用于冷冻电镜结构解析的与DNA修复因子复合的核小体核心颗粒的制备

关于碱基切除修复酶在染色质环境中如何清除DNA损伤的结构信息一直较为缺乏，这构成了我们理解人类疾病病因机制方面的重要空白。本方案的主要优势在于，我们使用常规实验室设备优化了样品制备流程。

这将使领域内的其他生物化学家能够以技术上可行的冷冻电镜研究来补充其生物化学工作。我们的方案还可用于研究其他因子（包括先锋转录因子）如何与核小体相互作用。这一领域同样缺乏结构信息。

在进入冷冻条件之前，优化样品制备是推动我们项目进展的关键，这最好通过底物设计、结合及交联条件下的标准生化实验来完成。首先，在冰上将核小体核心颗粒（NCP）与感兴趣的DNA修复因子在针对该特定复合物优化的缓冲液中孵育15分钟。然后，加入戊二醛至终浓度为0.005%，充分混匀后，在室温下孵育13分钟。

用1摩尔Tris-CL淬灭，使Tris-CL终浓度为20毫摩尔，pH 7.5。然后，将样品浓缩至约50微升，并使用脱盐柱以冷冻缓冲液置换缓冲体系。接着，测定280和260纳米波长下的光密度值，并根据280纳米光密度值将样品进一步浓缩至1.3至3毫克/毫升，必要时进行调整。

制备透析按钮后，将含有样品的按钮置于聚乙二醇床之上，膜面朝下。为进行尺寸排阻层析纯化，先用 60 毫升蒸馏水洗涤并平衡尺寸排阻柱，随后以每分钟 0.4 毫升的流速，用 80 毫升冷冻缓冲液过夜平衡。然后立即分析峰馏分，并浓缩含有组蛋白融合蛋白 MBP-PolBeta-APE1 的馏分。

接下来将由美国国立卫生研究院（NIH）冷冻电镜核心部门的本科后培训学员 Elizabeth Viverette 演示以下操作步骤。首先打开冷冻仪，向加湿器中加入 50 毫升蒸馏水，将腔室温度设为 22 摄氏度，湿度设为 98%。然后将乙烷杯和液氮杯分别放入对应的支架位置。随后，用乙烷杯盖分配器盖住乙烷杯，并小心地将液氮倾倒于其上，同时将液氮杯也注满液氮。

当液氮液面稳定并达到100%，且温度降至零下180摄氏度时，小心打开乙烷阀门，向乙烷杯中注入乙烷，直至透明盖上形成气泡。随后移除乙烷分配器。将两张滤纸放置于 blotting 装置上，并用金属环固定。

进入设置界面，按照文稿中所述设定印迹参数，然后选择 A-Plunge 并点击确定。在主界面中，点击加载镊子，并将载网加载到镊子上，使碳膜面朝向左侧。校准镊子，调节 Z 轴以确保形成稳定的印迹。点击降低腔室，并加入三微升（3 µL）复合物溶液。

然后点击 Blot A-Plunge，使网格旋转至从前侧进行滤纸吸附并迅速投入液氮中冷冻。转移后，将网格置于液氮腔内的网格盒中。当四个网格全部冷冻并放入网格盒后，旋转盖子至中性位置，使所有网格均被盖子覆盖，并拧紧螺丝。

在将样品装入显微镜之前，需在控湿环境中将玻璃化网格置于载网环上，并在液氮条件下用C型夹固定，以避免冰污染。装入显微镜时，将网格插入12槽样品盒中，然后将样品盒推入纳米舱胶囊，并将其装入自动进样器。

然后，将载网从样品盒转移至显微镜载物台上。通过将载物台倾斜10度并同时调节Z轴高度，使图像中的平面位移最小，从而将载物台调整至齐焦高度。到达齐焦高度后，开始成像，以62倍放大倍数对载网拍摄3×3拼接图像，以获得全图。

选择三个不同尺寸的方格，调整至欧几里得高度后，以210倍放大倍数成像。每个方格成像后，分别从其边缘、中心以及边缘与中心之间的位置各选取一个孔洞，然后以2,600倍放大倍数对每个孔洞进行成像。

在36,000倍放大倍数下，以7.1秒曝光时间、采集60帧图像、像素尺寸为1.18、欠焦3微米的条件下，拍摄孔中心的高倍图像。参见筛选的代表性图像。为确定NCP与MBP-PolBeta-APE1形成稳定复合物的比例，进行了电泳迁移率偏移实验，结果显示当MBP-PolBeta-APE1摩尔过量五倍时，NCP出现单一迁移条带。

在较小体积下组装NCP-PolBeta-APE1复合物时发现，样品交联过度，导致形成无法分辨单个复合物的聚集体。然而，将NCP稀释十倍后，聚集体显著减少，颗粒稳定性明显改善。制备凝胶与尺寸排阻方法可联合使用：当NCP中含有大量高分子量聚集体时，先通过制备凝胶提高NCP质量，再通过尺寸排阻法纯化复合物。

结果表明，这两种方法均可独立用于生成稳定的复合物。此外，从两种载网获得的数据显示出几乎相同的二维分类图像和三维结构图，分辨率约为3.2埃。应首先确定核小体核心颗粒（NCP）与DNA修复因子的最佳比例，然后使用戊二醛进行复合物交联，其浓度应至少比用于冷冻的浓度稀释10倍以上。

在获得该复合物的冷冻电镜三维图谱后，还需进一步进行结构精修，以确定DNA修复因子的定位方式，并鉴定出对这些相互作用至关重要的区域。