一种半自动且可重现的基于生物学的体外定量钙沉积的方法

我们的方法允许使用人血管平滑肌细胞测量患者样本的钙化倾向。这将有助于推动对血管钙化疾病的研究，有助于开发新的治疗方法。该技术使用基于荧光的检测，可提高灵敏度并允许随着时间的推移测量样品，从而减少重复需求并提高稳定性。

首先，在37摄氏度的未包被细胞培养瓶上用5%二氧化碳培养人血管平滑肌细胞。在达到70%至90%汇合时分裂细胞。要拆分，请用PBS清洗两次HVSMC。

加入胰蛋白酶，在 37 摄氏度下孵育 2 至 5 分钟。通过添加含有血清的培养基来抑制胰蛋白酶反应。将细胞在350 RCF下离心4分钟，并将沉淀重悬于维持培养基中。

如图所示制备细胞进行分裂后，将细胞计数并接种到48孔板中以开始钙化实验。在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育过夜后，用PBS轻轻洗涤细胞两次，第二次洗涤后小心地吸出所有剩余的PBS。轻轻加入钙化培养基，并在37摄氏度下与5%二氧化碳进一步孵育。

每天用光学显微镜检查，直到钙化发生。要通过成像检测钙化，请打开软件并选择协议和新建。选择程序，然后单击设置温度。

在弹出窗口中将温度设置为 37 摄氏度，将梯度设置为 1 摄氏度，然后单击确定。从下拉菜单中选择板类型。通过单击图像添加映像步骤。选择反转成像仪，然后单击确定。添加三个成像通道，并将其设置为 DAPI、RFP 和明场。

勾选蒙太奇框并设置所需的图像数量和位置。更改重叠以表示每个井的更好覆盖范围。选择要成像的孔。

将打开一个新窗口，可以在其中选择感兴趣的井。单击对焦选项以设置对焦模式。将打开一个新窗口。

单独设置每个通道。通常，孔自动聚焦在DAPI通道上。将所有其他通道设置为从第一个通道开始固定焦距高度，然后单击"确定"进行设置。关闭窗口。

通过单击数据缩减开始预设数据缩减步骤，然后选择图像预处理。通过选择"确定"接受默认设置。通过选择细胞分析设置计数细胞的步骤。从通道下拉菜单中选择 TsF DAPI 图像。

在执行成像后设置更多详细信息。通过在弹出窗口标签步骤中选择统计并选择 TsF RFP 作为输入通道来准备 RFP 信号的分析。勾选上限值和下限值框。

勾选下方列表中的总面积框。在"颜色效果"列中选择"无"。在弹出窗口中，单击 定制 并勾选 背景 框。

按确定。为了获得公平的读数，请按左侧的比率对每个单元格的 RFP 信号进行归一化。在弹出窗口中，选择 RFP 量化总面积。对于下拉菜单中的数据输入 1，然后选择单元格计数作为数据输入 2。

最后，选择一个新的数据集名称并按两次确定。如前所述选择"颜色效果"，然后单击左上角 OK.In，选择"文件"并将文件另存为"协议"文件类型。记录第一次钙化发生后每个时间点的观察结果。

在启动软件中按立即读取，然后单击现有协议。选择在上一步中创建的协议。程序将提示保存实验。

这可以在此阶段完成，也可以稍后通过单击左上角的"保存"按钮手动完成。弹出窗口将要求等待系统加热。打开二氧化碳气体控制器并将其设置为 5%系统达到设定温度后，将出现插入板并读取的提示。

按取消。将板从培养箱运输到安全箱中的成像仪，以避免破损和溢出，并符合当地生物安全法规，以便在发生事故时运输活细胞。将板放入读板器中。

单击程序。在弹出窗口中，选择预设成像步骤。首先调整 DAPI 通道上的焦点和曝光。

取消选中所有通道的自动曝光框，然后单击DAPI通道旁边的显微镜图标。将打开一个新窗口。选择孔以引导焦点。

如果信号已经可见，请先点按"自动对焦"，然后点按"自动曝光"。如果没有，请首先增加曝光并重复自动对焦和自动曝光。可以通过选择曝光下拉菜单手动调整曝光。

检查多个孔的设置，然后保存设置。以相同的方式调整所有通道的曝光。对于 RFP 通道，请确保从中高钙化的井开始。

关闭过程窗口，然后选择顶部任务栏中的绿色"立即阅读"按钮。按照软件指示保存实验。对每个时间点重复此过程。

当系统读取印版时，所有图像都在后台自动处理。通过选择要显示的 TsF DAPI 图像来调整细胞计数设置。双击选择所选井。

将弹出一个新窗口。选择其中一个图像。在弹出窗口中选择分析选项卡。

选择细胞分析细胞计数，然后单击确定。取消选择 RFP 和明场通道。勾选 突出显示对象 框。单击选项以打开菜单。

调整大小和强度阈值以包括所有细胞核，但排除碎片，然后单击确定。单击左下角的应用更改以将设置应用于所有图像。同样，选择钙化量中到高的井端图像。要最好地调整信噪比，请单击"任务"菜单中的分析选项卡。

选择图像统计信息。取消选择 DAPI 和明场通道。单击选项以打开菜单。

勾选阈值异常值框。要设置背景上方信号的非主观阈值，请从任务栏中选择线条工具。将弹出一个窗口。

在信号块上画一条线，同时包括背景区域。调整阈值上限和下限值。仅计算背景上方的信号，并排除是否有碎屑或伪影。

单击确定并应用更改以将设置传输到所有其他孔。确认在其他孔中准确选择了阈值。设置单元格计数和 RFP 阈值后，导出数据。

单击下拉菜单旁边的 Excel 按钮，将数据直接导出到电子表格中。检测并分析从低到高的不同钙化阶段。使用光学显微镜将钙化发现为黑色斑点，这对于初步评估和确定何时开始成像很有用。

为了提高信噪比，分析处理后的RFP图像以量化钙化。数据是通过在同一时间点比较两个或多个条件获得的。将数据归一化为细胞计数作为每个细胞的钙化面积。

数据也被描述为一个时间序列，显示不同时间点的相同条件。重要的是，数据缩减和分析后的结果仍然反映图像转换和阈值化之前可以看到的内容。