葫芦科植物种间杂交的胚胎拯救方案

胚胎拯救技术是再生不同南瓜属物种间远缘杂交所得未成熟胚胎所必需的方案，最常用于美洲南瓜（Cucurbita moschata）与西葫芦（Cucurbita pepo）之间的杂交。该技术的主要优势在于其操作简便。

该方案仅使用含抗生素的MS培养基，因此任何实验室均可轻松复制。也可对该技术进行修改，以研究种间或属间杂交的不同障碍。

在每一步骤中关注细节将有助于获得成功的实验结果。首先种植南瓜属植物，使用添加了完全氮、磷、钾肥料的育苗基质填充尺寸为25厘米×50厘米的50孔育苗盘，肥料中氮、磷、钾含量均为1.38克/千克。接着，将种子播种至与其长度相等的深度，并用育苗基质覆盖种子。

浇水时避免积水，并通过每天浇水一次保持基质湿润。在第二片真叶期结束时，将幼苗移栽至直径30厘米的花盆中，每盆添加三汤匙的复合肥。此后每隔七天，用500毫升液体肥料对每盆施肥一次，该液体肥料由一克含氮、磷、钾各20的肥料（20-20-20）加入一加仑水中配制而成。

将植株置于温室中，在22至28摄氏度温度条件下，按照自然光照周期进行培养。对于蔓生型基因型，应在温室内提供支撑用棚架。当植株自播种后六至八周开始开花时，立即进行人工控制杂交或授粉。

检查花瓣呈黄色的未开放花朵，辨认西葫芦（Cucurbita pepo）和印度南瓜（Cucurbita moschata）品种的雄花和雌花。为防止意外的昆虫授粉，用美纹纸胶带轻轻将闭合的花朵顶端封住。次日上午10:00之前进行授粉，轻轻揭去雄花和雌花上封口的胶带部分。

将雄花的花瓣分离，并通过轻轻摩擦雄蕊将花粉转移到雌花的柱头上。授粉后，立即用胶带封闭授粉后的雌花，并用标签记录授粉日期，标明杂交所用的父本和母本。成功的杂交可通过子房膨大来判断，通常在一周内形成果实雏形。

授粉后45至55天采收果实。配制头孢噻肟母液。使用无菌的0.22微米注射器滤器过滤。

在-20°C保存前，将头孢噻肟配制成每毫升250毫克的溶液，并分装成每份0.5毫升的等份。同样地，制备氨苄青霉素母液，通过无菌的0.22微米注射器滤器过滤，分装成每份1毫升、每毫升100毫克的等份，于-20°C保存。

在1升的瓶子中，将2.45克Murashige和Skoog（MS）培养基溶解于500毫升蒸馏水中以配制MS培养基。向MS培养基中加入1.5克凝胶多糖（gellan gum），并在121摄氏度下高压灭菌20分钟。将瓶子置于50摄氏度的水浴中，使培养基冷却。

在超净工作台内解冻抗生素储备液。将培养基瓶转移至超净工作台，加入0.6毫升头孢噻肟储备液和0.25毫升氨苄青霉素储备液，充分混匀。将约七毫升培养基倒入60毫米×15毫米的无菌培养皿中。

将培养基在培养皿中静置约15至20分钟，使其凝固。用封口膜封闭培养皿，并将其置于室温下的储存盒中备用。通过将瓜果从主藤上剪下进行采收，并在实验室水槽中用液体洗涤剂（如0.3%氯二甲酚）清洗果实表面，对其进行消毒。

用大量自来水冲洗果实，然后用干净的纸巾擦干，再将果实转移至层流净化台内。在净化台内用70%乙醇喷洒果实表面进行消毒。用无菌刀片将果实纵切成两半，并取出种子。

使用无菌镊子或戴无菌手套的手，无菌打开种皮，暴露未成熟胚，然后将其放入含有抗生素的MS培养基的培养皿中。用封口膜密封培养皿，并将其置于温度为25°C、光照周期16小时、相对湿度70%的培养室中。若发生污染，应立即将未污染的胚转接到含有相同培养基的新培养皿中。

在10至14天根系发育后，以及15至21天子叶发育后，将幼苗从培养皿中取出，并用自来水轻轻冲洗掉根部周围的培养基。将清洗干净的幼苗放入一个14厘米×9厘米×4厘米的塑料容器中，并用湿润的纸巾覆盖根部。盖上容器，并在需要时重新润湿纸巾。

将塑料容器保持在25至28摄氏度，并置于16小时光照周期下，使幼苗适应环境，同时维持纸巾的湿润状态。经过7至10天的适应后，将长3至4厘米的幼苗移栽到含有添加肥料的商用育苗基质的50孔育苗盘中，并移至温室。避免过度浇水以防止腐烂，根据需要每孔添加约10至20毫升水。

在第二至第三片真叶期，将幼苗移栽至直径25厘米、装有添加肥料的培养基质的花盆中，并在植株开始开花时进行人工控制杂交。将植株置于温室中，在自然光照条件下维持温度为22至28摄氏度。并对植株的果实和种子性状进行评价。

选择4个西葫芦（Cucurbita pepo）和11个印度南瓜（Cucurbita moschata）进行种间杂交。在尝试的24种不同种间杂交组合中，有22个组合获得了果实，果实坐果率超过92%。其中，基因型为O和M、以及基因型为E和J的印度南瓜与西葫芦之间的杂交未产生成熟果实。

而 Cucurbita moschata 与 Cucurbita pepo 的 F 和 J 基因型杂交组合产生了六个果实。不同杂交组合的授粉花朵数量在 1 至 11 朵之间。授粉成功率范围为 0% 至 100%。在所有杂交组合产生的 44 个果实中，仅有一个来自 Cucurbita moschata 与 Cucurbita pepo 基因型 C 和 J 的杂交果实，获得了可挽救的未成熟胚胎。

对于这些发育不良的胚胎，采用胚胎拯救培养基进行培养，胚胎拯救成功率可达80%。其中两个最关键的步骤是确定两种物种——南瓜（Cucurbita moschata）和西葫芦（Cucurbita pepo）之间可兼容的杂交组合，以及成功实现胚胎再生。由于胚胎拯救技术操作简便且易于重复，全球的葫芦科作物育种人员均可应用该技术，拯救来自不同南瓜属物种间远缘杂交所获得的未成熟胚胎。