Name: 南瓜种间杂交的胚胎救援方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学习南瓜种间杂交胚胎救援技术，利用MS培养基和抗生素处理Cucurbita pepo与Cucurbita moschata未成熟胚。该方法简便易行，可广泛应用于西葫芦育种计划以提高遗传多样性。

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本研究由美国农业部&#160;国家食品与农业研究所、NRS 项目编号 FLA-TRC-006176 以及佛罗里达大学食品与农业科学研究所资助。

1. 种植与授粉
注意：确定能够通过杂交产生果实的相容基因型非常重要&#160;以及可存活胚胎的产生。
<ol>
	<li>种植条件与植株管理
	<ol>
		<li>获取用于杂交的南瓜基因型（品种/品系）种子（表1）。</li>
		<li>使用添加了完全NPK肥料的育苗基质填充50孔育苗盘（25 cm宽 × 50 cm长），肥料含量为1.38 g/kg N、1.38 g/kg P和1.38 g/kg K。</li>
		<li>将种子播种至与其种子长度相等的深度，并用育苗基质覆盖。浇水时避免积水，之后每天手动浇水一次，保持基质湿润。</li>
		<li>在第二片真叶期，将幼苗移栽至直径25 cm至30 cm的花盆中，每盆加入3汤匙完全NPK肥料。每周施用一次液体肥料，每盆施500 mL，肥料NPK比例为20:20:20，配制浓度为每加仑水中加入1 g肥料。</li>
		<li>将植株置于温室中培养，温度维持在22–28 °C，光照采用自然光条件。对于蔓生型基因型，需在温室内提供支撑用棚架（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>授粉操作
	<ol>
		<li>通常情况下，南瓜开花始于播种后6至8周，具体时间因品种而异（图2A、B）。一旦植株开始开花，即可进行人工控制杂交（杂交组合）。在温室条件下，全年均可进行授粉。</li>
		<li>识别出次日即将开放的 C. pepo 和 C. moschata 品种的雄花和雌花。识别方法为观察花瓣已呈现黄色但尚未张开的花朵。使用美纹纸胶带轻轻将花顶部封闭，防止意外的昆虫授粉（图2C、D）。</li>
		<li>次日上午进行授粉，应在上午10:00前完成，以提高杂交成功率27。</li>
		<li>轻轻撕去雌花和雄花被胶带封住的花冠顶部，使花朵打开。取下雄花的花瓣，通过将花药轻轻摩擦雌花柱头的方式完成授粉（图3A）。</li>
		<li>授粉后，立即用美纹纸胶带重新封闭已授粉的雌花。使用标签记录授粉日期，并标明杂交组合中父本和母本的来源（图3B）。</li>
		<li>成功杂交的标志是子房膨大，并在1周内迅速形成小果实（图4A）。授粉后45–55天，植株即可收获28（图4B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚胎拯救技术
<ol>
	<li>培养基制备
	<ol>
		<li>制备抗生素母液：将头孢噻肟（钠盐）溶于4 mL去离子水或蒸馏水中，经无菌0.22 µm针头滤器过滤后，分装为每管0.5 mL的等份。于-20 °C保存&#160;。所得母液浓度为250 mg/mL。</li>
		<li>将氨苄青霉素（钠盐）粉末溶于10 mL水中，经无菌0.22 µm针头滤器过滤后，分装为每管1 mL的母液，终浓度为100 mg/mL。于-20 °C保存&#160;。</li>
		<li>在1 L瓶中加入500 mL蒸馏水，溶解2.45 g Murashige和Skoog（MS）培养基粉末（终浓度为4.91&#160;g/L），再加入1.5 g凝胶多糖&#160;，于121 °C高压灭菌20分钟。凝胶多糖在灭菌过程中会完全溶解。</li>
		<li>灭菌后，将培养基瓶置于50 °C水浴中冷却。从冰箱中取出抗生素母液，并在超净工作台内解冻。</li>
		<li>将培养基瓶转移至超净工作台，向瓶中加入0.6 mL头孢噻肟母液（250 mg/mL）&#160;和0.25 mL氨苄青霉素母液（100 mg/mL），充分混匀。将约7 mL培养基倒入无菌培养皿（60 mm × 15 mm）中。</li>
		<li>让培养基在培养皿中静置约15–20分钟使其凝固。用封口膜密封培养皿后放入储存盒中，于室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎拯救
	<ol>
		<li>开始前，用70%乙醇清洁并消毒超净工作台。</li>
		<li>通过折断或切割方式收获南瓜果实，并在实验室内水槽中用液体洗涤剂（例如0.3%氯二甲酚）清洗果实表面，直至所有松散污物被清除（图5A）。</li>
		<li>用大量自来水冲洗，再用洁净的纸巾擦干果实表面，然后将果实转移至超净工作台内（图5B）。</li>
		<li>在无菌的超净工作台内，用70%乙醇喷洒果实表面进行表面消毒，使用无菌刀片将果实纵向切开（图5C），取出种子。</li>
		<li>使用无菌镊子无菌地打开种皮，暴露出未成熟胚胎（图6）。小心地将未成熟胚胎转移至含有添加了头孢噻肟和氨苄青霉素的MS培养基的培养皿中（图7A）。盖上培养皿并用封口膜密封。 
		注：根据胚胎大小，一个培养皿中可放置五至六个胚胎。</li>
		<li>将密封的含胚胎培养皿置于培养箱中，在25 °C、70%相对湿度及16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下培养。若发生污染，应及时将未污染的胚胎转接到含相同培养基的新培养皿中。</li>
		<li>子叶在接种后第4天开始展开，第10天转为绿色（图7B）。此时若需要，可将胚胎转接到含相同培养基的新培养皿中，以促进组织扩展。根系在第14天开始出现（图7C），至第21天时，小植株已长出伸长的根系和子叶（图7D）。 
		注：本方案所用培养基无需额外添加生长调节剂，即可支持芽和根的分化。</li>
		<li>在此阶段，将小植株从&#160;培养皿中取出，用自来水轻轻冲洗根部残留的培养基（图8）。将小植株放入塑料容器（14 cm × 9 cm × 4 cm）中，用湿润的纸巾覆盖根部（图9A）。盖上容器，并根据需要定期润湿纸巾。</li>
		<li>将容器置于室温（25–28 °C）及16小时光照周期条件下培养，以实现小植株的适应性驯化。在容器中驯化7–10天后，幼苗长度可达约3–4英寸。此期间应根据需要补充水分以保持纸巾湿润。</li>
		<li>将幼苗移栽至含有前述肥料改良基质的50孔育苗盘（25 cm宽 × 50 cm长）中，并转移至温室（图9B）。避免过度浇水以防腐烂；根据需要每孔添加约10–20 mL水。</li>
		<li>当幼苗长至第二至第三片真叶阶段时，将其移栽至直径30 cm、装有前述肥料改良基质的花盆中（图10A）。为蔓生植株提供支架支撑，并在植株开始开花时进行人工控制杂交（图10B）。</li>
		<li>将植株保留在温室中，在22–28 °C自然光照条件下生长，观察并评估其果实和种子性状。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

成功进行种间杂交的两个主要瓶颈是 C. moschata 和 C. pepo：由基因型决定的杂交亲和性障碍，即产生杂交胚胎的能力，以及受精后的发育障碍，即阻碍杂交胚胎发育为正常种子的过程。如先前在南瓜中所报道的，本研究中的杂交亲和性测试显示，大多数果实为单性结实，且多数种子无活力16亲本基因型对种间杂交的亲和性具有显著影响 C. moschata 和 C. pepo在本研究测试的24种杂交组合中，仅有一种组合（C与J）获得了可用于胚胎拯救的未成熟胚胎。因此，由于缺乏生物学重复，本研究在验证所开发方案效率方面受到限制。然而，从C与J杂交组合中拯救的10个未成熟胚胎中，获得了80%的再生效率。既往研究报道的胚胎拯救再生成功率较低 C. pepo 和 C. moschata 杂交，从而证明了新方案的有效性14,15例如，De Oliveira 等人报道，在26个来自杂交的胚...

南瓜属 (2n = 40) 是葫芦科中一个遗传多样性极为丰富的属，包含27个不同物种，其中5个为栽培种1其中 中国南瓜，美洲南瓜 和 C. maxima 是全球最具经济重要性的。在美国， C. moschata 和 C. pepo 是农业生产中最重要的两个物种。 C. pepo 包含四个亚种（ovifera, 瓠果, 异卵的，以及 gumala) 包含弯颈、直颈、栗子形、圆边、科科泽尔、蔬菜 marrow、西葫芦和南瓜等夏南瓜和冬南瓜栽培品种组2,3,4,5. C. moschata 主要包括冬季南瓜市场类型，如胡桃南瓜、迪金森南瓜和奶酪南瓜组1这两个物种在形态学和表型上具有多样性，且 C. pepo 因其产量高、早熟、丛生生长习性以及多样的果实性状（如果实形状、果实大小、果肉颜色和果皮花纹）而受到重视。另一方面， C. moschata 因其耐热、耐湿以及抗病虫害的特性而备受青睐6,7种间杂交 C. moschata 和 C. pepo 不仅是两个物种间导入优良性状的重要策略，而且有助于拓宽育种项目的遗传基础7,8.
早期进行的 C. moschata 与 C. pepo 之间的杂交旨在确定二者之间的亲和性及/或分类学障碍9,10,11，而后续研究则主要集中在转移优良性状上12,13,14。这两个物种之间的种间杂交旨在转移来自 C. pepo 的新性状，如丛生或半丛生生长习性和更高的产量，以及来自 C. moschata 的抗病性、对非生物胁迫的适应性和更强的生长势14,15,16。例如，C. pepo（P5）与 C. moschata（MO3）之间的特定杂交已获得更高的果实产量13，而 C. moschata 的若干种质资源（尼日利亚地方种和Menina）已被广泛用作栽培 C. pepo 品种抵抗马铃薯Y病毒属（potyviruses）的主要抗性来源17,18。
先前的研究表明，C. moschata 与 C. pepo 之间的杂交是可能的，但较为困难8,15。种间杂交可能导致不结果（败育）、产生无生活力种子的单性结实果实（空种子）、无籽果实（种胚发育不全，即假单性结实），或仅含少量未成熟胚的果实，后者可通过胚拯救技术获得成熟植株15,16。例如，在以 C. pepo（table queen，母本）与 C. moschata（large cheese，父本）进行杂交时未获得有生活力的种子，但反交组合在134次授粉中获得了57粒有生活力的种子9。Hayase 仅在凌晨4:00使用于10 °C条件下过夜保存的花粉进行杂交时，才成功从 C. moschata 与 C. pepo 的杂交中获得有生活力的种子19。Baggett 将八种不同的 C. moschata 品种与 C. pepo（delicata）杂交，报道在总共103次授粉中获得了83个外观正常的果实，但其中均未发现有生活力的种子8。在 C. pepo（S179）与 C. moschata（NK）的杂交中，Zhang 等人获得了15个果实，共2,994粒种子，但仅有12粒种子具有生活力，其余种子仅表现出初步发育。这些研究表明，尽管 C. moschata 与 C. pepo 之间的种间杂交具有重要价值，但从杂交中获得含有生活力种子的果实仍极具挑战性16。
胚胎拯救被认为是一种克服早期胚胎败育或发育不良问题的适当方法，也是最早且最成功的技术之一 体外 未成熟胚胎再生的培养技术16,20胚胎拯救技术包括 体外 未成熟胚胎的培养，随后转移至无菌营养培养基，以促进幼苗再生及最终获得成熟植株21尽管胚胎拯救技术在葫芦科作物育种中已有广泛应用，但目前仍缺乏对该技术适用方法的详细描述，从而限制了其常规化应用。利用胚胎拯救技术克服种间杂交障碍 南瓜属 该物种早在1954年就有报道22然而，早期研究中胚胎拯救的成功率或未见报道，或非常低。Metwally 等人报道，在100个来自种间杂交组合的杂种胚胎中，通过胚胎拯救获得成熟植株的成功率为10%。 C. pepo 和 C. martinezii23Sisko 等人报道了不同杂交组合所获得胚胎的胚胎再生成功率存在差异：通过杂交获得的杂种胚胎，其再生率也各不相同。 C. maxima (Bos. Max)和 C. pepo （淘金热）为15.5%，对于 C. pepo （西葫芦）和 C. moschata （北海道）为20%，而 C. pepo （淘金热）和 C. moschata （Dolga）为37.5%24除了基因型、培养基和 体外 培养条件是该技术成功的重要因素25,26在本研究中，不同组合之间的杂交 C. moschata 和 C. pepo 是&#160;已进行测试，并建立了一种在葫芦科植物中利用胚胎拯救技术的简便方法。这种简单且易于重复的胚胎拯救技术的建立，将有助于葫芦科作物育种项目中的种间杂交和种质资源改良。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Steris</td><td>AMSCO LAB 250</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>头孢噻肟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C 7039</td><td></td></tr><tr><td>离心管（1.5 ml）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>去垢剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇，95%</td><td>Decon Labs</td><td>2805HC</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>结冷胶</td><td>Caisson Laboratories</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>生长室或光照培养架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流罩 / 生物安全柜</td><td>贝克公司</td><td>埃奇加德</td><td></td></tr><tr><td>美纹纸胶带</td><td>Uline</td><td>S-11735</td><td></td></tr><tr><td>培养基瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>穆拉希吉 &amp;amp; 斯科格培养基</td><td>研究产品国际公司</td><td>M10200</td><td></td></tr><tr><td>NPK 肥料 (20-20-20)</td><td>BWI 公司股份有限公司</td><td>&amp;nbsp;PR200</td><td></td></tr><tr><td>Osmocote Plus 肥料</td><td>BWI Companie,s Inc</td><td>OS90590</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma Alfrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 × 15 mm）</td><td>USA Scientific, Inc</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>花盆</td><td>BWI 公司股份有限公司</td><td>NP4000BXL</td><td></td></tr><tr><td>塑料食品容器，重复使用</td><td>Oscar Mayer</td><td>4470003330</td><td></td></tr><tr><td>塑料吊牌</td><td>亚马逊</td><td>B07QTZRY6T</td><td></td></tr><tr><td>盆栽混合土</td><td>快乐园丁</td><td>Pro-Line C/B</td><td></td></tr><tr><td>育苗盘</td><td>BWI Companies Inc</td><td>GPPF128S4</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 μm）</td><td>ExtraGene</td><td>B25CA022-S</td><td></td></tr><tr><td>格架支撑</td><td>家得宝</td><td>&amp;nbsp;2A060006</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

葫芦科植物种间杂交的胚胎拯救方案

Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash

在葫芦属（Cucurbita）作物（南瓜）中进行种间杂交有助于扩大遗传变异并实现有益等位基因的渐渗。这些远缘杂交产生的未成熟胚胎必须通过适当的胚胎拯救技术进行再生。尽管该技术已在多种作物中建立，但目前尚缺乏针对南瓜、可用于常规应用的详细方法描述。本文介绍了一种适用于 C. pepo 与 C. moschata 种间杂交的胚胎拯救方案。为确定可用于胚胎拯救的有效杂交组合，共进行了24个种间杂交试验。其中22个杂交组合成功坐果，坐果率达92%。然而，所获得的果实大多为单性结实，种子中无胚胎（空籽）。仅有一个杂交组合产生了可在基础植物生长培养基上再生的未成熟胚胎。从该种间F1代果实中共成功拯救出10个胚胎，胚胎拯救成功率为80%。本研究建立的胚胎拯救方案将对南瓜育种项目中的种间杂交具有重要应用价值。

果实坐果与种子活力 
初步测试用于测定多种杂交组合下的坐果率和种子活力。共使用15种南瓜基因型和四种 C. pepo 和 11 C. moschata，被选中（表1）。在尝试的24种种间杂交组合中，有22种获得了果实结实（表2），代表总体 &gt;坐果成功率为92%。O与M以及E与J杂交未获得成熟果实，而F与J杂交获得的果实数量最多（n = 6）。表2不同杂交组合的授粉花朵数量介于1至11朵之间，授粉成功率在0%至100%之间。不同杂交组合中授粉花朵的数量取决于花序数量以及雌雄花开花期的同步程度。尽管除两个组合外其余杂交均获得了果实，但切开果实进行评估后发现，大多数果实中的胚胎已发生败育，未能形成可存活的种子。多数杂交果实外观正常，但无种子或种子仅含有退化的胚胎。所有杂交组合共产生44个果实，其中仅有一个果实（由C与J杂交获得）含有发育不良的胚胎，可通过胚胎拯救技术进行挽救。
胚胎拯救及后续...

的&#160;本文描述了一种胚胎拯救方案，用于再生来源于种间杂交的未成熟胚胎 Cucurbita pepo 和 Cucurbita moschata该方案易于重复，将为葫芦科作物育种项目提供重要的资源。

葫芦科作物（南瓜）的种间杂交有利于扩大遗传变异以及有益等位基因的渐渗。未成熟……

胚胎拯救技术是再生不同南瓜属物种间远缘杂交所得未成熟胚胎所必需的方案，最常用于美洲南瓜（Cucurbita moschata）与西葫芦（Cucurbita pepo）之间的杂交。该技术的主要优势在于其操作简便。该方案仅使用含抗生素的MS培养基，因此任何实验室均可轻松复制。也可对该技术进行修改，以研究种间或属间杂交的不同障碍。在每一步骤中关注细节将有助于获得成功的实验结果。首先种植南瓜属植物，使用添加了完全氮、磷、钾肥料的育苗基质填充尺寸为25厘米×50厘米的50孔育苗盘，肥料中氮、磷、钾含量均为1.38克/千克。接着，将种子播种至与其长度相等的深度，并用育苗基质覆盖种子。浇水时避免积水，并通过每天浇水一次保持基质湿润。在第二片真叶期结束时，将幼苗移栽至直径30厘米的花盆中，每盆添加三汤匙的复合肥。此后每隔七天，用500毫升液体肥料对每盆施肥一次，该液体肥料由一克含氮、磷、钾各20的肥料（20-20-20）加入一加仑水中配制而成。将植株置于温室中，在22至28摄氏度温度条件下，按照自然光照周期进行培养。对于蔓生型基因型，应在温室内提供支撑用棚架。当植株自播种后六至八周开始开花时，立即进行人工控制杂交或授粉。检查花瓣呈黄色的未开放花朵，辨认西葫芦（Cucurbita pepo）和印度南瓜（Cucurbita moschata）品种的雄花和雌花。为防止意外的昆虫授粉，用美纹纸胶带轻轻将闭合的花朵顶端封住。次日上午10:00之前进行授粉，轻轻揭去雄花和雌花上封口的胶带部分。将雄花的花瓣分离，并通过轻轻摩擦雄蕊将花粉转移到雌花的柱头上。授粉后，立即用胶带封闭授粉后的雌花，并用标签记录授粉日期，标明杂交所用的父本和母本。成功的杂交可通过子房膨大来判断，通常在一周内形成果实雏形。授粉后45至55天采收果实。配制头孢噻肟母液。使用无菌的0.22微米注射器滤器过滤。在-20°C保存前，将头孢噻肟配制成每毫升250毫克的溶液，并分装成每份0.5毫升的等份。同样地，制备氨苄青霉素母液，通过无菌的0.22微米注射器滤器过滤，分装成每份1毫升、每毫升100毫克的等份，于-20°C保存。在1升的瓶子中，将2.45克Murashige和Skoog（MS）培养基溶解于500毫升蒸馏水中以配制MS培养基。向MS培养基中加入1.5克凝胶多糖（gellan gum），并在121摄氏度下高压灭菌20分钟。将瓶子置于50摄氏度的水浴中，使培养基冷却。在超净工作台内解冻抗生素储备液。将培养基瓶转移至超净工作台，加入0.6毫升头孢噻肟储备液和0.25毫升氨苄青霉素储备液，充分混匀。将约七毫升培养基倒入60毫米×15毫米的无菌培养皿中。将培养基在培养皿中静置约15至20分钟，使其凝固。用封口膜封闭培养皿，并将其置于室温下的储存盒中备用。通过将瓜果从主藤上剪下进行采收，并在实验室水槽中用液体洗涤剂（如0.3%氯二甲酚）清洗果实表面，对其进行消毒。用大量自来水冲洗果实，然后用干净的纸巾擦干，再将果实转移至层流净化台内。在净化台内用70%乙醇喷洒果实表面进行消毒。用无菌刀片将果实纵切成两半，并取出种子。使用无菌镊子或戴无菌手套的手，无菌打开种皮，暴露未成熟胚，然后将其放入含有抗生素的MS培养基的培养皿中。用封口膜密封培养皿，并将其置于温度为25°C、光照周期16小时、相对湿度70%的培养室中。若发生污染，应立即将未污染的胚转接到含有相同培养基的新培养皿中。在10至14天根系发育后，以及15至21天子叶发育后，将幼苗从培养皿中取出，并用自来水轻轻冲洗掉根部周围的培养基。将清洗干净的幼苗放入一个14厘米×9厘米×4厘米的塑料容器中，并用湿润的纸巾覆盖根部。盖上容器，并在需要时重新润湿纸巾。将塑料容器保持在25至28摄氏度，并置于16小时光照周期下，使幼苗适应环境，同时维持纸巾的湿润状态。经过7至10天的适应后，将长3至4厘米的幼苗移栽到含有添加肥料的商用育苗基质的50孔育苗盘中，并移至温室。避免过度浇水以防止腐烂，根据需要每孔添加约10至20毫升水。在第二至第三片真叶期，将幼苗移栽至直径25厘米、装有添加肥料的培养基质的花盆中，并在植株开始开花时进行人工控制杂交。将植株置于温室中，在自然光照条件下维持温度为22至28摄氏度。并对植株的果实和种子性状进行评价。选择4个西葫芦（Cucurbita pepo）和11个印度南瓜（Cucurbita moschata）进行种间杂交。在尝试的24种不同种间杂交组合中，有22个组合获得了果实，果实坐果率超过92%。其中，基因型为O和M、以及基因型为E和J的印度南瓜与西葫芦之间的杂交未产生成熟果实。而 Cucurbita moschata 与 Cucurbita pepo 的 F 和 J 基因型杂交组合产生了六个果实。不同杂交组合的授粉花朵数量在 1 至 11 朵之间。授粉成功率范围为 0% 至 100%。在所有杂交组合产生的 44 个果实中，仅有一个来自 Cucurbita moschata 与 Cucurbita pepo 基因型 C 和 J 的杂交果实，获得了可挽救的未成熟胚胎。对于这些发育不良的胚胎，采用胚胎拯救培养基进行培养，胚胎拯救成功率可达80%。其中两个最关键的步骤是确定两种物种——南瓜（Cucurbita moschata）和西葫芦（Cucurbita pepo）之间可兼容的杂交组合，以及成功实现胚胎再生。由于胚胎拯救技术操作简便且易于重复，全球的葫芦科作物育种人员均可应用该技术，拯救来自不同南瓜属物种间远缘杂交所获得的未成熟胚胎。

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