利用解剖学特异性单细胞基因表达方法研究成瘾行为中反奖赏驱动因素

该方案具有高灵敏度，能够在单细胞分辨率下高通量捕获基因表达谱。该技术在单细胞分辨率下同时提供解剖学空间信息和分子特异性。在获取脑组织、筛选单细胞并制备mRNA后，将对照管线液体注入qPCR芯片以进行预启动。

将qPCR芯片插入微流控混合装置中。选择引物脚本并运行程序。程序完成后，取出已预处理的qPCR芯片，用移液器将PCR样本板中六微升（6 µL）反应液加入到qPCR芯片中对应的样本孔内。

现在，将 PCR 检测板中六微升反应液移液至预装的 qPCR 芯片中对应的检测孔内。然后将芯片插入微流控混合装置中。选择“Load Mix”程序并运行。

打开微流控RT-qPCR平台并预热光源。从微流控混合装置上取下qPCR芯片，并撕去芯片底部的保护贴纸。打开微流控RT-qPCR平台，将qPCR芯片装入平台中。

通过点击“启动新运行”来启动数据采集软件。核对芯片条形码和芯片类型，然后点击下一步。

选择芯片运行文件，并浏览数据采集存储的文件位置。然后点击“应用类型”并选择基因表达。对于被动参照，选择 ROX，探针类型选择单探针，探针化学类型选择 EVAGreen。

单击以选择热循环程序，并选择 Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl 文件。下载数据分析软件。

启动软件以分析微流控 RT-qPCR 实验。单击芯片运行，然后打开实验人员创建的 ChipRun.bml 文件。

将弹出一个窗口，显示实验详细信息，包括被动参比、探针和PCR热循环程序。在“Chip Explorer”选项卡下，单击“Sample Plate Setup”并创建一个新的样品板模板。根据实验设计，将样品标签复制并粘贴到软件电子表格中。

输入标准样品的样品名称和所用的 RNA 浓度。现在，通过点击任务菜单中的“map”并选择 SBS96-Left.dsp 来配置样品布局。接着，选择“Detail Views”以在文件中更新这些更改，然后点击“Analyze”。

选择检测板设置并创建新的分析板。选择合适的容器类型和规格。根据实验设计粘贴分析名称，然后点击分析。

在分析设置窗格中，单击用户并设置拟合方式为自动。现在，手动检查96×96芯片中的每个反应。通过观察扩增曲线和熔解曲线，判断每个反应是否符合预期的qPCR模式。

如果扩增曲线或熔解曲线与预期结果不符，则判定该反应失败。质量控制完成后，依次选择文件、点击导出，并将数据集保存为 csv 文件。由于导出的 csv 文件包含通过/失败矩阵以及原始 CT 值矩阵，因此请使用通过/失败矩阵将数据集中所有失败的单元格替换为 NA。下载最新版本的开源 R 软件，然后下载 R Studio 应用程序。

对于中位数中心化，使用 R 软件计算单个样本所有 CT 值的中位数 CT 值，然后从该中位数中减去所有单个 CT 值，以获得负 delta CT 值。对于看家基因标准化，计算每个样本看家基因的平均表达量，并用该值减去单个 CT 值。为生成负 delta delta CT 值，在 R 软件中运行相应代码。

将标准化后的数据集上传至 R 中，使用 scale 函数分析数据，生成标准化后的数据，然后利用 R 的热图函数或独立软件生成热图。为使数据集适用于其他功能分析，需计算每个基因之间的皮尔逊相关系数，随后应用 melt 函数进行数据重塑。将处理后的数据导出并上传至基因相关性网络分析软件中。

神经元表现出NeuN表达升高，小胶质细胞样本则显著表达小胶质细胞标志物Cd34和Cx3xr1。Th+神经元样本中Th的表达水平显著高于Th-神经元和小胶质细胞样本。Th-神经元显著表达Gcg，提示Th-神经元样本富集了以Glp1作为神经递质的神经元。

线性判别分析显示，这三种细胞类型在全部65个基因上的基因表达谱存在差异。通过酒精戒断时间序列，采用热图展示了Glp1富集神经元样本的细胞亚表型。亚表型A高表达炎症基因簇1，在戒断8小时时间点其比例增加，并在戒断32小时达到峰值。

炎症亚表型在撤除176小时后恢复至对照水平。亚表型B高度表达GABA受体基因簇2，在撤除176小时条件下，该基因簇的整体表达受到抑制。将各个样本的基因表达数据合并取平均值，以便在整个时间序列中可视化基因簇的表达情况及其基因转录本的蛋白质定位。

该技术可应用于任何生物系统或组织，以研究细胞对疾病或扰动的响应，即在单细胞分辨率下解析与组织空间结构和解剖架构相关的分子响应。