Name: 制备与DNA修复因子络合的核小体核心颗粒用于冷冻电镜结构测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习制备核小体核心颗粒与DNA修复因子复合物的优化方案，用于冷冻电镜结构测定。该方法采用标准实验室设备，帮助研究人员深入理解染色质动态与DNA修复机制。

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我们感谢美国国家环境卫生科学研究所冷冻电镜核心设施的 Mario Borgnia 博士和北卡罗来纳大学教堂山分校的 Joshua Strauss 博士在冷冻电镜载网制备方面的指导与培训。我们还感谢 Juliana Mello Da Fonseca Rezende 博士在本项目初期阶段提供的技术支持。我们衷心感谢已故的 Samuel H. Wilson 博士及其实验室成员，特别是 Rajendra Prasad 博士和 Joonas Jamsen 博士，他们为基因融合的 APE1-Polβ 复合物的纯化作出了关键贡献并提供了支持。本研究得到了美国国立卫生研究院国家环境卫生科学研究所院内研究计划的资助 [资助编号：Z01ES050158、Z01ES050159 和 K99ES031662-01]。

1. 通过盐梯度透析组装核小体核心颗粒
注意：使用重组组蛋白进行结构研究的核小体核心颗粒的制备方法已被其他研究者详细描述过14,15,16。请参照其他研究者所述的方法进行重组X. laevis histones的纯化和组蛋白八聚体的组装14,15，并按以下所述组装核小体底物。
<ol>
	<li>按指定规模购买三种寡核苷酸（见表1）：UND-197mer、161mer、35mer。
	<ol>
		<li>按文献所述方法对超长寡核苷酸（197mer 和 161mer）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化17。
		<ol>
			<li>在1×退火缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 8.0，50 mM NaCl）中将等摩尔量的寡核苷酸退火。例如，混合以下组分：40 µL 的161-mer [166.7 µM]；8 µL 的35-mer [292.4 µM]；16.8 µL 的197-mer互补链 [408.2 µM]；10 µL 的10×退火缓冲液以及10.9 µL 的dH2O。 
			注意：必须使用温度梯度控制退火反应。温度梯度的具体参数见表2。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行小规模重组实验（按以下示例的1/57比例缩小，最终体积为50 µL），以确定DNA与组蛋白八聚体的比例（典型的DNA:八聚体起始比例包括：1:0.9、1:1.1、1:1.2、1:2；见图2A）；通过小规模重组实验经验性地确定该比例至关重要。
	<ol>
		<li>确定该比例后，进行大规模重组。例如，混合以下组分：32.9 µL 的DNA-197 bp [99.4 µM]；1647.1 µL 的TE（1×）；1120 µL 的5 M NaCl，以及62.3 µL 的野生型组蛋白八聚体 [2.56 µM]。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制透析缓冲液：分别按表3和表4所述配制RBlow 和RBhigh ；按照先前描述的方法14设置重组反应。
	<ol>
		<li>将透析管转移至含有RBhigh的烧杯中，在温和搅拌下透析16小时，或直至2 L的RBlow 已流入废液烧杯中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将透析管转移至含有RB50mM 缓冲液（表5）的1 L烧杯中，使样品透析至少3小时或过夜。
	<ol>
		<li>在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上评估重组效率，确保游离DNA少于10%，且仅出现一条核小体核心颗粒（NCP）条带；将NCP样品储存于4 °C。典型的最佳重组结果可参见图2A（第5泳道）和图2B。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 制备核小体- DNA 修复因子复合物（NCP-DRF）
<ol>
	<li>通过制备型凝胶电泳进行纯化 
	注意：该方法是所描述的两种方法中劳动强度最高的。尽管由于稀释倍数较高，该方法能有效去除高分子量（HMW）组分（见图6A），但如图7A（NCP制备电泳池流出道）所示，可能导致一定程度的解聚并释放DNA。然而，游离DNA含量高达25%仍可适用于冷冻电镜（cryo-EM）研究。由于稀释程度较高，建议仅用此方法纯化核小体核心颗粒（NCP），而非整个复合物。
	<ol>
		<li>在0.2×TBE缓冲液中配制70 mL的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，使用37.5:1（丙烯酰胺:双丙烯酰胺）的聚丙烯酰胺凝胶溶液。倒入外径为28 mm的圆柱形模具中，聚合过夜。</li>
		<li>组装制备型凝胶电泳装置，使用分子量截留值为6–8 kDa的透析膜。以0.25×TBE作为电泳缓冲液，1×洗脱缓冲液（50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 7.5）作为洗脱液。以恒定12 W功率预电泳1小时，并以约1 mL/min的流速通过蠕动泵收集洗脱组分。 
		注意：若无紫外检测器用于识别含DNA的组分，可先用32P标记的NCP进行预实验以确定目标组分。在所有条件保持一致的前提下，后续可无需紫外检测器对未标记NCP进行纯化。</li>
		<li>使用离心过滤装置（分子量截留值30 kDa）将2.8 mL NCP浓缩至250 µL，上样至制备胶中，总电泳时间为6小时。当溴酚蓝指示剂跑出凝胶（约2小时）时，开始收集每份1.5 mL的洗脱组分。 
		注意：约2.5小时后，组分中将不再含有溴酚蓝；DNA（197mer）在约3–3.5小时洗脱，NCP预计在4.5–5小时之间洗脱。</li>
		<li>在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析目标组分。合并含NCP的组分，并立即使用离心过滤装置（分子量截留值30 kDa）浓缩至1 mg/mL。次日，在与目标DNA修复因子（DRF）形成复合物前，通过6%非变性聚丙烯酰胺凝胶评估NCP的质量。</li>
		<li>在冰上孵育NCP与目标DRF 15分钟，使用适用于该特定复合物的优化缓冲液。例如，混合1,000 µL NCP [1.2 µM]；260 µL 5×结合缓冲液（250 mM HEPES，pH 8，500 mM KCl，25 mM MgCl2）；22 µL 3 M KCl；以及18 µL MBP-Pol β-APE1 [338 µM]。 
		注意：复合物形成的温度和离子强度可能需要针对不同复合物进行优化&#160;。</li>
		<li>加入新开启的电子显微镜级戊二醛，使其终浓度为0.005%。因此，向该反应体系中加入26.8 µL&#160;0.25%戊二醛和13.2 µL dH2O。充分混匀后，室温孵育13分钟。</li>
		<li>用1 M Tris-Cl（pH 7.5）淬灭反应，使终浓度为20 mM Tris-Cl（pH 7.5）。浓缩至约50 µL，并使用脱盐柱置换为1×冷冻缓冲液：50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 7.5。 
		警告：戊二醛可引起严重皮肤灼伤和眼损伤，吞咽有害，吸入有毒。操作时须穿戴实验服、护目镜和手套，并在通风橱中进行，同时&#160;佩戴口罩。 
		注意：在较大体积中以较低浓度NCP进行交联反应至关重要。此前尝试即使在相同戊二醛浓度下，但使用浓度高10倍的NCP，仍导致样品聚集及过度交联，SDS-PAGE和尺寸排阻色谱结果均证实了这一点。这些载网仅见团块，无明确颗粒（图5D,E）。</li>
		<li>测定OD280和OD260吸光度，必要时进一步浓缩至1.3–3 mg/mL（基于OD280；通常OD260/OD280比值为1.7–2时可获得良好颗粒）。对于50 µL的小体积样品，为减少样品损失，最佳方法是制作透析按钮：取1.7 mL离心管盖，覆盖分子量截留值为6–8 kDa的透析膜，切除管底，利用管口边缘将透析膜固定在盖子上方。</li>
		<li>将含样品的透析按钮置于聚乙二醇床之上，透析膜朝下（每2分钟检查一次浓缩进度）。当所需浓缩倍数小于或等于2.5倍时，推荐使用此方法，以避免在浓缩器中稀释或损失样品。此步骤完成后，必须立即制备复合物的冷冻电镜载网。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过尺寸排阻色谱进行纯化
	<ol>
		<li>冷冻前一天，先用60 mL dH2O清洗并平衡尺寸排阻色谱柱，随后以0.4 mL/min流速用80 mL冷冻缓冲液（50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 8）过夜平衡。使用重组后直接获得的NCP，按以下比例配制相同复合物，用量增加2.5倍：混合2,500 µL NCP [1.2 µM]；650 µL 5×结合缓冲液；45 µL MBP-Pol β-APE1 [338 µM]；以及55 µL 3 M KCl。</li>
		<li>将混合物在冰上孵育15分钟（不加交联剂）。然后，按照制备型凝胶法所述，加入戊二醛至终浓度0.005%。但在此情况下，将复合物在预先用冷冻缓冲液平衡的离心过滤装置中浓缩至约120 µL。</li>
		<li>立即分析主峰组分，并如前所述，浓缩含有组蛋白和MBP-Pol β-APE1的组分。成功使用尺寸排阻法的结果见图5A,B,C，两种方法的比较结果见图7&#160;&#160;。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 冻存核小体复合物
<ol>
	<li>打开冷冻仪并往加湿器中加入50 mL的dH₂O后2将腔室温度设置为 22 °C 并 HR （湿度）调至98%。将乙烷杯和液氮杯（内含带标签的网格盒）分别放入对应的位置支架中。</li>
	<li>用乙烷盖分配器盖住乙烷杯，并小心地将液氮（LN2）倾倒在其上方，同时填充液氮（LN2）2 液氮杯2当LN2 水平已稳定并达到100%&#160;在温度为 -180 °C 时，小心打开乙烷阀门，向乙烷杯中充入乙烷，直至透明盖上形成气泡。移除乙烷分配器。</li>
	<li>将两张滤纸放置在转印装置上，并用金属环固定。前往设置界面，使用以下参数进行转印：预转印0秒，转印3秒，后转印0秒；选择 A-冷冻载网投入仪 并点击 好的.</li>
	<li>在主屏幕上，点击 加载镊子，并将载网的碳膜面/应用面朝向左侧加载（按之前方法制备）。校准镊子，调节Z轴以确保牢固地印迹。点击 下室 并加入3 µL该复合物（1.3–3 mg/mL；OD280）。点击 印迹/A型浸入式 plunge这将旋转网格，从正面进行印迹并进行骤冷冻结。</li>
	<li>将载网转移至液氮中的载网盒内并储存2 腔室。当四个载网全部冷冻并放入载网盒后，将盖子旋转至中性位置，使所有载网均被盖子覆盖，并拧紧螺丝。载网可保存在液氮中2 直到开始筛查。</li>
</ol>
4. 筛选网格
<ol>
	<li>将样品装入显微镜前，先将玻璃化网格放置在载网环上，并使用C型夹固定。此夹持过程需在液氮（LN2）环境中、于湿度受控的房间内进行，以避免冰污染。</li>
	<li>装入显微镜时，将网格插入12槽样品盒中，将样品盒送入纳米舱（nanocab）胶囊，并装入自动进样器。自动进样器的机械装置将启动后续流程。</li>
	<li>将网格从样品盒转移至显微镜载物台。通过使载物台倾斜10°并同时调节Z轴高度，直至图像中平面位移最小，从而将载物台调整至齐焦高度（eucentric height）。</li>
	<li>达到齐焦高度后，开始成像。首先获取图谱，即对网格拍摄3×3拼接图像，每幅拼接图像的放大倍数为62倍。从中选择三个不同尺寸的方格，确定其齐焦高度后，再以210倍放大倍数进行成像。</li>
	<li>完成一个方格的成像后，在每个方格的边缘、中心及中间区域各选取一个孔洞，并以2600倍放大倍数对每个孔洞进行成像。</li>
	<li>在进行高倍成像前，自动对焦将在成像区域的偏移位置进行。随后，在孔洞中心以36,000倍放大倍数、7.1秒曝光时间、60帧、1.18像素尺寸和3 µm离焦量采集高倍图像。代表性筛选图像见图5、图6和&#160;图7。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

针对纯化DNA修复因子的具体方案将取决于目标酶的特性。然而，有一些通用建议可供参考，包括采用重组方法进行蛋白质的表达与纯化18；如果目标蛋白质过小（&#60;50 kDa），在近期之前通过冷冻电镜（cryo-EM）进行结构解析几乎是不可能的，但随着融合系统19、纳米抗体结合支架20以及成像策略优化技术的发展21，这一限制已逐步被克服。
在初期阶段获得质量较差的载网是很常见的现象。最初在未使用任何交联剂的情况下，采用醋酸铀酰对碳膜铜网进行负染色，以评估核小体核心颗粒（NCP）的均一性和稳定性，结果显示NCP分散良好、形态稳定，且聚集极少。然而，当该样品以高出20倍的浓度进行冷冻电镜载网玻璃化处理时，却未检测到任何颗粒。保持NCP不发生解聚或聚集的样品优化成为最大的技术难点。此外，文中分别描述了两种制备方法，但二者并非互斥，可依次连续使用，即首先纯化NCP 通过 制备凝胶，与修复...

真核生物DNA通过组蛋白进行组织和压缩，形成染色质。核小体核心颗粒（NCP）是染色质的基本重复单位，可调控DNA修复、转录和复制过程中DNA结合蛋白对DNA的可及性1。尽管NCP的首个X射线晶体结构早在二十多年前即已解析2，此后又陆续发表了大量NCP的结构3,4,5,6，但核小体底物中的DNA修复机制至今尚未明确。要揭示染色质中DNA修复的分子细节，需要对参与其中的组分进行结构表征，以理解NCP的局部结构特征如何调控DNA修复活性。这一点在碱基切除修复（BER）背景下尤为重要，因为针对BER酶的生化研究表明，核小体中的DNA修复机制具有独特性，其机制依赖于酶特异性的催化结构需求以及DNA损伤在核小体内的结构位置7,8,9,10,11,12,13。鉴于BER是一种重要的DNA修复过程，填补这些空白具有重要意义，同时也可为开展其他技术上可行的、涉及相关核小体复合物的结构研究奠定基础。
冷冻电镜技术（Cryo-EM）正迅速成为解析难以大量制备均一样品的复合物三维（3D）结构的首选方法。尽管核小体核心颗粒与DNA修复因子复合物（NCP-DRF）的设计与纯化可能需要针对性的优化，但本文所述的生成并冷冻稳定NCP-DRF复合物的实验流程，详细说明了如何优化样品及冷冻电镜载网的制备。如图1所示的两个工作流程（非互斥）以及本方案中的具体细节，指出了关键步骤并提供了优化这些步骤的策略。本研究将推动染色质与DNA修复领域的发展，使生化实验与结构研究相互补充在技术上成为可能，从而更深入地理解核小体DNA修复的分子机制。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES；pH 7.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Bio-rad</td><td>1610733</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>043398.K2</td><td></td></tr><tr><td>491 制样电泳槽</td><td>Bio-rad</td><td>1702926</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 离心过滤器（分子量截留值 30 kDa）</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z717185</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 离心过滤器（分子量截留值 30 kDa）</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>AutoGrid 镊子</td><td>Ted Pella</td><td>47000-600</td><td></td></tr><tr><td>自动冷冻制样仪</td><td>Leica</td><td>Leica EM GP</td><td></td></tr><tr><td>C-1000 touch 梯度PCR仪</td><td>Bio-rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>C型夹片和夹环</td><td>Thermo Fisher</td><td>6640--6640</td><td></td></tr><tr><td>切片站</td><td>SubAngostrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>透析膜（分子量截留值 6–8 kDa）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15370752</td><td></td></tr><tr><td>金刚石镊子</td><td>Techni-Pro</td><td>758TW0010</td><td></td></tr><tr><td>双链DNA（dsDNA）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FEI Titan Krios 透射电镜</td><td>Thermo Fisher</td><td>KRIOSG4TEM</td><td></td></tr><tr><td>FPLC 纯化系统</td><td>AKTA Pure</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>组分收集器 Model 2110</td><td>Bio-rad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>辉光放电清洗系统</td><td>Ted Pella</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>载网盒</td><td>SubAngostrom</td><td>PB-E</td><td></td></tr><tr><td>载网储存配件包</td><td>SubAngostrom</td><td>GSAX</td><td></td></tr><tr><td>液态乙烷</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 双头蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>F155008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 核酸蛋白测定仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex 16% Tricine 1.0 mm Mini Protein 凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6695BOX</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 移液器</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（VWR）低吸附型</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺凝胶溶液（37.5:1）</td><td>Bio-rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG）</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4338-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pur-A-lyzer Maxi 3500 透析装置</td><td>Millipore Sigma</td><td>PURX35050</td><td></td></tr><tr><td>纯化的重组DNA修复因子</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>R 1.2/1.3 Cu 300 目铜载网</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>重组组蛋白八聚体</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>弹簧式夹网工具</td><td>SubAngostrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 凝胶过滤柱</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Thermo Fisher</td><td>Talos Arctica 200 kV</td><td></td></tr><tr><td>FEI Vitrobot Mark IV-I 用镊子组件</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 甘油</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot 自动冷冻制样仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mark IV System</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸（55 mm）</td><td>Cytiva</td><td>1005-055</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>440700500</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Micro 脱盐离心柱，7K 分子量截留值，75 &amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89877</td><td></td></tr></tbody></table>

用于冷冻电镜结构解析的与dna修复因子复合的核小体核心颗粒的制备

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

在染色质背景下，DNA修复机制尚不明确。利用核小体核心颗粒（染色质的基本重复单位）开展的生化研究表明，大多数DNA修复酶对核小体DNA中损伤的清除速率低于游离DNA。目前尚未阐明碱基切除修复（BER）酶如何识别并清除核小体中DNA损伤的分子细节。然而，针对核小体底物的生化BER数据表明，核小体对修复过程构成的结构障碍因DNA损伤的位置及所涉酶的不同而异。这提示，这些酶在游离DNA与核小体中清除DNA损伤所采用的机制可能存在差异。鉴于基因组DNA的大部分均组装为核小体，因此亟需获得这些复合物的结构信息。迄今为止，科学界仍缺乏可用于开展此类复合物结构研究的详细且技术上可行的实验方案。本文中，我们提供了两种方法，用于制备两种基因融合的BER酶（DNA聚合酶β与AP内切酶1）结合于核小体DNA入口-出口附近单核苷酸缺口处的复合物，以进行冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构解析。这两种样品制备方法均适用于制备高质量的冷冻电镜载网。 通过 plunge freezing。本方案可作为制备含有不同BER因子、先锋转录因子以及染色质修饰酶的其他核小体复合物的起始参考。

正确组装的核小体核心颗粒（NCP）（图2）被用于与MBP-Polβ-APE1重组融合蛋白形成复合物（图3）。为了确定形成稳定复合物所需的NCP与MBP-Polβ-APE1的摩尔比例，我们进行了电泳迁移率变动分析（EMSA）（图4），结果显示当MBP-Polβ-APE1过量5倍时，NCP出现单一迁移条带。在优化该复合物制备条件的过程中，使用戊二醛进行交联至关重要，可防止NCP解体。最初，复合物（NCP-Polβ-APE1）的组装在较小体积中进行，NCP浓度约为10 µM，戊二醛终浓度为0.005%。在此条件下，样品过度交联（图5D-E），导致形成聚集体，无法分辨出独立的复合物颗粒。当NCP稀释约10倍（1.2 µM NCP）进行交联时，聚集显著减少，颗粒稳定性明显提高（图5A<...

本方案详细阐述了使用两种样品制备方法制备用于冷冻电镜载网的核小体复合物的步骤。

用于冷冻电镜结构解析的与DNA修复因子复合的核小体核心颗粒的制备

在染色质背景下，DNA修复机制尚不明确。利用核小体核心颗粒（染色质的基本重复单位）开展的生化研究……

关于碱基切除修复酶在染色质环境中如何清除DNA损伤的结构信息一直较为缺乏，这构成了我们理解人类疾病病因机制方面的重要空白。本方案的主要优势在于，我们使用常规实验室设备优化了样品制备流程。这将使领域内的其他生物化学家能够以技术上可行的冷冻电镜研究来补充其生物化学工作。我们的方案还可用于研究其他因子（包括先锋转录因子）如何与核小体相互作用。这一领域同样缺乏结构信息。在进入冷冻条件之前，优化样品制备是推动我们项目进展的关键，这最好通过底物设计、结合及交联条件下的标准生化实验来完成。首先，在冰上将核小体核心颗粒（NCP）与感兴趣的DNA修复因子在针对该特定复合物优化的缓冲液中孵育15分钟。然后，加入戊二醛至终浓度为0.005%，充分混匀后，在室温下孵育13分钟。用1摩尔Tris-CL淬灭，使Tris-CL终浓度为20毫摩尔，pH 7.5。然后，将样品浓缩至约50微升，并使用脱盐柱以冷冻缓冲液置换缓冲体系。接着，测定280和260纳米波长下的光密度值，并根据280纳米光密度值将样品进一步浓缩至1.3至3毫克/毫升，必要时进行调整。制备透析按钮后，将含有样品的按钮置于聚乙二醇床之上，膜面朝下。为进行尺寸排阻层析纯化，先用 60 毫升蒸馏水洗涤并平衡尺寸排阻柱，随后以每分钟 0.4 毫升的流速，用 80 毫升冷冻缓冲液过夜平衡。然后立即分析峰馏分，并浓缩含有组蛋白融合蛋白 MBP-PolBeta-APE1 的馏分。接下来将由美国国立卫生研究院（NIH）冷冻电镜核心部门的本科后培训学员 Elizabeth Viverette 演示以下操作步骤。首先打开冷冻仪，向加湿器中加入 50 毫升蒸馏水，将腔室温度设为 22 摄氏度，湿度设为 98%。然后将乙烷杯和液氮杯分别放入对应的支架位置。随后，用乙烷杯盖分配器盖住乙烷杯，并小心地将液氮倾倒于其上，同时将液氮杯也注满液氮。当液氮液面稳定并达到100%，且温度降至零下180摄氏度时，小心打开乙烷阀门，向乙烷杯中注入乙烷，直至透明盖上形成气泡。随后移除乙烷分配器。将两张滤纸放置于 blotting 装置上，并用金属环固定。进入设置界面，按照文稿中所述设定印迹参数，然后选择 A-Plunge 并点击确定。在主界面中，点击加载镊子，并将载网加载到镊子上，使碳膜面朝向左侧。校准镊子，调节 Z 轴以确保形成稳定的印迹。点击降低腔室，并加入三微升（3 µL）复合物溶液。然后点击 Blot A-Plunge，使网格旋转至从前侧进行滤纸吸附并迅速投入液氮中冷冻。转移后，将网格置于液氮腔内的网格盒中。当四个网格全部冷冻并放入网格盒后，旋转盖子至中性位置，使所有网格均被盖子覆盖，并拧紧螺丝。在将样品装入显微镜之前，需在控湿环境中将玻璃化网格置于载网环上，并在液氮条件下用C型夹固定，以避免冰污染。装入显微镜时，将网格插入12槽样品盒中，然后将样品盒推入纳米舱胶囊，并将其装入自动进样器。然后，将载网从样品盒转移至显微镜载物台上。通过将载物台倾斜10度并同时调节Z轴高度，使图像中的平面位移最小，从而将载物台调整至齐焦高度。到达齐焦高度后，开始成像，以62倍放大倍数对载网拍摄3×3拼接图像，以获得全图。选择三个不同尺寸的方格，调整至欧几里得高度后，以210倍放大倍数成像。每个方格成像后，分别从其边缘、中心以及边缘与中心之间的位置各选取一个孔洞，然后以2,600倍放大倍数对每个孔洞进行成像。在36,000倍放大倍数下，以7.1秒曝光时间、采集60帧图像、像素尺寸为1.18、欠焦3微米的条件下，拍摄孔中心的高倍图像。参见筛选的代表性图像。为确定NCP与MBP-PolBeta-APE1形成稳定复合物的比例，进行了电泳迁移率偏移实验，结果显示当MBP-PolBeta-APE1摩尔过量五倍时，NCP出现单一迁移条带。在较小体积下组装NCP-PolBeta-APE1复合物时发现，样品交联过度，导致形成无法分辨单个复合物的聚集体。然而，将NCP稀释十倍后，聚集体显著减少，颗粒稳定性明显改善。制备凝胶与尺寸排阻方法可联合使用：当NCP中含有大量高分子量聚集体时，先通过制备凝胶提高NCP质量，再通过尺寸排阻法纯化复合物。结果表明，这两种方法均可独立用于生成稳定的复合物。此外，从两种载网获得的数据显示出几乎相同的二维分类图像和三维结构图，分辨率约为3.2埃。应首先确定核小体核心颗粒（NCP）与DNA修复因子的最佳比例，然后使用戊二醛进行复合物交联，其浓度应至少比用于冷冻的浓度稀释10倍以上。在获得该复合物的冷冻电镜三维图谱后，还需进一步进行结构精修，以确定DNA修复因子的定位方式，并鉴定出对这些相互作用至关重要的区域。

preparation-nucleosome-core-particles-complexed-with-dna-repair

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

制备与DNA修复因子络合的核小体核心颗粒用于冷冻电镜结构测定

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利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列

本文介绍了冷冻电子显微镜技术，该方法可用于获得大分子在接近天然状态下的高质量显微图像。该技术所获得的图像适用于后续基于单颗粒分析方法的计算机处理，以实现大分子的三维结构重建。...

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miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

本方案描述了如何可视化蓝细菌中瞬时的DNA压缩过程。采用同步培养、荧光显微镜监测、快速冷冻以及高压冷冻电子断层扫描技术。本文介绍了这些方法的操作流程，并讨论了其未来的应用与发展方向。...

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学习制备核小体核心颗粒与DNA修复因子复合物的优化方案，用于冷冻电镜结构测定。该方法采用标准实验室设备，帮助研究人员深入理解染色质动态与DNA修复机制。

用于冷冻电镜结构解析的与DNA修复因子复合的核小体核心颗粒的制备

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