用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构筑单元的微流控合成

高通量制备用于微孔退火颗粒支架的单一分散微凝胶构建单元，可增强对支架孔隙率的控制，从而影响孔径大小及后续的组织整合效果。本方案采用高通量微流控方法，生成其他方法（如流动聚焦微流控、批量乳化法和电喷雾法）无法实现的大体积单一分散微凝胶。

生成的微凝胶可形成微孔退火颗粒支架，由于具有细胞尺度的孔隙率，可实现快速组织生长，因此在再生医学应用中具有优势。首先，为每个PDMS微流控装置准备一块玻璃载片。使用胶带、过滤空气或异丙醇清洗，以去除载片上的任何灰尘。

将一块载玻片和一个PDMS装置设计的载玻片并排放置在96孔板盖上，然后放入等离子清洗仪中。关闭门和气流阀，启动真空泵。运行至少30秒后，关闭真空泵。

将氧气罐的气体管路连接至气流阀。让等离子腔体充入氧气30秒，然后关闭氧气并关紧气流阀。打开真空泵，并将射频功率调至高位。

等待腔室变为紫粉色，并持续30秒。计时结束后，关闭等离子体和真空，然后缓慢打开气流阀以释放真空。从等离子清洗仪中取出托盘。

轻轻将PDMS装置翻转到玻片上，使其粘合。粘合过程中，注意观察PDMS透明度的微小变化。为获得最佳效果，将粘合好的装置在60°C下保存，直至使用前立即取出。

通过稀释PFOCTS和Novec油来配制表面处理液，每三至四个装置使用一毫升。将该体积转移至一毫升注射器中，并连接25号针头。每个装置准备一段10至12厘米长的Tygon管。

截取一段长约一英寸的PEEK管。将PEEK管的两端各插入几毫米至Tygon管末端，以防止针头刺穿Tygon管的入口。将装置从加热室中取出，并将Tygon管非PEEK端插入水相入口孔中。

将表面处理注射器的针头插入PEEK管中，并覆盖油室出口孔。缓慢注入处理液，确保液体充满装置且无气泡。先等待水相室充满，随后是较细的通道，最后是油室。

从设备上取下Tygon管。设备充满后，在室温下静置10分钟。用仅含油的5毫升注射器抽取油液，并连接25号针头。

通过入口和出口将表面处理液从装置中吸出。将Tygon管插入水相入口。将装有油的注射器插入PEEK管，用油冲洗每个装置。

吸出装置中的油。重复油冲洗两次，并移除Tygon管。将Tygon管的非PEEK端插入微流控装置的入口。

将另一段未连接PEEK管的Tygon管插入微流控装置的出口。向一个5毫升塑料注射器中加入至少3毫升油，并将其连接到25号针头上。小心地将针头插入其中一段Tygon管入口的PEEK管中。

用油轻轻冲洗管路和装置。用锥形管收集出口处的油。对另一根Tygon进样管重复进行油冲洗。

将注射泵设置为所需的流速。使用25号针头将含有表面活性剂的注射器连接至油相入口，并缓慢注入足够的油以润洗管路及微流控装置的油相通道。一旦装置和油相入口准备就绪，向一支新的5毫升注射器中加入0.5毫升油，该注射器将用于盛装凝胶前驱体。

使用少量油帮助将前体溶液冲洗通过微流控装置。在锥形管中，加入1.5毫升PEG主链溶液和1.5毫升交联剂溶液。涡旋混合30秒，迅速将混合后的凝胶前体溶液转移至5毫升注射器中。

将装有凝胶前体溶液的注射器通过25号针头连接至水相入口。轻轻排出足够的溶液以润洗管路和水相通道。将注射器固定在注射泵上，然后启动运行。

从通道中观察大小均匀的颗粒。用锥形管从出口收集微凝胶。凝胶完成后，使用移液器小心地从管底去除油相。

将此物放入指定的含氟废物容器中。向微凝胶收集管中加入更多油。通过轻轻倒置收集管进行混合。

将收集管静置5分钟，使两相充分分离。观察底部的油相和顶部的水相微凝胶层。至少再重复油相洗涤两次。

按照之前的方法向凝胶中加入更多油，然后向凝胶中加入PBS。颠倒混匀数次。为分离各层，将离心管在2,000 RCF下离心约30秒。

观察离心管底部的油相、中间的凝胶层和顶部的 PBS。用移液器移除油相，并弃入废液容器中。重复油相和 PBS 洗涤两次。

在最后一次洗涤结束时，观察凝胶由不透明变为透明。去除所有油分，但不要从锥形管中移除 PBS。

在化学通风橱中，使用玻璃移液管向试管中加入与 PBS 等体积的己烷。涡旋混匀锥形管 30 秒，或直至充分混合。在 4,696 RCF 条件下离心 5 分钟。

分离后，观察上层为己烷，中层为磷酸盐缓冲液（PBS），底层为凝胶。移除上层己烷并弃置于有机废液容器中。用吸管吸除PBS层。

用 PBS 中的正己烷重复洗涤至少两次，直至凝胶几乎变为半透明。再用 PBS 洗涤一次，以去除残留的正己烷。在 4,696 RCF 下离心五分钟，并吸除 PBS 层。

约67-75%的20千道尔顿PEG马来酰亚胺被修饰上甲基丙烯酰胺功能基团，以确保较高的退火效率。修饰百分比通过分析1H NMR谱图峰确定。凝胶化的起始时间提供了关于微流控微凝胶生成持续时间的信息。

建议选择凝胶前体的 pH 值，使其在 30 分钟至两小时内启动凝胶化过程。纯化和溶胀后，微凝胶具有均匀的尺寸，多分散指数介于 1.00 至 1.02 之间，定义为单一分散体系。退火后，微凝胶形成多孔支架结构，可通过双光子显微镜观察。

正确地将PDMS装置键合到玻璃载片上，并对装置进行正确的表面处理，对于实现最佳的微流控装置性能至关重要。该技术可快速制备均匀的微凝胶构建单元，用于形成可用于多种体内再生应用（包括伤口愈合）的支架结构。