使用福尔马林固定和石蜡包埋组织样品的质谱成像扩展肿瘤微环境的理解
2022年6月29日
在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动力学的兴趣惊人地增加。该协议详细介绍了质谱成像技术及其染色和成像步骤，允许高度多路复用的空间分析。
这些方案能够使用福尔马林固定和石蜡包埋和新鲜冷冻组织样品进行单细胞分辨率定量、标记共表达和特殊分析，以阐明免疫细胞在癌症中的作用。该技术是一种强大的工具，有助于在单个组织切片上同时表征40个标记物，广泛保留样品中的组织结构。关键步骤是抗体优化和验证。
未能完成该步骤，可能会导致低质量的图像，从而可能损害保留高质量的可重现数据和结果。首先将所有含有抗体的试管以10， 000 x G旋转五分钟，将单个抗体添加到封闭缓冲液中并充分混合。移液时不要打扰抗体管的底部。
通过用100微升封闭缓冲液预润湿0.1微米离心过滤装置来过滤抗体组合。以 10， 000 x G 旋转过滤器两分钟，然后用移液器去除阻塞缓冲液流出物。然后将抗体组合转移到离心柱中，并以10， 000 x G旋转过滤器两分钟。
丢弃离心柱，使用流通物作为过滤的抗体组合。对于抗体染色，通过将每张载玻片侧倾并在任务刮水器上轻轻敲击边缘，从载玻片上去除封闭缓冲液。将载玻片放入水分室中，并向组织中加入100至200微升抗体预混液。
将阳性和阴性对照载玻片添加到染色批次中，并将载玻片在4摄氏度下孵育过夜。要设置仪器，请登录到控制软件，如果仪器处于睡眠模式，请单击唤醒。单击"交换样品"以加载幻灯片，然后单击"继续"以打开门。
将载玻片放入装载槽中，样品朝上，标签在右侧，单击"继续"关闭门。选择项目，然后选择加载示例的幻灯片名称。在幻灯片光学图像窗格上可视化全景图像以进行视野或FOV选择，单击模式菜单并选择二次电子检测器，然后单击成像模式菜单并选择QC 300微米。
单击"点动阶段"以控制 FOV 位置，然后单击箭头以导航并选择 FOV 的位置。单击添加 FOV，将 400 微米 x 400 微米设置为视场大小，并选择精细作为成像模式和 1 毫秒的停留时间，单击确认。创建 FOV 列表后，继续图像焦点并通过将光束移动到不会成像的组织区域来调整柱头。
调整参数，直到获得清晰的中心图像，单击开始运行。采集的图像将自动上传并存储在基于Web的图像管理应用程序中。此处显示的矩阵描述了从探针纯度和氧化物得出的串扰百分比。
这里的蓝色框表示大于或等于 0.5% 串扰，透明框表示小于 0.5% 串扰。对于 Mass 标签，此处显示了对无通道、一个或两个通道或两个以上通道贡献至少 0.5% 串扰的探头。还显示了从无探头、一个或两个探头或两个以上探头接收至少 0.5% 串扰的质量通道。
这里描绘了肺腺癌、非肿瘤性肾脏和扁桃体等不同组织中的代表性染色图像。这里展示了使用该技术染色的扁桃体组织切片的图像，并在过滤和校正之前使用第三方数字图像分析软件程序进行可视化。此处显示了经过过滤和校正步骤后相同条件下同一部分的图像。
该方法生成的图像可以上传到第三方数字图像分析软件，可以进行组织区室化、细胞分割、标记共表达以及邻域分析和远距离分析等综合分析。通过研究可以获得高度多重成像方法。通过构建不同的面板，研究人员可以研究癌症，正常，副肿瘤，炎症和感染性样本。
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概述
本协议概述了一种质谱成像技术，用于分析癌症免疫疗法中的肿瘤微环境动态。它强调了抗体优化对于实现高质量成像和可重复数据的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 癌症免疫疗法
- 肿瘤微环境
- 质谱成像
背景
- 随着癌症免疫疗法的兴起，人们对肿瘤微环境动态的兴趣激增。
- 了解免疫细胞在癌症中的作用对于治疗进展至关重要。
- 质谱成像可以对组织样本进行详细的空间分析。
- 福尔马林固定和石蜡包埋以及新鲜冷冻组织样本都可以使用。
研究目的
- 实现单细胞分辨率定量和标记共表达分析。
- 促进单一组织切片上多个标记的同时表征。
- 在提供高质量成像的同时保留组织结构。
所用方法
- 抗体优化和验证是关键步骤。
- 抗体在离心后与阻断缓冲液混合。
- 在移液时要小心不要扰动抗体管底部。
- 采用质谱成像技术进行分析。
主要结果
- 该技术允许同时表征多达40个标记。
- 高质量图像对于可重复数据至关重要。
- 适当的抗体准备显著影响结果的质量。
- 空间分析提供了对肿瘤微环境的洞察。
结论
- 质谱成像是癌症研究的强大工具。
- 优化的协议提高了成像质量和数据可重复性。
- 了解免疫细胞动态可以导致改进的癌症治疗。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiplexed mass spectrometry imaging of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues enables high-plex spatial profiling of the tumor microenvironment, addressing a critical need in immuno-oncology discovery. This approach supports single-cell resolution and simultaneous quantification of up to 40 markers, providing predictive confidence for target validation and mechanistic de-risking. Integrating spatial and phenotypic data at this scale informs early portfolio triage and translational continuity in cancer R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell roles and spatial relationships within tumor tissues.
- Supports functional target validation by quantifying marker co-expression at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking through comprehensive immune landscape mapping.
- Provides predictive confidence for prioritizing immuno-oncology targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, multiplexed antibody panels for robust tissue-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative outputs through standardized antibody optimization and validation.
- Prepares high-content imaging systems for scalable screening of tissue samples.
- Enables reliable evaluation of compound effects on immune cell phenotypes in situ.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker analysis with disease-relevant tissue models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving tissue architecture.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on comprehensive immune profiling.
- Facilitates translational biomarker discovery for immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform bridges early discovery, lead identification, and translational research by enabling high-plex, spatially resolved immune profiling in preserved tissue samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping immune cell distributions and interactions.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility through validated multiplexed antibody panels.
- Analytics: Generates quantitative, spatially resolved data for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models via preserved tissue architecture and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability for diverse oncology and immunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immuno-oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design, optimization, and validation for high-plex imaging.
- Demands access to secondary ion mass spectrometry imaging instrumentation and gold-coated slide preparation.
- Necessitates cross-team standardization of staining, imaging, and data processing protocols.
- Adaptation across tissue types and disease models may require panel re-optimization.
- Current limitations include reliance on third-party computational pathology software for advanced image analysis.
