>将平板盖子略微打开，置于室温或30°C环境中，直至液滴完全干燥。</li>
<li>用封口膜和塑料薄膜密封平板（可选），并在30°C下培养3至7天。</li>
<li>记录细胞在平板上的生长情况（通过扫描或拍摄数码照片等方式）。</li>
<li>用高压水（建议使用去离子水）冲洗琼脂表面约1分钟，以洗去细胞，注意避免琼脂层翘起或移位。</li>
<li>将平板轻拍于纸巾上以去除多余水分，并敞开放置使其干燥。</li>
<li>待平板完全干燥后，记录每块平板上的黏附情况（通过扫描或拍摄数码照片）。</li>
<li>戴上手套，用手指在流水下轻轻揉搓约1分钟，将琼脂表面的细胞彻底擦除。</li>
<li>按前述方法再次干燥平板。</li>
<li>若使用解剖显微镜，请在将平板放置于显微镜载物台前先移除针头。</li>
<li>使用10×或40×放大倍数记录侵入性生长情况。对焦时应集中在每个菌落圆圈的中央区域，因为边缘区域过于密集，难以观察单个细胞形态。边缘区域可反映丝状生长的程度，可一并记录以供后续参考。对整个平板进行扫描或拍摄数码照片也可能有所帮助。</li>
</ol>

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<li>Pan, X., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-dependent+protein+kinase+regulates+pseudohyphal+differentiation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).</li>
<li>Roberts, R. L., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+a+single+MAP+kinase+cascade+in+Saccharomyces+cerevisiae+mediate+two+developmental+programs+in+the+same+cell+type%3A+mating+and+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth.</a> Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).</li>
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<li>Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mat+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+requires+nutrient+and+pH+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients.</a> Eukaryot Cell. , (2007).</li>
</ol>

酵母细胞根据营养物质的可利用性和环境条件表现出多种分化模式，包括在饥饿和应激条件下形成孢子、在多种营养胁迫下发生丝状生长，以及发生絮凝。多种酵母，如酿酒酵母（S. cerevisiae）和白色念珠菌（C. albicans），也可存在于由多种微生物形成的生物膜中。尽管丝状生长与侵袭行为之间存在一定的相关性，但目前尚不清楚丝状生长究竟如何导致对表面和组织的侵袭与定植。在自然界以及威胁人类健康的场所（如导管和感染的人体器官）中，均可发现酵母以营养生长形态和丝状形态存在于生物膜中。为了理解酵母用于感染动物以及参与有害或有益生物膜形成的信号通路，我们必须建立易于操作且可靠的检测方法。本文中我们开发了一种检测方法，该方法借鉴了已有的酵母黏附与侵袭检测技术，可定性地评估不同条件下酵母菌株及其突变体的黏附和侵袭表型。本方法避免了将酵母细胞划线接种至琼脂表面的步骤，因为划线操作本身会改变酵母的侵袭性和黏附性。通过显微镜对侵袭细胞进行数字成像，可实现对侵袭和黏附程度的半定量评估。该方法对侵袭性和黏附性细胞的检测可与Sprague实验室开发的单细胞琼脂侵袭实验相辅相成，并可适用于时间序列实验。

<table><tbody><tr><td>Moticam 350</td><td>相机</td><td>Motic</td><td>已停产（新型号：Moticam 352）</td><td>一种价格相对低廉的相机，可连接显微镜目镜，用于为 PC 或 Mac 采集数字图像。</td></tr></tbody></table>

酿酒酵母黏附与琼脂侵袭实验

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

酵母存在于自然形成的生物膜中，许多微生物在其中定植于各种表面。在人工环境中，例如人造物体的表面，生物膜可能降低工业生产效率、破坏结构并威胁人类健康1-3。另一方面，利用生物膜的能力有助于环境修复和可持续能源的生成4-8。

酿酒酵母（S. cerevisiae）能够定植于表面并参与复杂生物膜的形成，这一能力在很长一段时间内未受重视，直到人们重新发现该生物体中由多种信号通路和环境信号触发的分化程序后才引起关注9,10。由于S. cerevisiae作为模式生物在研究信号通路（如Ras-PKA、Kss1 MAPK和Hog1渗透压通路）之间的相互作用与整合方面持续受到关注，使其迅速成为生物膜生物学与信号转导研究的交汇点11-20。在此背景下，酵母细胞分化为长而具有黏附性的假菌丝结构，成为检测多种环境变化下信号转导通路激活情况的便捷表型读出方式。然而，假菌丝形成是一组复杂的表型集合，若将其视为单一简单表型进行检测，容易导致结果误导。过去十年中，一些源自细菌生物膜研究的方法已被成功应用于酵母研究，例如利用MAT形成实验检测菌落在软琼脂上的扩展能力，或采用结晶紫染色法对细胞表面黏附进行定量测定12,21。然而，在用于定性评估酵母在琼脂中黏附与侵袭表型的实验方法上仍存在一些混淆。

本文介绍一种简单且可靠的方法，通过清晰易懂的步骤来分别评估酵母菌株的黏附性和侵袭性，从而将黏附性评估与侵袭性评估区分开来。本方法借鉴自先前的研究10,16，包括在液体培养基中培养细胞，随后将其接种于不同营养条件下以形成较大的菌落斑点，接着用水冲洗以评估黏附性，或彻底擦除琼脂表面的细胞以评估其向琼脂内部的侵袭能力。我们省略了传统的划线接种步骤，因其会影响细胞向琼脂内部的侵袭。总体而言，我们观察到能够侵入琼脂的单倍体菌株均具有黏附性，但并非所有黏附性菌株都能侵入琼脂培养基。本方法可与其他实验联合使用，以深入解析酵母信号转导、分化、群体感应及生物膜形成的各个步骤及其所需条件。

我们描述了一种用于检测酵母黏附性和琼脂侵袭性的定性实验方法，以此作为衡量酵母侵袭性及假菌丝分化的指标。该简单实验可用于评估不同突变体的侵袭表型，以及环境信号和信号通路对酵母分化的效应。

酵母存在于自然形成的生物膜中，许多微生物会在这些生物膜中定植于各种表面。在人工环境中，例如人造物体的表面，……

取200微升你感兴趣的培养物，并将其点样。如果需要，我通常可以在一块培养板上点样最多六个样品，然后将其打开并静置干燥。这是两块培养板。其中一个培养物有霉菌，但没有关系，因为它不会影响我们的实验。另一个培养物处于完全培养基中，还有一个处于低葡萄糖培养基中。因此，我们将观察黏附和侵袭情况，以判断是否存在差异。就这样把培养皿取出来。你可以看到有东西在生长。我要进行清洗。可以看到螺旋钻下方有气泡，这是因为水进入了螺旋钻下方，这是正常的，只要确保螺旋钻不会从平板上滑出即可。因此，尽管有一些细胞脱落，我认为这两种菌株都具有黏附性。这些细胞彼此黏附，并可能进一步黏附在琼脂上。否则会有大量细胞脱落，但实际上它们并未脱落。因此，在记录了细胞黏附情况后，接下来我们将记录细胞侵袭情况。我将轻轻擦拭表面，使尽可能多的细胞脱落。我并没有施加任何压力，而是尝试获取从另一表面脱落的任何物质。您会看到，当您用手指触摸时，会感觉到有凸起的区域，这说明正在尝试获取样本。我正试图将其弄干。我们能观察到这里的差异吗？你无法做到这一点，这很好，因为这是一块完全培养基平板，所以它们不会缺乏任何物质。而这是低葡萄糖平板，它们缺乏葡萄糖。因此你会观察到差异。因此这是一个良好的对照。

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生物学

化验粘附和酿酒酵母琼脂入侵

在本视频中，我们介绍了一种在酵母中表达细菌III型效应子并鉴定效应子诱导的生长抑制表型的方法。此类表型可进一步用于阐明效应子的功能及其作用靶点。...

鉴定酵母中表达细菌III型效应蛋白所诱导的生长抑制表型

研究细菌病原体侵入宿主细胞的通用实验方案，重点关注 金黄色葡萄球菌...

人类细胞被细菌病原体侵入

本实验方案是一种简单的细菌黏附检测方法，通过计数黏附在培养细胞上的细菌菌落形成单位数量来实现。该检测方法稳定可靠，不依赖于所研究的黏附素，目前大多数从事细菌致病机制研究的实验室均采用多种类似变异方法。...

体外细菌黏附哺乳动物上皮细胞实验

本文介绍了一种在芽殖酵母中定义化学-遗传相互作用的经济高效方法。该方法基于酵母分子生物学的基本技术，非常适合对小到中等规模的化合物库及其他培养环境进行机制性研究。...

快速鉴定化学遗传相互作用 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本文介绍了一种基于酵母生长的检测方法，用于确定蛋白质降解所需的遗传条件。同时展示了一种快速提取酵母蛋白质的方法，适用于蛋白质印迹（western...

基于生长的蛋白质降解遗传需求的测定及生化验证方法在Saccharomyces cerevisiae中的应用

本方案描述了一种高通量方法，用于在S.

基于蛋白质遗传的高通量筛选 S. cerevisiae

本研究展示了定量测量细胞膜延伸的实用性和简便性，及其与细胞黏附能力的相关性。作为代表性示例，我们在此表明，Dickkopf 相关蛋白 3（DKK3）可促进肾上腺皮质癌细胞中 Lobopodia 的形成增加以及细胞黏附性的增强 体外.

细胞膜突起的表征及其在癌细胞黏附动力学中作用的研究

通过高通量延时成像技术，对固定化的酵母细胞在微菌落生长过程中的生长表型进行精确测量。同时，可监测其胁迫耐受性、蛋白质表达及蛋白质定位，从而生成整合型数据集，用于研究环境差异、遗传差异以及同基因型细胞间基因表达异质性如何调控细胞生长。...

高通量活体成像微菌落以测量生长与基因表达的异质性

本文介绍了一种用于检测原发性干燥综合征患者口腔Candida感染的实验方案，可用于及时治疗，从而避免相关并发症的发生。...

口腔检查 假丝酵母 原发性干燥综合征患者的感染问题

GFP融合蛋白被广泛用于通过共聚焦显微镜观察细胞器。然而，筛选影响细胞器形态的突变通常需要单独进行诱变，耗时较长。在此，我们展示了一种方法，可将细胞器-GFP标记物同时整合到酵母中近5000个非必需基因中。...

一种高通量全局研究酿酒酵母细胞器形态的方法

学习使用定性化验方法检测酿酒酵母的粘附和琼脂入侵能力，评估不同突变株的侵袭表型及环境信号对酵母分化的影响。该方法为研究酵母生理学和细胞生物学提供了重要工具。

酿酒酵母黏附与琼脂侵袭实验

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