Name: 实时和重复测量电活动改变的个体活斑马鱼的骨骼肌生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 学习利用共聚焦显微镜实时测量活体斑马鱼骨骼肌生长的方法。该技术结合电刺激与四维切片法，可精确追踪肌肉发育动态，为研究肌肉萎缩疾病的发病机制及开发新治疗策略提供重要实验基础。

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作者们衷心感谢Hughes实验室成员Seetharamaiah Attili博士、Jana Koth博士、Fernanda Bajanca博士、Victoria C. Williams博士、Yaniv Hinits博士、Giorgia Bergamin博士和Vladimir Snetkov博士在开发本描述方案中所付出的努力，同时感谢Henry Roehl、Christina Hammond、David Langenau和Peter Currie分享质粒或斑马鱼品系。SMH是英国医学研究理事会（MRC）科学家，获得项目资助号G1001029、MR/N021231/1和MR/W001381/1的支持。MA曾持有由伦敦国王学院提供的MRC博士培训项目博士生奖学金&#160;。本研究还受益于学者、导师兼友人David M. Robinson在三角学方面的贡献。

所述所有研究均按照英国动物科学程序法（1986年）及其后续修订的规定，在符合机构指南并获得英国英国内政部适当许可的情况下进行。胚胎/幼虫应在完成原肠胚形成前于28.5 °C下培养，之后可置于22–31 °C环境中以调控发育速度。鱼类可在室温下进行扫描或刺激处理。
1. 麻醉斑马鱼幼体
<ol>
	<li>将合适的荧光报告基因成年鱼（如 Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg 参考文献36&#160;或 Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg 参考文献37）进行杂交，并按文献所述方法收集胚胎38。</li>
	<li>在选定时间点（例如受精后2天（dpf）），使用含Tricaine的鱼类培养液（鱼用清水或E3培养基）短暂麻醉胚胎，并在荧光显微镜（如Leica MZ16F）下筛选表达EGFP或mCherry的胚胎。若胚胎数量较多，应选择荧光信号最强的个体。筛选后立即将胚胎放回正常的鱼类培养液中。</li>
</ol>
2. 共聚焦扫描用鱼类样本的制备
<ol>
	<li>打开共聚焦激光扫描系统及激光器，使系统稳定30-60分钟。 
	注意：此处我们使用了配备20倍/1.0数值孔径水浸物镜的蔡司LSM 5 Exciter显微镜，并采用直立式材料支架（可增加工作距离）。</li>
	<li>配制1%低熔点琼脂糖（LMA），置于37 °C加热块中，保存于1.5 mL离心管中以供重复使用。为避免热冲击，将LMA分装液从加热块中取出，静置冷却&#160;在应用于幼虫前，需冷却至略高于凝固点，并先在皮肤上测试温度以判断是否适宜，类似于评估婴儿配方奶的温度。</li>
	<li>选择待固定的鱼类，并依次用Tricaine（0.6 mM溶于鱼类培养液）对每条鱼进行短暂麻醉。</li>
	<li>取一个直径为60 mm且已涂覆1%琼脂糖层的培养皿，置于解剖显微镜载物台上。</li>
	<li>用1 mL塑料巴氏吸管将幼虫转移至60 mm的包被培养皿中，并尽可能吸除转移的培养基。随后，仍使用该巴氏吸管向幼鱼滴加5至10滴LMA，在LMA凝固前，用镊子（或火焰抛光的细玻璃针）迅速将其水平置于侧卧位置。&#160;为获得最佳成像效果，建议将幼虫置于LMA上表面附近。
	<ol>
		<li>或者，使用1 mL塑料巴斯德吸管，尽量减少鱼培养基的量，收集幼虫并将其转移至已冷却的LMA分装液中。让幼虫下沉5秒，使其完全被LMA包围。随后取出幼虫，将其连同少量LMA转移至涂有琼脂糖的培养皿中。迅速按照上述方法调整并定位幼虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将幼虫调整至其前后轴和背腹轴均在水平方向10°范围内（参见下文第4.6点中的注释“关于误差及其校正”）。
	<ol>
		<li>如果幼虫未在琼脂糖液滴表面附近正确水平固定，请将其移除并重新包埋。可使用微量1 mL塑料巴氏吸管轻柔抽吸回收幼虫，并用Kimwipe纸巾轻轻去除液态琼脂糖（LMA）。固定操作确实需要练习才能熟练掌握；在正式实验前，建议先花一个下午时间练习包埋一些非关键性的幼虫。 
		&#8203;注意：关于显微镜设计：许多实验室使用倒置共聚焦显微镜通过盖玻片进行成像。我们发现，在倒置显微镜下，将琼脂糖固定的斑马鱼反复嵌入并取出盖玻片下方进行观察时，会导致在多次扫描过程中样本损失显著高于本方案所描述的直立显微镜操作。因此，若有条件，建议使用直立显微镜系统。然而，获得高质量数据的关键在于物镜和扫描参数的正确选择与使用，该主题内容广泛，此处不作详述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 共聚焦扫描
<ol>
	<li>当低熔点琼脂糖（LMA）凝固后，向培养皿中加入约 10 mL 含 Tricaine 的鱼类培养液。若计划采集共聚焦图像堆栈，请让固定好的鱼样静置至少 10 分钟后再进行扫描，因为琼脂糖会发生一定程度的膨胀。</li>
	<li>将样品皿放置于共聚焦系统的载物台上，定位幼鱼并聚焦至目标体节。可选择体节 17，因其靠近肛门开口，易于定位且成像方便。可通过从前向后计数体节来确认位置。 
	注意：第一个体节位于耳部后方并已融合，无前缘，但可明显观察到具有横纹肌纤维。</li>
	<li>设置采集 Z-堆栈的参数，定义顶部（即刚好在皮肤上方）和底部（即刚好在脊索下方），以确保包含整个体节，即使鱼体在固定时略有倾斜。可根据需要同时采集左右两侧图像。此设置可确保所有快速 YZ 扫描均覆盖目标区域。</li>
	<li>按以下步骤采集 XY 图像。根据共聚焦软件的功能，调整扫描区域相对于鱼体的方向。将鱼体摆放至前后轴与成像的 X 轴平行，背腹轴与 Y 轴平行，并使体节 17 位于视野中央，如 补充文件 1 所示。聚焦于最上层肌节的中间层面，使整个上轴肌和下轴肌半体节以及垂直和水平肌隔均清晰可见，采集高分辨率的 XY 图像。请务必为图像命名并保存。</li>
	<li>按以下步骤采集一个或多个 YZ 图像。在代表性结果（下文）中，比较了双切片法和四切片法的准确性。在双切片法中，采用单次 XY 和 YZ 扫描；在四切片法中，对三次 YZ 扫描结果取平均值，以更准确地估算肌节体积。若共聚焦软件需要，可重新调整扫描区域方向。
	<ol>
		<li>在选定的体节处，沿前后轴选定一个位置，画一条精确从背侧到腹侧且垂直于鱼体前后轴的直线，执行 Z-堆栈线扫描。</li>
		<li>沿选定肌节的前后方向，在三个确定的位置重复 YZ 线扫描，以获取 YZa、YZm 和 YZp。代表性结果见 图 2A。请将这些图像与对应的 XY 图像一并命名并保存。 
		&#8203;注意：关于 YZ 切面的选择：肌节呈 V 形，其形态在发育过程中会发生变化。为利用四切片法最准确地评估第 17 肌节的体积，应将 YZa 置于肌节的前尖端，YZp 置于肌节背侧和腹侧极端的后尖端，YZm 置于 YZa 与 YZp 的中点。假设肌节均匀 taper（逐渐变细），则每个 YZ 截面测量值的平均值即可代表整个肌节的体积。对于双切片法，单次 YZ 扫描应置于水平肌隔的后端，该位置大致对应目标肌节（如 YZm）的前后中心。或者，也可在水平肌隔的前、中、后三个位置采集一组 YZ 截面，但如下文所示，由于肌节 taper 的存在，该方法会分别略微高估或低估肌节体积（分别对应头端和尾端体节）。从根本上讲，不同鱼体及实验间 YZ 切面位置的一致性是保证可重复性的关键。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分析
<ol>
	<li>由于肌节沿鱼体大小呈梯度变化，在比较研究中应始终使用相同的体节进行操作。</li>
	<li>为测量并计算肌节体积，可使用共聚焦显微镜软件（例如 Zeiss ZEN 显微镜软件生成的 .lsm 文件）或开源通用图像分析软件（如 Fiji/ImageJ）。 
	注意：若转换文件格式，需确保 Z 步长被正确传递，因为并非所有软件都能正确读取专有的共聚焦文件格式。例如，要将 ZEN 线扫描图像导入 Fiji，应首先使用“文件/导出”命令，以全分辨率图像窗口 - 单平面格式导出为 .tif 文件，然后再导入 Fiji。尽管 YZ 扫描的 .lsm 文件可直接在 Fiji 中打开，但由于 Z 步长被错误解析，所得 YZ 图像通常在 Z 维度上被压缩。</li>
	<li>使用 ZEN 进行分析
	<ol>
		<li>首先，在 ZEN 中打开 XY 扫描的 .lsm 文件。转到图形选项卡，选择“直线”工具。在体节 17 的两个垂直肌隔之间绘制一条线，贯穿整个肌节长度（与鱼体的前后轴平行）。勾选 M 框以显示测量值（长度 = 89.71 µm，参见补充文件 2）。</li>
		<li>打开 YZ 扫描的 .lsm 文件。在图形选项卡下，选择闭合贝塞尔曲线工具。沿肌节边缘绘制轮廓。完成后，勾选 M 框，即可显示测量值（面积 = 11980.01 µm2，参见补充文件 3）。</li>
		<li>将每次测量的数值手动记录在电子表格中。根据需要对横截面积（CSA）测量值取平均。肌节体积可通过公式计算：体积 = 肌节长度 × CSA，即 89.71 µm × 11980.01 µm2 = 1.075 × 106 µm3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Fiji/ImageJ 进行分析
	<ol>
		<li>在 Fiji/ImageJ 中打开 XY 扫描的 .lsm 文件。检查直接在 Fiji 中打开的 XY 图像是否已正确进行尺度校准，应确保其正确无误。</li>
		<li>从工具图标中选择直线工具。按照步骤 4.3.1 所述，在体节 17 的长度方向上绘制一条直线。通过进入分析菜单并选择设置测量值…来设定测量参数，勾选面积和显示标签选项。测量时只需按下快捷键M，或进入分析菜单并选择测量。弹出窗口将列出所有测量值（例如，长度 = 90.023 µm；参见补充文件 4）。结果可保存为 .csv 格式，并在 Microsoft Excel 或类似软件中打开以进行后续分析。</li>
		<li>为在 YZ 图像上测量横截面积（CSA），请按照步骤 4.2 所述，以 .tif 格式打开 YZ 图像。</li>
		<li>对 YZ 的 .tif 图像进行校准，因为导出时图像未校准。校准参数可在 ZEN 中通过查看所选图像的信息获得：记录缩放 X（0.489 µm）和缩放 Z 值（0.890 µm；参见补充文件 5）。接着，在 Fiji 中打开图像后，进入图像菜单并选择属性…。在像素宽度和像素高度中输入0.489 µm，在体素深度中输入0.890 µm。若需对多个 YZ 图像重复测量，可勾选全局框以统一应用校准（参见补充文件 6）。 
		注意：&#160;确保所有 YZ 图像均使用相同的扫描参数获取；若需新的校准参数集，请重启 Fiji/ImageJ 或修改校准值。</li>
		<li>为测量已校准的 YZ 图像的横截面积（CSA），从工具图标中选择多边形选区工具。沿体节边缘绘制轮廓，然后按下M键以显示测量值（面积 = 11980.395 µm2；参见补充文件 7）。肌节体积可通过公式计算：体积 = 肌节长度 × CSA，即 90.023 µm × 11980.395 µm2 = 1.079 × 106 µm3。</li>
		<li>在其他 XY 和 YZ 图像上重复测量。建议在同一系列实验中使用同一软件以保证一致性。不同软件得出的体积估算值相近但不完全相同，这是由于绘图工具不同所致，例如 ZEN 结果为 1.074 × 106 µm3，Fiji/ImageJ 结果为 1.079 × 106 µm3。两个时间点之间（例如 3 至 4 dpf）肌节的增长率可计算为：(Volume4 dpf - Volume3 dpf) / Volume3 dpf × 100%。 
		注意：关于误差及其校正。在样品制备过程中，应尽量使鱼体的矢状面（即前后轴和背腹轴）接近水平方向，以避免偏航（yaw）和滚动（roll）。这是因为若鱼体存在偏航（绕背腹轴旋转），导致前后方向倾斜安装，则从 XY 扫描测得的肌节长度 L 和从 YZ 扫描测得的横截面积 CSA 均会被高估。尽管如第 3 节所述，安装过程中的俯仰（pitch）或滚动（roll）在扫描后不会影响测量结果，但背腹方向的旋转（roll）会降低图像质量。简单的三角学计算表明，偏航角达 10° 时，体积测量误差可达 3%，因为测得的 L 和 CSA 均按 (cosq)-1 的比例增加，其中 q 为偏离前后水平方向的角度（即偏航角）。偏航 15° 和 20° 分别会导致体积被高估 7% 和 13%。 
		由于脊索呈圆柱形，可通过在 YZ 扫描中包含完整的脊索，利用其主轴和次轴的方向与大小来计算倾斜角度和程度，从而校正测得的 L 和 CSA，以提高准确性。校正后的 CSA = 测得的 CSA × 脊索短轴 / 脊索长轴。校正后的 L = 测得的 L × 脊索短轴 / 显微镜 Z 方向上的脊索轴长。 
		进一步考虑可对 L 进行额外校正。随着肌节生长，其在冠状面（垂直于背腹轴）上发生偏斜，使得内侧肌节略位于外侧肌节前方。从背侧观察，左右两侧的垂直肌隔形成一个向前方张开的宽“V”形。若偏航角较小，此形态不影响 L 的测量。但若偏航角较大，三角学校正将变得复杂，更优的方法是通过估算前后垂直肌隔与水平肌隔交点处脊索上的两个点的 XYZ 坐标，直接测量真实长度（True L）。利用简单三角学，可根据这些坐标计算真实长度：L = SQRT[(X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2 + (Z2 - Z1)2]。该方法的局限性在于：a) 点的选择可能因操作者而异；b) 所选点的视觉记录无法保留。此问题不影响 CSA 的校正。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 可选方法：去除并重新引入肌肉电活动
<ol>
	<li>构建一个刺激室。
	<ol>
		<li>取一个 6 x 35 mm 的孔板，制作两个小开口（&#60;直径5 mm，每孔两侧各一个，间距1 cm（见&#160;图1使用窄型烙铁。 
		注意：请小心操作热的电烙铁，必要时在通风橱中工作，以避免吸入蒸气。</li>
		<li>将一对银丝或铂丝（长约20 cm）穿过每个孔的开口（参见&#160;图1）。可在开口附近使用可重复使用的粘合材料（例如 BluTack）固定导线，并确保导线之间保持 1 cm 的间距（参见&#160;图1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在受精后3天（3 dpf）将鱼分为三种处理组：鱼培养基对照组、非活性组和非活性+刺激组。
	<ol>
		<li>对于非活动组和非活动+刺激组，在受精后72小时（hpf）麻醉幼虫&#160;用 Tricaine (0.6 mM) 处理。 
		注意：参见下文参考文献38将三卡因（tricaine）储备液的冷冻分装样品解冻后，在加入鱼类前将其稀释（每毫升鱼培养液中加入40 µL，终浓度为0.6 mM）。切勿将三卡因直接加入含有鱼类的水中，以免部分鱼类接触过高剂量。三卡因储备液应在一个月内使用，且不得再次冷冻。</li>
		<li>对于对照组鱼类，保持其未麻醉状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在三卡因暴露开始后选定时间点（例如，80 hpf），准备“无活性+刺激”组以进行刺激。
	<ol>
		<li>配制 60 mL 2% 琼脂糖（将 1.2 g 琼脂糖粉末溶于 60 mL 鱼培养基中），用微波炉充分融化后冷却，加入三卡因，每孔加入 4 mL 至刺激室的每个孔中（图1).</li>
		<li>立即将自制的4孔梳子插入电极之间（通过裁剪适当尺寸的塑料材料（如聚丙烯）并使用超级胶水粘合制成；参见 图1静置10分钟使凝胶凝固。小心移除梳子，形成四个矩形加样孔。</li>
		<li>用三卡因水填充每个孔，使用微量移液器将一条麻醉后的 Inactive+Stim 幼虫放入每个孔中，使其前后轴与电极垂直（参见 图1).</li>
		<li>在解剖荧光显微镜下检查每个培养室孔中的斑马鱼是否已完全麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将可调节的电生理模式发生刺激器连接至实验腔室 通过 一个极性控制器，使用鳄鱼夹连接到腔室一侧的每个电极上（参见 图1). 
	注意：极性控制器用于每5秒反转一次极性，以防止电极发生电解和腐蚀。</li>
	<li>刺激鱼类。例如，每隔5秒施加一次持续1秒的200 Hz、20 V电脉冲刺激，脉冲持续时间为0.5 ms，脉冲间隔为4.5 ms，可有效建立重复强直收缩抗阻模式。</li>
	<li>定期在显微镜下检查以确认鱼类是否受到刺激；示例电刺激应每5秒诱导一次可见的双侧收缩和轻微运动。</li>
	<li>在高阻力/高负荷条件下，以高频率刺激鱼类&#160;每次持续5分钟，共进行3次，每次间隔5分钟休息。 
	注意：当鱼缸一侧的鱼处于静止状态时，可将鳄鱼夹连接至鱼缸另一侧的电极对，并对这些额外的鱼进行刺激。</li>
	<li>刺激后，用塑料移液管轻轻冲洗各孔中的斑马鱼，小心将其移出，并转移至含新鲜三卡因的鱼类培养基中，放回培养箱继续培养。</li>
	<li>倒掉腔室中的三卡因溶液，用镊子在每个孔周围剪切并移除琼脂糖。用自来水冲洗孔内，然后使其干燥。 
	注意：如果使用银丝电极，在刺激实验后，电极表面有时会积累氧化银。由于氧化银的导电性低于银，为了保持实验可重复性，再次使用装置前，需用Kimwipes小心擦拭去除银丝表面的氧化银。</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文报道了一种准确且高效估算活体斑马鱼幼虫肌肉体积的方法，适用于色素沉积对成像影响较小的发育阶段或遗传变异体，且在短暂麻醉和/或固定处理耐受性良好的情况下使用。尽管我们采用了激光扫描共聚焦显微镜，但所描述的方法同样适用于转盘共聚焦显微镜、光片显微镜，以及任何能够生成不同焦平面图像堆栈的技术。文中介绍了一系列逐步精细化的组织大小与细胞含量估算方法，每种方法均有其优势与局限性，且这些优缺点可被量化评估。研究组织生长的一个主要限制在于难以实时分析生长变化，因为生长速率会随着急性施加刺激所引发的一系列分子或亚细胞事件而动态改变。此外，在比较不同个体时，个体间差异可能带来分析难题。本方法可在单个活体个体中实现对不足一天时间内的组织生长进行测量，该方法的应用甚至可设想扩展至分钟级的时间尺度。
所述方法使得此前难以实现的分析成为可能。使用4切片法，经过培训的操作人员可在约1小时内完成约20条鱼样本的肌肉生长检测成像部分。这与传统的全堆栈法形成鲜明对比，后者处理相同数量的鱼至少需要3小时（即耗时长三倍）。若后续亚细胞分析需要高分辨率图像，全堆栈法每条鱼可能轻易耗时30分钟，使得对处于相似发育阶段的...

受调控的组织生长，包括细胞数量的增加（增生）和/或细胞体积的增大（肥大），是发育、再生以及生态和进化适应过程中的关键因素。尽管近几十年来在细胞和发育生物学的分子遗传学方面取得了巨大进展，但对组织和器官大小调控机制的理解仍处于初级阶段。造成这一知识空白的原因之一，是在活体生物中以必要的空间和时间精度量化组织生长存在困难。
整个生物体生长的各个方面均可随时间进行重复测量，从而揭示每个个体的生长曲线1,2,3,4,5。日益精密的扫描方法，如双能X射线吸收测定法（DXA）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI），使得在单个个体（包括人类和模式生物）中追踪整个器官及其他身体区域（例如特定的骨骼肌）的生长成为可能6,7,8,9,10。然而，这些方法尚不具备足够的分辨率以揭示单个细胞，因此细胞行为与组织水平生长之间的关联难以明确。为了建立此类关联，传统研究通常依赖于一组相似的个体动物，在连续的时间点处牺牲其中少数个体，并进行详细的细胞学分析。这类方法需要对观察到的变化在群体（尽管尽可能相似但仍存在变异）中进行平均处理，因而受限于时间和空间分辨率，难以发现细胞水平上提示因果关系的关联事件。
最初在C. elegans和D. melanogaster中开展的无脊椎动物模型生物研究，通过发展光学显微技术实现了细胞分辨率，并能够准确测量单个个体随时间的生长情况，从而规避了上述问题。这些研究揭示了在这些小型模式生物生长过程中细胞谱系行为表现出显著的不变性11,12,13,14,15,16,17。然而，包括所有脊椎动物在内的许多动物具有不确定的细胞谱系，它们通过尚不明确的反馈机制调控组织生长，将基因编码的生长程序转化为具有三维结构的完整生物体，并使所有组成组织和器官在大小上适当匹配。为了理解这些复杂的生长过程，理想的方法是对单个个体中的整个组织或器官进行随时间推移的成像观察，同时能够在选定的时间点通过遗传、药理学或其他干预手段进行实验操作，并随后分析其效应。
每种脊椎动物的骨骼肌都具有特定的大小、形状和功能，并与邻近组织（如骨骼、肌腱和神经）存在明确且特征清晰的相互作用。某些肌肉体积较小，位于皮肤下方浅层，因此是高分辨率成像研究的理想对象。与大多数器官类似，每块肌肉在胚胎期、出生后及幼年期持续生长，直至达到稳定的成年大小。然而，肌肉在成年期还具有根据使用情况和营养状况改变其大小的独特能力18，这一特性对个体的整体健康、运动表现以及独立生活能力具有重要影响。老年时期肌肉质量和功能的丧失，即肌少症，已成为人口老龄化社会日益关注的重要问题19,20,21。
我们及其他研究者一直关注斑马鱼幼虫节段性重复体节中骨骼肌组织特定区域的生长，该系统看似封闭，包含数百个细胞，可在其中观察并操控组织的生长、维持与修复过程22,23,24,25,26。尽管此前已有部分定量研究报道25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35，但目前仍缺乏一种在单个脊椎动物个体中随时间推移、以细胞水平精度进行肌肉生长测量的详细且经过验证的方法。本文介绍了一种高效执行此类重复测量的实验方案，并提供了方法验证以及该方法用于分析因电活动改变所引起的肥大性生长与增生性生长变化的实例。

<table><tbody><tr><td>粘合剂，Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>气溶胶真空泵&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>-</td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>熔化后，需在恒温金属浴中保持 37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C，以维持液态，便于重复使用。</td></tr><tr><td>恒温金属浴</td><td>Cole-Parmer</td><td>SBH130</td><td>-</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5-神经酰胺</td><td>Thermo Scientific</td><td>D3521</td><td>需用鱼用培养液稀释，终浓度为 5 &amp;micro;M，用于过夜孵育。</td></tr><tr><td>鳄鱼夹及导线</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>鱼用培养液，鱼用清水</td><td>-</td><td>-</td><td>从鱼类饲养系统中收集的循环用水。</td></tr><tr><td>鱼用培养液，E3 培养液</td><td>-</td><td>-</td><td>E3 培养液的配方见《斑马鱼手册》（The Zebrafish Book）。http://zfin.org（含 5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;，溶于蒸馏水中）。</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16F</td><td>其他类型的荧光显微镜也可适用。</td></tr><tr><td>玻璃针</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100-6</td><td>需经火焰抛光，以避免操作过程中损伤胚胎。</td></tr><tr><td>电刺激仪</td><td>Grass Instruments</td><td>S88</td><td>其他类型的电刺激仪也可适用。</td></tr><tr><td>Kimwipes，精密擦拭纸巾</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>13258179</td><td>-</td></tr><tr><td>激光扫描显微镜（LSM）&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 5 Exciter&lt;br/&gt; Zeiss LSM 880</td><td>其他类型的激光扫描显微镜也可适用。</td></tr><tr><td>Nunc 细胞培养处理 6 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>-</td></tr><tr><td>物镜，20&amp;times;/1.0W 水浸</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>巴斯德移液管，1 mL 刻度</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-0100</td><td>-</td></tr><tr><td>巴斯德移液管，1 mL 微细尖头</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-1100</td><td>-</td></tr><tr><td>培养皿，60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td>-</td></tr><tr><td>质粒，CMV-Cerulean</td><td>Christina L. Hammond（布里斯托大学）</td><td></td><td>在单细胞期注射 pCS2+_cerulean_kanR 质粒，剂量为 25–75 pg。&amp;nbsp; 引用文献：Bussman J, Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080。</td></tr><tr><td>质粒，pCS-mCherry-CAAX</td><td>Henry Roehl（谢菲尔德大学）</td><td>-</td><td>用于 SP6 启动子介导的体外转录（也可使用含其他膜标记的质粒）；&lt;br/&gt; 合成带帽的 mRNA，在单细胞期注射，剂量为 100–200 pg。</td></tr><tr><td>脉冲控制器&amp;nbsp;</td><td>Hoefer Scientific Instruments</td><td>PC750</td><td>-</td></tr><tr><td>电烙铁</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐 / MS-222；需溶于鱼用培养液中，使用浓度为 0.6 mM。</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>钟表匠镊子，No. 5</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>铂丝</td><td>Goodfellow</td><td>PT005142/12</td><td>直径 0.40 mm；为银丝的昂贵替代品。</td></tr><tr><td>银丝</td><td>Acros Organics</td><td>317730010</td><td>直径 0.25 mm（已测试多种直径，如 0.25–0.5 mm，结果相似）。</td></tr><tr><td>斑马鱼，myog:H2B-mRFP</td><td>David M. Langenau（麻省总医院；哈佛干细胞研究所）</td><td>-</td><td>ZFIN 官方名称：Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg。&amp;nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2&amp;nbsp; 引用文献：Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yord&amp;aacute;n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. 将肿瘤细胞移植至光学透明的免疫缺陷斑马鱼后观察细胞异质性。Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358。</td></tr><tr><td>斑马鱼，&amp;alpha;-肌动蛋白:mCherry-CAAX</td><td>Peter D. Currie（澳大利亚再生医学研究所，蒙纳士大学）</td><td>-</td><td>ZFIN 官方名称：Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg。&amp;nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 引用文献：Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, Currie PD. 斑马鱼 tr&amp;auml;ge 突变体中 Tropomodulin4 的缺失导致细胞质棒状结构形成及肌肉无力，类似杆状体肌病。Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376。</td></tr><tr><td>斑马鱼，&amp;beta;-肌动蛋白:HRAS-EGFP</td><td>-</td><td>-</td><td>ZFIN 官方名称：Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg。http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2&amp;nbsp; 引用文献：Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, Kimelman D. 利用 BODIPY TR 甲酯染料作为 GFP 的活体复染剂，在转基因斑马鱼胚胎中可视化形态发生过程。Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252。</td></tr><tr><td>ZEN 软件</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

对经历电活动改变的单条活体斑马鱼骨骼肌生长进行实时和重复测量

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

有多种方法可用于在活体斑马鱼胚胎、幼虫或幼鱼的全身中观察单个细胞。我们展示了一种方法：利用共聚焦激光扫描显微镜对质膜带有荧光标记的活鱼进行扫描，以测定肌肉组织的体积以及存在的肌纤维数量。文中描述并验证了在活体动物中随时间推移测量细胞数量和大小的有效方法，其结果与更为繁琐的分割方法相比具有一致性。同时介绍了可调控肌肉电活动（从而调控收缩活动）的技术。骨骼肌收缩活动的丧失会显著降低肌肉的生长。在幼虫阶段，文中描述了一种允许重新引入模式化电刺激诱导收缩活动的方案。所描述的方法可最大限度地减少个体间差异的影响，从而能够在活体生物背景下分析电刺激、遗传因素、药物或环境刺激对多种细胞和生理生长参数的影响。此外，还可对个体在生命早期接受特定干预后的长期效应进行追踪观察。

一种快速且精确的体节体积测量方法 
本文描述了一种样本制备、数据采集和体积分析的方法，可用于快速测量斑马鱼幼体的肌肉生长。通过在血浆膜上标记膜靶向的GFP（β-actin:HRAS-EGFP）或mCherry（α-actin:mCherry-CAAX）的鱼类，可在活体动物中测量肌肉大小。实验中，将幼鱼短暂麻醉于三卡因中，包埋于低熔点琼脂糖内，并通过共聚焦荧光显微镜成像。选择体节17进行肌肉大小分析，因其位于躯干与尾部交界处，易于观察31。在实际操作和理论基础上，肌节体积可通过肌节长度（L）与三个横截面积（CSA）测量值的平均数的乘积来计算（图2A，该方法称为四切片法）。
为验证该方法，获取了活体斑马鱼幼鱼的体节全层共聚焦 Z-堆栈图像（图2B），并通过将每一片层中第17体节轮廓面积之和（80–100片层）乘以片层间距（1–1...

斑马鱼在细胞生物学和生理学研究中具有显著的光学透明优势。本文描述了在个体动物中测量细胞生长的可靠方法，这些方法能够提供新的见解，揭示骨骼肌及邻近组织的生长如何与整体身体生长相协调。

有多种方法可用于在活体斑马鱼胚胎、幼虫或幼鱼的全身范围内对单个细胞进行成像。我们展示了在活体鱼中……

本方案使我们能够研究组织（如骨骼肌）如何调控其大小，这是细胞生物学和发育生物学中的一个关键问题，具有重要的生理学和医学意义。本技术的主要优势在于，可在活体动物中以高度的空间和时间精确性观察并测量细胞生长。对早期肌肉生长基础机制的深入理解，有助于揭示早期肌肉疾病的发生发育根源，并推动新型治疗药物的发现，以保护老年人及肌肉萎缩症患者免受肌肉流失的危害。在1.5毫升离心管中配制1% LMA，并置于37摄氏度加热金属块中以供重复使用。选取需要固定的斑马鱼，对每条鱼进行短暂麻醉。为避免热休克，将LMA分装液从加热金属块中取出，使其冷却至略高于凝固点。取一个已涂有1% LMA层的60毫升培养皿，将其放置在解剖显微镜的载物台上。用一支1毫升塑料巴氏吸管将幼虫转移至一个60毫米的涂有LMA的培养皿中，并尽可能去除转移时带入的培养液。随后，仍使用该巴氏吸管，在鱼体上滴加数滴LMA，并在LMA凝固前，用镊子或火焰抛光的细玻璃针迅速将幼虫调整至靠近LMA上表面的位置，使其前后轴和背腹轴与水平方向夹角在10度以内。或者使用1毫升塑料巴氏吸管。用最少的养鱼液收集幼鱼，并将幼鱼转移至冷却的LMA分装液中。静置幼鱼5秒，使其完全被LMA包围。然后取出幼虫，将其转移至琼脂糖包被的培养皿中的LMA液滴中。迅速按照之前演示的方法定位幼虫。如果幼虫未在琼脂糖液滴表面附近水平正确固定，需将其移除并重新包埋；可通过1毫升塑料巴斯德吸管轻轻抽吸回收幼虫，并使用化学擦拭纸轻轻去除LMA。等待约10分钟，直至LMA凝固。用约10毫升含三卡因的鱼类培养基灌满培养皿。为获取共聚焦图像序列，在扫描前需将固定好的鱼样静置至少10分钟，以待琼脂糖充分膨胀。将样品皿装载到共聚焦系统的载物台上。找到幼虫，并聚焦于目标体节。可选择体节17，因其靠近肛门开口，易于定位且便于成像。通过从前部开始计数体节来检查。为获取YZ图像，设置时如同要采集Z轴层叠图像。首先定义鱼的顶部和底部位置。可根据需要捕获左侧和右侧，确保所有快速 YZ 扫描均覆盖目标区域。根据共聚焦软件的允许情况调整鱼类的扫描区域方向。将鱼类定位，使其前后轴与图像的 X 轴平行，背腹轴与 Y 轴平行，并使体节 17 位于视野中心。聚焦于最上层肌节的中段层面，使整个上轴和下轴体节半部以及垂直和水平肌隔均清晰可见，并采集高分辨率的XY图像。为文件命名并保存图像。为获取YZ图像，需沿所选体节从背侧至腹侧精确绘制一条与鱼类前后轴垂直的直线。添加选定的前后位置，然后执行Z轴堆栈线扫描。在选定体节的定义前后位置处，重复进行三次YZ线扫描，以获取YZA、YZM和YZP。将这些图像与相应的XY图像一同命名并保存。该方案被称为四切片法，图像可使用Zen软件或ImageJ进行分析。要制作刺激室，取一个6孔×35毫米的培养板，用细烙铁在每孔两侧各开两个直径小于5毫米、相距1厘米的小孔。制

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

实时和重复测量电活动改变的个体活斑马鱼的骨骼肌生长

本视频展示了通过将微吸管置于瘫痪斑马鱼幼虫的侧线神经节附近并形成松密封接来记录传入神经元电信号的方法。在此过程中，细胞外溶液可维持神经元的活性。...

在固定斑马鱼幼体中监测传入神经元的电信号

本文介绍了一种记录幼年斑马鱼前脑细胞外场电位的简单方法。该方法可提供癫痫样活动的稳定体内读数。该技术可用于携带癫痫相关基因的转基因斑马鱼幼鱼，或通过给予致惊厥药物诱发癫痫的模型。...

幼年斑马鱼前脑电生理记录

斑马鱼是研究人类骨骼肌疾病的新兴模型系统。本文介绍一种快速高效分离斑马鱼胚胎和幼体骨骼肌肌纤维的方法。该方法可获得高密度的肌纤维样本，适用于单个骨骼肌纤维形态学、蛋白质亚细胞定位以及肌肉生理学的研究。...

分离制备物中斑马鱼胚胎和幼鱼骨骼肌肌纤维的分析

力测量可用于揭示发育、损伤、疾病、治疗或化学毒性对肌肉功能造成的影响。在本视频中，我们演示了一种用于测量斑马鱼幼体躯干肌肉在最大收缩期间产生力量的方法。...

斑马鱼幼虫收缩过程中的力测量以评估肌肉功能

斑马鱼现已成为研究肌营养不良症、先天性肌病及相关神经肌肉疾病的重要且强大的模型工具。双折射和触觉诱发逃逸行为是两种常用的非侵入性检测方法，用于评估斑马鱼胚胎在早期发育过程中肌肉结构紊乱和运动功能障碍的程度。...

通过双折射和触诱发逃逸反应检测分析斑马鱼幼虫骨骼肌缺陷

本文描述了如何对成年斑马鱼进行固定、插管，并用于在完整动物体内开展在体电生理实验，以记录和调控神经活动。...

在完整成年斑马鱼脑中的电生理记录

斑马鱼是研究肌肉功能和疾病的理想模型。在早期胚胎发育过程中，斑马鱼开始出现规律的肌肉收缩，产生节律性游泳行为，当肌肉功能受到干扰时，该行为会发生改变。本文描述了一种触碰诱发反应和运动能力检测方法，通过评估游泳表现来反映肌肉功能。...

利用触觉诱发反应和运动能力检测评估斑马鱼肌肉功能与性能

此处描述的实验方案通过采用斑马鱼胚胎，能够在最接近生理状态且侵入性最小的条件下研究可兴奋细胞的电学特性。 体内...

在活体斑马鱼胚胎中检测运动神经元膜电位

在此，我们展示了构建细胞电位报告斑马鱼品系的过程，以可视化胚胎发育、运动及斑马鱼肿瘤细胞 体内.

斑马鱼早期胚胎和肿瘤中细胞电活动的可视化

骨骼肌再生由组织驻留的肌肉干细胞驱动，这些细胞在多种肌肉疾病（如肌营养不良症）中功能受损，导致肌肉无法再生。本文介绍了一种可在斑马鱼肌肉疾病模型中研究肌肉再生的实验方案。...

研究肌肉疾病斑马鱼模型中的肌肉再生

斑马鱼幼体的神经肌肉接头是研究突触生理学的理想模型。该模型适用于多种实验技术，包括电生理学和光学成像。本文中，我们描述了一种在直立式落射荧光显微镜下利用基于pHluorin的探针进行突触传递成像的实验方案。...

活体成像观察离体幼年斑马鱼神经肌肉接头中的突触囊泡循环

学习利用共聚焦显微镜实时测量活体斑马鱼骨骼肌生长的方法。该技术结合电刺激与四维切片法，可精确追踪肌肉发育动态，为研究肌肉萎缩疾病的发病机制及开发新治疗策略提供重要实验基础。

对经历电活动改变的单条活体斑马鱼骨骼肌生长进行实时和重复测量

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