结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

该方法中，力直接作用于细胞核。这使得力的传递效应与细胞质膜和细胞骨架分离，从而揭示细胞核机械感知的分子机制。该力以非侵入性方式在活细胞内施加。

与光镊相比，磁场和磁力不会影响细胞功能，且通量更高。开始用磁性微珠培养细胞时，称取0.2克平均直径为七微米的羰基铁微珠。使用移液管将微珠悬浮于一毫升RPMI 1640培养基中。

然后将含有 B2B 细胞的培养皿移至生物安全柜中，迅速向培养皿中加入 200 µL 含有微珠的培养基。将培养皿放入培养箱中，直至细胞完全内吞微珠。打开倒置显微镜，利用共聚焦荧光成像技术，每 6 小时观察一次微珠、细胞核及细胞边界的形态，以确定不同细胞系内吞微珠的最佳时间。

内化的微珠将位于细胞边界内。对于小力施加和活细胞成像，打开软件应用程序 Elements。要定义磁性搜寻的配置，请单击“二分之一”按钮，将扫描速度设置为每两秒一帧。

将针孔大小设置为1.2艾里单位。仅勾选FITC通道，将PMT高压设为70，偏移设为零，激光强度设为10。为定义配置磁性YAP核，点击“1/4”按钮，将扫描速度设为每四秒一帧。

然后单击 1.2 Airy 单位按钮，将针孔大小设置为 1.2 Airy 单位，并选中 FITC 通道。将 PMT 高压设为 70，偏移设为零，激光强度设为 10。为成像细胞核边界和核染色强度，请选中 cyanine 5 通道。

不要点击1.2 Airy单位按钮，并将PMT高压设为70，偏移设为零，激光强度设为10。针孔尺寸将针对三维YES相关蛋白成像进行优化。接下来，通过Elements开启DIA。

打开旋转视图，使用明场调节物镜焦距，获得清晰对焦的细胞图像。先使用10倍物镜寻找三种条件下合适的单个细胞：细胞内含有单个微珠、细胞内含有多个微珠，以及细胞内不含任何微珠。然后切换至40倍物镜，并将此位置命名为相应的位点编号。

打开 Elements，点击磁性查找，解除联锁，然后扫描标签，接着选择顶部和底部按钮以调整焦平面的 Z 位置，设定所选细胞 Z 层叠的下限和上限。再次点击扫描以停止扫描。切换到磁性 YAP 核配置，并将文件名设置为 before_small_force.nd2。

单击运行按钮以播放已记录的Z轴层扫图像。切换到右侧光路并打开DIA。打开旋转视图，然后单击录制按钮。

通过旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁移至培养皿底部上方46毫米处。保存并检查视频，以确认磁力诱导的微珠位移。将文件名设置为after_small_force.nd2，重复扫描程序。

接下来，切换到右侧光路，打开微分干涉相差（DIA）模式，并在点击录制按钮前开启旋转载物台视图。旋转磁体移动装置的旋钮，使磁体升至培养皿底部上方120毫米处，然后保存明场图像序列或视频。通过将文件名设置为before_large_force.nd2，重复上述扫描步骤。

微珠在FITC或氰基5通道的激光激发下不能发射荧光。因此，通过观察YAP蛋白和细胞核荧光共聚焦成像中的暗色空心区域来识别被细胞内吞的微珠。细胞核圆度在对照组细胞与内吞微珠的细胞之间无显著差异。

与微珠共培养但未发生内化的对照细胞，以及发生微珠内化的细胞，其YES相关蛋白的细胞核与细胞质比例也无显著差异。在含有细胞骨架的细胞中，微珠施加的压缩力导致了细胞核变形和肌动蛋白去聚合。定量成像分析的校准曲线由定量原子力显微镜（AFM）力-位移关系提供。

基于这一关系，估算了磁珠施加的力。在施加或释放磁力时，观察到细胞核变形以及YES相关蛋白的转位。绿色荧光通道中YES相关蛋白信号强度的变化，以及红色荧光通道中细胞核染色无变化，证实了磁力诱导的细胞核变形触发了YES相关蛋白的转位。

对两组细胞中YES相关蛋白核质比的净变化进行定量分析，结果证实，施加于细胞质内磁性微珠的磁力可诱导YES相关蛋白的转位，并改变YES相关蛋白的核质比。在施加力和成像之前，需确保细胞已将磁性微珠内化，且微珠位于细胞边界内。