使用福尔马林固定和石蜡包埋组织样品的质谱成像扩展肿瘤微环境的理解

这些方案能够使用福尔马林固定和石蜡包埋和新鲜冷冻组织样品进行单细胞分辨率定量、标记共表达和特殊分析，以阐明免疫细胞在癌症中的作用。该技术是一种强大的工具，有助于在单个组织切片上同时表征40个标记物，广泛保留样品中的组织结构。关键步骤是抗体优化和验证。

未能完成该步骤，可能会导致低质量的图像，从而可能损害保留高质量的可重现数据和结果。首先将所有含有抗体的试管以10， 000 x G旋转五分钟，将单个抗体添加到封闭缓冲液中并充分混合。移液时不要打扰抗体管的底部。

通过用100微升封闭缓冲液预润湿0.1微米离心过滤装置来过滤抗体组合。以 10， 000 x G 旋转过滤器两分钟，然后用移液器去除阻塞缓冲液流出物。然后将抗体组合转移到离心柱中，并以10， 000 x G旋转过滤器两分钟。

丢弃离心柱，使用流通物作为过滤的抗体组合。对于抗体染色，通过将每张载玻片侧倾并在任务刮水器上轻轻敲击边缘，从载玻片上去除封闭缓冲液。将载玻片放入水分室中，并向组织中加入100至200微升抗体预混液。

将阳性和阴性对照载玻片添加到染色批次中，并将载玻片在4摄氏度下孵育过夜。要设置仪器，请登录到控制软件，如果仪器处于睡眠模式，请单击唤醒。单击"交换样品"以加载幻灯片，然后单击"继续"以打开门。

将载玻片放入装载槽中，样品朝上，标签在右侧，单击"继续"关闭门。选择项目，然后选择加载示例的幻灯片名称。在幻灯片光学图像窗格上可视化全景图像以进行视野或FOV选择，单击模式菜单并选择二次电子检测器，然后单击成像模式菜单并选择QC 300微米。

单击"点动阶段"以控制 FOV 位置，然后单击箭头以导航并选择 FOV 的位置。单击添加 FOV，将 400 微米 x 400 微米设置为视场大小，并选择精细作为成像模式和 1 毫秒的停留时间，单击确认。创建 FOV 列表后，继续图像焦点并通过将光束移动到不会成像的组织区域来调整柱头。

调整参数，直到获得清晰的中心图像，单击开始运行。采集的图像将自动上传并存储在基于Web的图像管理应用程序中。此处显示的矩阵描述了从探针纯度和氧化物得出的串扰百分比。

这里的蓝色框表示大于或等于 0.5% 串扰，透明框表示小于 0.5% 串扰。对于 Mass 标签，此处显示了对无通道、一个或两个通道或两个以上通道贡献至少 0.5% 串扰的探头。还显示了从无探头、一个或两个探头或两个以上探头接收至少 0.5% 串扰的质量通道。

这里描绘了肺腺癌、非肿瘤性肾脏和扁桃体等不同组织中的代表性染色图像。这里展示了使用该技术染色的扁桃体组织切片的图像，并在过滤和校正之前使用第三方数字图像分析软件程序进行可视化。此处显示了经过过滤和校正步骤后相同条件下同一部分的图像。

该方法生成的图像可以上传到第三方数字图像分析软件，可以进行组织区室化、细胞分割、标记共表达以及邻域分析和远距离分析等综合分析。通过研究可以获得高度多重成像方法。通过构建不同的面板，研究人员可以研究癌症，正常，副肿瘤，炎症和感染性样本。