Name: 秀丽隐杆线虫长寿的脂质补充和基因转录分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 了解秀丽隐杆线虫脂质补充与基因转录分析方法，通过液体喂养和固体培养策略，结合纵向研究与组织解剖技术，实现小样本RNA提取与神经肽加工基因表达检测，为衰老生物学和脂质代谢研究提供可靠技术方案。

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感谢 P. Svay 提供的维护支持。本研究由以下基金资助：NIH 基金 R01AG045183（MCW）、R01AT009050（MCW）、R01AG062257（MCW）、DP1DK113644（MCW）、March of Dimes 基金会（MCW）、Welch 基金会（MCW）、HHMI 研究员项目（M.C.W.）以及 NIH T32 ES027801 博士前学生奖学金（M.S.）。部分菌株由线虫遗传中心（CGC）提供，CGC 由 NIH 研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。

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</ol>

作者无利益冲突。

脂质补充已被用于衰老研究，以阐明特定脂质种类对健康衰老的直接影响6,7,23,26,27,31。然而，脂质补充实验操作具有挑战性，任何实验间的不一致都可能导致结果不可重复。本文首次记录了详细的分步操作流程，以指导新研究人员避免因技术不精确而产生的潜在问题。本方案中的关键步骤将在下文详细讨论。此外，通过在脂质补充后仅从少量线虫或特定线虫组织中提取RNA，进一步拓展了脂质研究工具箱。在考虑检测转录水平的方法时，针对少量线虫或显微解剖组织进行的qRT-PCR在分析少数转录本或特定组织的转录变化方面表现突出。此外，使用这些方法可省去线虫扩增步骤，从而节省约5至6天的时间。同时，当需要分析大量目标基因时，脂质喂养后进行总RNA提取则是一种更具成本效益且可靠...

脂质 
脂质是可溶于有机溶剂但不溶于水的小型疏水性或两亲性分子1,2。不同的脂质分子根据其碳链中的碳原子数目、双键的位置与数量以及所连接的结构（包括甘油或磷酸基团）而相互区分。脂质在不同细胞内及细胞间发挥关键作用，调控机体功能，例如构成膜双层结构、提供能量储存以及作为信号分子发挥作用3,4。
首先，脂质是生物膜的结构成分，包括质膜以及将细胞内区室与细胞外环境分隔开的细胞内亚细胞膜。其次，脂质是脊椎动物和无脊椎动物体内主要的能量储存形式。中性脂质（包括三酰甘油）可在多种组织中长期储存，例如脂肪组织。在线虫中 秀丽隐杆线虫 肠道是主要的代谢性脂肪储存器官，其功能不仅涉及营养物质的消化与吸收，还参与解毒过程，这一功能类似于哺乳动物肝细胞的活动。其他脂肪储存组织包括生殖系，其中脂质对卵母细胞的发育至关重要，以及由类似皮肤的表皮细胞构成的下皮组织3,5第三，近年来越来越多的证据表明，脂质是重要的信号分子，可通过直接作用于多种受体（包括G蛋白偶联受体和核受体）或间接方式参与细胞内和细胞外信号传导 通过 膜流动性调节或翻译后修饰6,7,8,9未来的研究将继续阐明脂质信号通路在促进长寿和健康寿命中的潜在分子机制。
模式生物对于研究在人类中过于复杂而难以探讨的特定生物学问题具有重要意义。例如，线虫 秀丽隐杆线虫 是进行遗传学分析以解析与人类营养和疾病相关生物学过程的优良模型10高度保守的分子通路与人类生理学密切相关，加之其复杂的组织结构、行为模式以及丰富的遗传操作工具，使得 秀丽隐杆线虫 一种卓越的模式生物11例如， 秀丽隐杆线虫 在开展正向遗传筛选以鉴定表型特异性基因，以及全基因组范围的反向遗传筛选方面具有显著优势 通过 RNA干扰12.
在实验室中，线虫培养于铺有细菌菌苔的琼脂培养皿中 大肠杆菌 细菌，提供作为能量来源和结构单元的宏量营养素，如蛋白质、碳水化合物以及饱和与不饱和脂肪酸，以及作为辅因子和维生素的微量营养素13与哺乳动物类似，线虫可利用棕榈酸和硬脂酸（分别为饱和的16碳和18碳分子）合成脂肪酸，这些脂肪酸经过连续的去饱和和延长反应，生成多种单不饱和脂肪酸（MUFAs）和多不饱和脂肪酸（PUFAs）。14,15,16,17,18有趣的是， 秀丽隐杆线虫 能够 从头合成 合成脂肪酸生物合成、去饱和及延长过程中所需的所有脂肪酸和核心酶，促进长链多不饱和脂肪酸的合成19与其他动物物种不同， 秀丽隐杆线虫 可利用自身的ω-3去饱和酶将18碳和20碳的ω-6脂肪酸转化为ω-3脂肪酸。此外，线虫还具有Δ12去饱和酶，可催化油酸（OA, 18:1）生成亚油酸（LA）20,21大多数动物或植物缺乏Δ12和ω-3去饱和酶，因此依赖膳食摄入ω-6和ω-3以获取其多不饱和脂肪酸（PUFAs），而 秀丽隐杆线虫 不需要膳食脂肪酸22缺乏功能性去饱和酶的突变体已被用于研究特定脂肪酸在不同生物过程中的功能，包括繁殖、生长、寿命和神经传递。通过遗传学方法和饮食补充，可探究单个脂肪酸对特定生物通路的影响。16,17,23迄今为止，脂质研究主要集中在表征与神经系统及发育状况中脂质合成、降解、储存和分解相关的基因24然而，脂质在寿命调控中的作用才刚刚开始被揭示。
脂质信号在寿命调控中的作用 
脂质通过在不同组织和细胞类型中激活细胞信号级联反应，在寿命调控中发挥关键作用。近期研究强调了脂质在调节转录过程和细胞间通讯中的重要作用。 通过 脂质结合蛋白或膜受体识别25此外，膳食脂质补充是研究脂质代谢如何影响寿命的一个极佳工具 秀丽隐杆线虫不同的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸已被证明可通过激活转录因子来促进长寿26,27.
包括胰岛素/IGF-1信号通路和生殖前体细胞消融在内的长寿模型均与单不饱和脂肪酸（MUFA）生物合成途径相关，而补充单不饱和脂肪酸（包括油酸、棕榈油酸和顺式-11-十八碳烯酸）足以延长C. elegans的寿命26。尽管MUFA给药带来的长寿效应仍需进一步研究，但其潜在机制可能由SKN-1/Nrf2转录因子介导，该因子是氧化应激反应和寿命调控的关键激活因子28,29。在单不饱和脂肪酸中，一类称为N-酰基乙醇胺（NAEs）的脂肪酰乙醇胺在炎症、过敏、学习、记忆和能量代谢等多种机制中发挥重要作用30。特别是，一种名为油酰乙醇胺（OEA）的脂质分子已被鉴定为长寿的正向调节因子，它可促进脂质结合蛋白8（LBP-8）向细胞核内转位，从而激活核激素受体NHR-49和NHR-807。补充OEA类似物KDS-5104足以延长寿命，并可诱导参与氧化应激反应和线粒体β-氧化相关基因的表达7,8。
同时，多不饱和脂肪酸（PUFAs）的作用也与寿命调控相关。给予ω-3多不饱和脂肪酸α-亚麻酸（ALA）可通过激活NHR-49/PPARα和SKN-1/NRF转录因子并诱导线粒体β-氧化而促进长寿31有趣的是，α-亚麻酸（ALA）的过氧化产物（称为氧化脂质）能够激活SKN-1/NRF，这表明多不饱和脂肪酸（PUFAs）及其氧化衍生物均可带来延长寿命的益处23补充ω-6脂肪酸花生四烯酸（AA）和二高-γ-亚麻酸（DGLA）可延长寿命 通过 自噬激活，促进蛋白质质量控制，导致废弃和有毒蛋白质聚集体的降解27,32最近，研究发现脂质结合蛋白3（LBP-3）与二高-γ-亚麻酸（DGLA）介导的非细胞自主性信号调控可通过向神经元传递外周信号来促进长寿，提示脂质分子在系统水平上参与组织间远距离通讯的重要作用33本研究报道了在平板上接种细菌或液体培养中细菌悬液进行脂质补充的每一步骤。这些方法可用于评估寿命及转录分析，所用样本为少量线虫的全虫内容物或解剖所得组织。以下技术可适用于多种营养学研究，并为解析脂质代谢如何影响寿命及健康衰老提供有效的工具。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 研磨杵</td><td>Genesee Scientific</td><td>93-165P15</td><td>用于使用 Trizol 研磨线虫</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9639-500G</td><td></td></tr><tr><td>AmfiRivert cDNA 合成铂金预混液</td><td>GenDEPOT</td><td>R5600</td><td>用于从大量线虫样本进行逆转录</td></tr><tr><td>Applied Biosystems QuanStudio 3 实时荧光定量 PCR 仪</td><td>ThermoFisher</td><td>A28567</td><td>用于 qRT-PCR</td></tr><tr><td>Benchmark Scientific StripSpin 12 微型离心机</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1248</td><td>用于离心 PCR 管</td></tr><tr><td>Branson 450 数字超声破碎仪，配备 1/8&quot; 探头</td><td>Branson Ultrasonic Corporation</td><td>100-132-888R</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22620444R</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>Eppendorf vapo protect mastercycler pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td>用于逆转录</td></tr><tr><td>无水乙醇 (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio-One CELLSTAR 12 孔板</td><td>Neta Scientific</td><td>665180</td><td>用于液体饲喂的 12 孔板</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 培养皿，聚苯乙烯，100 × 20 mm</td><td>Neta Scientific</td><td>664161</td><td>用于细菌 LB 平板和线虫 10 cm NGM 平板</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 培养皿，聚苯乙烯，60 × 15 mm</td><td>Neta Scientific</td><td>628161</td><td>用于线虫 6 cm NGM 平板</td></tr><tr><td>Invitrogen 无核酸酶水</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>盐酸左旋咪唑</td><td>VWR</td><td>SPCML1054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;lipl-4Tg&lt;/em&gt;</td><td>MCW 实验室</td><td>N/A</td><td>转基因 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;lipl-4Tg;fat-3(wa22)&lt;/em&gt;</td><td>MCW 实验室</td><td>N/A</td><td>转基因 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>LB 培养基干粉</td><td>ThermoFisher</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁 (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate 光学 96 孔快速透明反应板（带条形码）</td><td>ThermoFisher</td><td>4483354</td><td>96 孔 qPCR 板</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学密封膜</td><td>Applied BioSystem</td><td>4311971</td><td>用于密封 96 孔 qPCR 板</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10 超纯水系统</td><td>Sigma</td><td>Z00Q0V0WW</td><td>用于配制所有试剂（包括缓冲液和培养基）的去离子水，除非实验方案中特别注明使用无核酸酶水</td></tr><tr><td>N2</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心</td><td>N/A</td><td>C. elegans 野生型分离株</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 分光光度计</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td>用于测定 RNA 浓度</td></tr><tr><td>OP50</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心</td><td>N/A</td><td>用作 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 食物的细菌</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾三水合物 (K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td>P5504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>P0662-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green cells-to-Ct 试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4402953</td><td>用于从少量线虫或线虫组织进行逆转录和 qPCR</td></tr><tr><td>Power SYBR Green 预混液</td><td>ThermoFisher</td><td>4367659</td><td>用于从大量线虫样本进行 qPCR</td></tr><tr><td>Pure Bright 杀菌型超浓漂白剂&amp;nbsp;</td><td>KIK International LLC.</td><td>59647210143</td><td>6% 家用漂白剂，用于线虫卵的制备</td></tr><tr><td>Pyrex 九孔凹面培养皿</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td>用作解剖线虫的观察皿</td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 去污染溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td>S9390-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R 离心机</td><td>Thermo</td><td>7500-4337</td><td>用于收集细菌</td></tr><tr><td>Thermo Sorvall ST 8 离心机</td><td>Thermo</td><td>7500-7200</td><td>用于线虫卵的制备</td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>TheroFisher</td><td>15596018</td><td>RNA 提取试剂</td></tr><tr><td>Turbo DNA-free 试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>用于去除 RNA 提取中的 DNA 污染</td></tr><tr><td>Vortexer 59 涡旋振荡器</td><td>Denville Scientific INV</td><td>S7030</td><td></td></tr><tr><td>VWR 一次性研磨棒及无线电机</td><td>VWR</td><td>47747-370</td><td>用于使用 Trizol 研磨线虫</td></tr><tr><td>VWR 动能 26 焦耳迷你离心机 C1413 V-115</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>用于收集线虫。已停产型号，VWR 提供类似型号，货号 76269-064</td></tr><tr><td>线虫挑取针</td><td>WormStuff</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

脂质补充对寿命延长及基因转录分析的影响 秀丽隐杆线虫

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

衰老是一个复杂的过程，其特征是由于环境和遗传因素共同作用而导致的渐进性生理变化。脂质在构成细胞膜的结构组分、能量储存以及作为信号分子方面具有关键作用。调控脂质代谢和信号传导对于激活不同的长寿通路至关重要。线虫Caenorhabditis elegans是解析脂质代谢和信号传导在长寿调控中作用的理想且强大的模式生物。已有大量研究报道，通过饮食补充特定的脂质分子可延长C. elegans的寿命；然而，补充条件的微小差异可能导致不同实验室之间实验结果的重复性问题。本文报道了两种针对C. elegans的详细脂质补充方法，分别采用在培养板上接种含脂质的细菌或在液体培养中使用细菌悬液进行补充。同时，本文还提供了在整个生命周期中进行脂质补充的寿命测定实验以及利用少量线虫的全虫裂解物或显微解剖组织进行qRT-PCR分析的具体操作步骤。结合长期观察与脂质补充后的转录水平研究，这些饲喂实验为解析脂质如何影响寿命和健康衰老提供了可靠的技术手段。该方法还可适用于多种营养筛选策略，用于评估少量显微解剖组织或少数个体中特定转录本的变化情况。

通过补充脂质后使用少量完整线虫验证转录水平变化 
为了探究从少量完整线虫中提取 RNA 并将其逆转录为 cDNA 的实验方案是否具有可重复性，并且能否与大量线虫样本的数据进行比较，采用了一种过表达溶酶体酸性脂肪酶的长寿线虫品系 lipl-4 在肠道中被采用7,8,33,35神经肽加工基因的转录诱导 egl-3 和 egl-21 既往研究中已有报道7,8,33 已验证（图2A，B这一诱导结果表明，从少量动物中提取RN...

本实验方案描述了在线虫 Caenorhabditis elegans 的液体培养和平板培养中添加脂质的方法，并结合对大量或少量线虫及其组织的纵向研究和基因转录分析。

衰老是一个复杂的过程，其特征是由于环境和遗传因素共同作用而引起的进行性生理变化。脂质是……

本实验方案描述了在模式生物秀丽隐杆线虫（C.elegans）中，结合纵向分析和转录组分析的两种脂质补充策略。该技术阐述了如何利用少量线虫或显微解剖获得的线虫组织进行转录组变化检测，并介绍了如何将液体饲喂法与水相技术相结合应用于虫群培养。由于实验操作的时间窗口较短，为获得充分的转录组分析结果，操作人员必须熟练掌握组织解剖技术。首先，将过夜培养的OP50菌液在室温下以4,000 G离心10分钟，收集细菌。弃去上清液。将菌体沉淀用20毫升细菌稀释液、饮食限制液或BDR基础液通过涡旋振荡重悬，然后再次重复离心10分钟。弃去上清液后，用BDR培养基重悬菌体沉淀，制备20 X BDR细菌储备液。使用前，用BDR培养基将细菌储备液稀释至5X。以乙醇或二甲基亚砜作为溶剂，在新的灭菌玻璃小瓶中配制脂质储备溶液，并向瓶中充入氩气或氮气以防止氧化。将脂质储备液转移至BDR细菌溶液中，以达到摄食条件下所需的目标终浓度。涡旋振荡20秒使其充分混匀。通过将等体积的过滤乙醇或二甲基亚砜与BDR细菌混合，制备相应的溶剂对照。通过将所需量的脂质或溶剂对照加入含三个至四个重复的12孔板的每个孔中，进行脂质补充和液体培养。将同步化的秀丽隐杆线虫（Caenorrhabditis elegans）悬浮液与5X BDR细菌按1:1比例混合，使线虫终浓度为每毫升1,500条，细菌终浓度为2.5X。然后将两毫升的线虫-细菌混合液转移至12孔板的每个孔中。操作完成后，用锡箔纸包裹12孔板，并在20摄氏度培养箱中以100 RPM的转速振荡培养至所需时间。进行脂质补充时，将1毫升经脂质处理的细菌接种至10厘米线虫生长培养基（NGM）琼脂平板的中央。当处理大量平板时，在接种两个平板之间需对终工作液多次涡旋混匀。在生物安全柜内的避光条件下将培养皿干燥。将3000条线虫从同步化线虫培养物转移至10厘米培养皿中。在生物安全柜中干燥培养皿，直至原本在添加脂质的培养皿上游泳的线虫开始爬行。干燥后，将脂质处理过的培养板置于20摄氏度的培养箱中孵育所需的时间；若使用多不饱和脂质，需避免光照。在PCR管中，将0.2微升DNase I与19.8微升裂解液混合，充分混匀（上下吹打五次），为每个样品配制20微升的终末裂解液。为从少量完整线虫中提取RNA，需去除细菌：将15至20条线虫从细菌菌苔转移至一块新鲜的未接种NGM培养板上。从无菌NGM平板中转移15至20条线虫至含有20 µL新鲜配制的终末裂解液的PCR管中，尽量减少带入细菌。在室温下孵育裂解反应5分钟。孵育结束后，将样品置于冰水浴中，使用探头超声仪对线虫进行4次超声处理，每次5秒，振幅30%，每次超声之间脉冲间隔15秒。在向裂解反应中加入2 µL终止液之前，先将PCR管在室温下孵育5分钟，然后通过轻轻敲击混匀。将反应在室温下孵育两分钟，然后将试管置于冰上。为了从线虫组织中提取 RNA，从细菌菌苔上挑取约 20 条线虫，转移到新鲜未接种的 NGM 平板上以去除线虫表面的细菌。将约 20 条尽可能少带细菌的线虫转移至含有 500 µL M9 溶液（含 4 µM 左旋咪唑）的表玻璃皿中。当线虫被固定后，使用可连接至1毫升注射器的25号针头解剖其生殖腺或肠道。用已灭菌的玻璃移液管将解剖得到的组织转移至PCR管中，并将PCR管置于冰上静置2分钟，使组织材料沉降至管底。在加入20 µL终末裂解液前，先移除PCR管中的上清液，然后通过轻弹管壁充分混匀。将裂解反应孵育5分钟后，加入2 µL终止液，并多次轻弹管壁。继续孵育2分钟，随后进行逆转录。在验证研究中，从大量群体和少量线虫中提取的RNA均显示出神经肽加工基因egl-3和egl-21相似的诱导表达。这表明，从少量线虫中提取RNA可作为从大量群体中进行标准cDNA合成技术的有效替代方法。在补充了二高-γ-亚麻酸（DGLA）的lipl-4转基因线虫的解剖肠组织中，神经元的神经肽加工基因未被诱导。在fat-3基因敲低的情况下，不同浓度的DGLA补充均能挽救线虫寿命的延长。补充脂质的线虫也可用于RNA测序、蛋白质组学、代谢组学和行为学研究，以鉴定在这些特定条件下的其他表型。该方法可应用于衰老研究、脂质生物学以及任何旨在建立特定表型与营养因子或代谢物之间关系的研究领域。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

秀丽隐杆线虫长寿的脂质补充和基因转录分析

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代谢失活细菌的方法学 秀丽隐杆线虫 研究

了解秀丽隐杆线虫脂质补充与基因转录分析方法，通过液体喂养和固体培养策略，结合纵向研究与组织解剖技术，实现小样本RNA提取与神经肽加工基因表达检测，为衰老生物学和脂质代谢研究提供可靠技术方案。

脂质补充对寿命延长及基因转录分析的影响秀丽隐杆线虫

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