Name: 受精卵显微注射用于在小鼠中产生基因盒敲入和絮状等位基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学习利用CRISPR-Cas9和供体DNA对小鼠受精卵进行显微注射的技术，以高效产生基因盒敲入和条件性等位基因小鼠。该方法适用于神经科学、免疫学等多种研究领域的体内基因功能研究。

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本工作得到了科学研究（B）（19H03142：SM）、科学研究（A）（20H00444：FS）、科学研究（A）（21H04838：SM）以及创新领域科学研究项目的支持 &#34;高级动物模型支持平台&#34; （16H06276：致 ST）来自日本文部科学省。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写中未发挥任何作用。我们感谢 Ryoichi Mori 在基因组编辑设计方面提供的有益讨论。

所有动物实验均依照日本文部科学省管辖下的学术研究机构动物实验适当实施基本指南，以及筑波大学动物实验规定，在获得筑波大学机构动物实验委员会批准后人道地进行。选用10至25周龄的C57BL/6J小鼠（两性均有）作为受精卵供体，选用10周龄以上的ICR小鼠作为受体小鼠。小鼠购自商业来源（见材料表）。
1. 在无细胞系统中验证crRNA的切割活性
<ol>
	<li>将2 nmol的crRNA（干粉）和20 nmol的tracrRNA（干粉）分别溶解于25 µL和250 µL无RNase的水中（参见材料表）。 
	注意：使用CRISPOR（参见材料表）选择预测具有高切割活性且脱靶效应尽可能少的CRISPR靶序列。在进行基因盒插入（knock-in）时，应选择跨越插入位点的序列作为靶点。用于添加loxP位点的外显子（s）可通过KOnezumi工具（参见材料表）进行选择。</li>
	<li>通过基因组PCR9扩增包含靶位点的DNA片段（约0.5–1 kb）。使用常规PCR产物提取试剂盒纯化该PCR扩增产物（参见材料表）。</li>
	<li>配制10 µL CRISPR反应混合液（其中crRNA浓度为100 ng/µL，tracrRNA浓度为150 ng/µL，Cas9浓度为1 ng/µL，溶于Cas9核酸酶反应缓冲液中，参见材料表）。为形成CRISPR-Cas9复合物，将上述混合液置于37 °C恒温金属块中孵育30分钟。</li>
	<li>将步骤1.3中配制的全部CRISPR混合液（10 µL）加入步骤1.2所述的PCR产物（10 µL，20 ng/µL）中，于37 °C孵育1小时。随后加入1 µL RNase（500 ng/µL），在37 °C继续孵育30分钟以降解crRNA和tracrRNA，因电泳过程中必须去除RNA。使用含有十二烷基硫酸钠（2% w/v）的上样染料对上述样品进行电泳分析。 
	&#8203;注意：极少数情况下会观察到无切割活性的crRNA。若出现此类情况，建议重新设计基因编辑方案。</li>
</ol>
2. 准备用于受精卵显微注射的crRNA、tracrRNA、Cas9蛋白和供体DNA混合物
<ol>
	<li>制备CRISPR溶液（在无RNase的水中配制，含50 ng/µL crRNA、200 ng/µL tracrRNA和200 ng/µL Cas9）。同时制备供体DNA溶液（20 ng/µL 自行构建的质粒DNA载体）。
	<ol>
		<li>将供体DNA溶液通过孔径为0.22 µm的无菌注射器滤器过滤。取等体积的CRISPR溶液与过滤后的供体DNA溶液混合，确保最终浓度为25 ng/µL crRNA、100 ng/µL tracrRNA、100 ng/µL Cas9和10 ng/µL 供体DNA。此混合液后续称为RNPD。 
		注意：在切割两个位点时（例如构建条件性基因敲除小鼠），每种crRNA的浓度必须为25 ng/µL。供体DNA为环状质粒DNA，可使用常规质粒小提旋转柱试剂盒进行纯化（参见材料表）。配制好的溶液需置于冰上，并尽快用于显微注射。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过自然交配获得小鼠受精卵
<ol>
	<li>在显微注射前3天，向C57BL/6J雌性小鼠（10–25周龄）皮下注射5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG，参见材料表）。约46–48小时后，腹腔注射5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG，参见材料表）。将经PMSG和hCG处理的雌性小鼠与雄性C57BL/6J小鼠合笼饲养，并于次日早晨检查阴道栓。 
	注：每只C57BL/6J雌性小鼠可获得约15–25个受精卵。时间线见图1。</li>
	<li>准备两个35 mm的培养皿用于受精卵培养，如图2所示。将其置于培养箱中（37 °C，5% CO2），直至使用。可过夜保存。</li>
	<li>通过颈椎脱位法处死已确认有阴道栓的雌性小鼠，并用小型剪刀从下腹部正中切开皮肤和肌肉层，直至肋骨下方。 
	注：安乐死操作应遵循当地动物伦理委员会的建议。</li>
	<li>取出输卵管并置于培养皿盖上的20 µL M2培养基液滴中，该液滴含0.75 mg/mL透明质酸酶（参见材料表）。用尖头镊子夹住一条输卵管，通过伞部灌注约50 µL含透明质酸酶的M2培养基。 
	注：此时受精卵周围松散地包裹着大量卵丘细胞。</li>
	<li>30秒后，用玻璃毛细管吸取少量培养基，挑取形态正常的受精卵，并将其转移至新鲜的M16培养基液滴中进行清洗。将清洗后的受精卵转移至培养皿（图2）中集中存放。 
	注：时间线见图1。形态正常的受精卵应具有雄性和雌性原核以及两个极体，且未明显破坏球形结构15。受精卵的形态在不同品系和物种间存在显著差异。</li>
	<li>重复步骤3.3和3.4，直至获取全部受精卵。每个培养皿中的M16液滴可汇集约100个受精卵。将培养皿存放于培养箱中（37 °C，5% CO2），直至进行显微注射。</li>
</ol>
4. 显微注射针的制备
<ol>
	<li>使用可编程的拉针仪（见材料表）制备一些玻璃毛细管。
	 
	注：显微注射针必须具有细小的尖端和较长的锥形部分。如果拉针仪具有用于胞质内单精子注射的程序，则该程序也可用于制备显微注射针。</li>
	<li>通过撞击微加工仪尖端附着的玻璃球来打断显微注射针的尖端。确保显微注射针尖端直径约为 1 µm。在显微镜下以 1000 倍放大倍数检查针尖尺寸。</li>
	<li>使用微加工仪在距离显微注射针尖端约 2–3 mm 处将其弯曲。
	 
	&#8203;注：弯曲角度取决于显微操作仪的设置。过度弯曲会降低压电脉冲的效果。</li>
</ol>
5. 合子显微注射
<ol>
	<li>将1-1.5 cm的操作液（用于替代汞以实现压电效应打孔的惰性液体，参见材料表）注入显微注射针的中心，并将其安装到带有压电驱动器的手动显微注射仪固定架上。
	<ol>
		<li>随后，将持卵针安装至另一侧的手动显微注射仪固定架上。通过逐渐加压，将操作液移至显微注射针尖端。将两个手动显微注射仪固定架牢固地固定在显微操作仪上。 
		注：在50倍显微镜下可观察到显微注射针尖端有操作液流出。调整液滴大小后，施加压电脉冲时可观察到液体飞溅，表明压电脉冲有效。若无法确认此现象，需重新制备显微注射针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备一个含有三个液滴的注射腔：（1）10 µL M2培养基；（2）5 µL含12%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的M2培养基；（3）5 µL crRNA、tracrRNA、Cas9蛋白和供体DNA（RNPD）溶液的混合物。以与步骤3.2相同的方式用矿物油覆盖各液滴，并将注射腔置于倒置显微镜载物台上。
	<ol>
		<li>在倒置显微镜50倍放大下，将显微注射针插入12% PVP液滴中。反复吸入并推出12% PVP，以清洗显微注射针尖内部，随后将其转移至RNPD液滴中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将手动显微注射仪调至负压，将RNPD溶液吸入显微注射针中。静置数分钟，直至吸入足够体积；在50倍显微镜下观察，确保液体充满显微注射针内部。
	<ol>
		<li>停止吸入，将手动显微注射仪调至正压，使RNPD溶液缓慢排出。将显微注射针尖移入油层中。 
		注：逆时针旋转手动显微注射仪旋钮以进行吸入。停止吸入时，顺时针旋转旋钮，并在显微镜下观察的同时逐渐增加压力，使RNPD溶液缓慢排出。通过观察显微注射针内液面移动，可确认液体流出情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将50个受精卵放入M2液滴中，并轻轻将持卵针插入同一液滴。将显微注射针转移至含有受精卵的M2液滴中。切换至20倍物镜，并对焦于显微注射针尖端。 
	注：每次放置的受精卵数量应控制在10分钟内可完成注射的范围内。</li>
	<li>使用显微操作仪移动持卵针固定受精卵，并对焦于原核。将显微注射针插入受精卵，使针尖接近原核。当针尖到达原核膜时，施加压电脉冲（强度：6-10，速度：1）以穿透膜结构。
	<ol>
		<li>当显微注射针刺入原核后，立即注入RNPD溶液，并观察原核的膨胀现象。一旦原核完全膨胀，迅速拔出注射针。对雌性和雄性原核均执行相同操作。 
		注：注射引起的原核膨胀可在显微镜下清晰观察到。膨胀程度难以用语言精确描述，但可参考既往文献15进行判断。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将已注射的受精卵移至M2液滴中的另一位置，以便区分注射前后的受精卵。</li>
	<li>重复步骤5.5–5.6，直至M2液滴中所有受精卵完成注射。注射完成后，将受精卵转移至新的M16培养皿中。</li>
	<li>注射后10分钟挑选存活的受精卵。去除因注射损伤而裂解的受精卵，并将存活的受精卵分配至M16培养皿中的各个液滴。每个液滴应包含20–24个受精卵，以供一只假孕雌鼠使用。此举可减少胚胎移植过程中M16培养皿在孵育箱外暴露的时间。 
	&#8203;注：在最佳注射条件下，受精卵存活率可达90%–95%。该数值取决于注射针尖大小、压电脉冲强度以及RNPD溶液的流出压力。</li>
</ol>
6. 胚胎移植至输卵管
<ol>
	<li>为获得假孕小鼠，将每只处于动情前期的ICR雌鼠与一只输精管结扎的ICR雄鼠进行合笼交配。次日检查阴栓。 
	注意：每20对交配小鼠可获得约15只假孕小鼠。</li>
	<li>注射三种混合麻醉剂（0.2 mg/kg 右美托咪定、4.0 mg/kg 咪达唑仑和 2.5 mg/kg 丁丙诺啡，参见 材料表) 皮下注射至假孕雌性小鼠体内。通过观察呼吸频率降低以及尾夹和后肢足底回缩反射消失来确认麻醉效果。根据当地动物伦理委员会的建议，使用眼用软膏润滑小鼠眼睛。</li>
	<li>将小鼠置于俯卧位，用剃刀剃除背部区域的毛发，并使用碘伏或氯己定消毒液与酒精交替对术区进行三次消毒。随后用小型解剖剪沿脊柱方向在背部皮肤做约1厘米的切口。</li>
	<li>将背部切口向腹侧一侧移动，切开肌肉层直至可见卵巢，用镊子夹住卵巢上方的脂肪组织，牵出卵巢、输卵管和子宫。
	<ol>
		<li>用止血钳固定脂肪组织（参见 材料表将生殖组织置于无菌纱布上，以避免与外套直接接触。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下顺序，将少量培养基（M2 或 M16）、若干气泡作为标记物以及受精卵依次放入用于转移的移液管中。 
	注意：每个输卵管转移约10-12个受精卵。</li>
	<li>使用微型剪刀进行切口（参见 材料表在输卵管壶腹部与伞部之间（长度恰好允许玻璃移液管进入）做切口，将受精卵注入切口，同时确认已引入气泡。</li>
	<li>以相同方式将胚胎移植到另一侧输卵管（步骤6.6）。</li>
	<li>用自动缝合钉缝合外层皮肤（参见 材料表). 
	&#8203;注意：除非切口不可避免地过大，否则不要缝合切开的肌肉层。理想的肌肉层切口大小应小于2-3 mm。如果切口大于5 mm，则应使用无菌缝合针和缝合线缝合肌肉层（参见 材料表).</li>
</ol>
7. 动物恢复
<ol>
	<li>皮下注射盐酸阿替美唑（0.3 mg/kg）给小鼠。 
	注意：术后镇痛应遵循当地动物伦理委员会的建议。</li>
	<li>然后将小鼠放入笼中，并置于37 °C的加热板上保持温暖。</li>
	<li>待小鼠苏醒后，继续保温约2小时。确认小鼠无异常行为后，将笼子放回饲养架。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本研究中，采用自然交配获得的C57BL/6J小鼠受精卵（未经冻融处理）用于基因组编辑小鼠的制备。通过在细胞周期中最有利于基因敲入发生的时相，将crRNA-tracrRNA-Cas9复合物和供体DNA（RNPD）同时注射到这些受精卵的两个原核中，实现了基因盒敲入和条件性基因敲除（floxed）小鼠的高效出生率及充分的基因组编辑效率。本研究进一步增强了SPRINT-CRISPR方法15的适用性，证明该方法即使在C57BL/6J遗传背景下也能确保足够的敲入效率，并可应用于条件性基因敲除小鼠的制备。
由于实验设备成本较低且技术易于掌握，电穿孔法是一种广泛应用的基因组编辑小鼠制备方法8。此外，i-GONAD 方法19可在存在于输卵管中的着床前胚胎上直接进行基因组编辑，无需使用受体小鼠。与这些方法相比，本文所介绍的方法在硬件和软件两方面准备和维持实验环境时成本较高且耗时较长。然而，一旦实验设施建立完毕，仅需使用市售的CRISPR元件（crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白）以及少量简单的环状质粒载体作为供体DNA，即可实现复杂基因盒的定点插入（knock-in）和条件性基因敲除（floxed）小鼠的制备。这意味着在制备过程中，无需耗时（或相对昂贵）的长单链寡核苷酸（lsODN）5,6或腺相关病毒载体20，便可大量构建复杂的基因组编辑小鼠品系。
与原始的 SPRINT-CRISPR 方法不同15，使用新鲜（冻融后）的受精卵。通过自然交配获得新鲜受精卵时，可忽略在冻融过程中可能产生的技术误差 体外 受精或冷冻与解冻。此外，胚胎操作过程可在约半天内完成（图1）采用当前方法。另一方面，本方法的一些局限性包括需要较多雄性小鼠、受精时间的控制较为宽松，以及难以完全准确预测可用于显微注射的受精卵数量。与原始的SPRINT-CRISPR方法相比，该方法可能具有更高的出生率表1尽管如此，由于实验操作者、靶基因、遗传背景以及胚胎确认时间的不同，尚不能得出本方法在出生率方面更优的结论。
如表1所示，在大多数基因盒敲入项目中，大量小鼠存在随机整合等位基因。必须消除随机整合，因为它可能导致内源基因的意外破坏以及转基因的异位表达。未来面临的挑战是找到能够减少随机整合事件数量，同时保持足够敲入效率的实验条件。
几乎所有利用导致DNA双链断裂的基因组编辑效应因子进行的小鼠受精卵基因组编辑，都可能在靶位点诱导意外的突变9,21。本文未描述这些意外靶向突变的结果，因为我们目前不具备管理下一代小鼠以提供明确证据的条件。排除由意外靶向诱变引起混淆的最佳方法是将首建鼠（founders）与野生型小鼠交配，而不是首建鼠之间相互交配。原则上，由此杂交产生的N1代小鼠在等位基因的一侧为野生型（WT），因此如果检测到预期的敲入（KI）等位基因，则它们为WT/KI杂合子。因此，在生命周期相对较短且繁殖能力强的实验小鼠中，靶向位点的意外诱变并非严重问题。然而，当该技术应用于体型较大的哺乳动物时，仍需进一步改进。
已证实该技术可在除C57BL/6J以外的近交系小鼠中制备基因盒敲入小鼠，但目前相关项目数量不足，且数据变异程度较高。因此，本研究未包含此类信息。认为有必要对此开展进一步研究，以推动小鼠遗传学与疾病模型研究的发展。

基因敲入小鼠，即在目标位点引入预期外源基因的小鼠，被广泛应用于多个研究领域 体内 基因人源化小鼠、荧光报告小鼠和Cre驱动小鼠的研究1,2在小鼠合子中通过基因组编辑诱导敲入突变时，使用单链DNA（单链寡核苷酸DNA供体，ssODN）或双链DNA（dsDNA）作为供体DNA2,3ssODN 主要用于敲入长度小于 200 bp 的较短基因片段4使用长单链寡脱氧核苷酸（lsODN）可实现超过1 kb DNA片段的敲入。5,6，但其制备过程耗时较长。当使用双链DNA供体时，基因表达盒（&#62;1 kb）敲入小鼠的制备无需繁琐的供体DNA准备7.
使用ssODN的主要优势在于，可以通过电穿孔8技术制备基因敲入小鼠。然而，dsDNA供体必须通过受精卵显微注射直接导入细胞核。为了构建条件性基因敲除（floxed）小鼠，需要在两个位点同时进行基因敲入，使每个loxP序列分别插入目标基因的上游和下游。通过基因组编辑在小鼠受精卵中构建floxed小鼠有两种方法：使用两个独立的ssODN，每个携带一个loxP位点，或使用一个包含floxed序列的单一dsDNA（或lsDNA）；其中前一种方法效率极低9,10,11。如果实验条件适合受精卵显微注射，使用dsDNA供体进行基因组编辑是制备基因盒敲入和floxed小鼠的最简单方法。
最初，小鼠受精卵的基因组编辑采用Cas9 mRNA与sgRNA的混合物，或编码sgRNA和Cas9的DNA载体进行12,13。由于目前可获得高质量、稳定性好且成本较低的Cas9蛋白，将crRNA-tracrRNA-Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）导入小鼠受精卵的方法已变得普遍14。最近，通过在最有利于敲入发生的细胞周期阶段，将crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP和供体DNA同时导入小鼠受精卵的两个原核中，已实现了高效构建敲入小鼠模型15。因此，本实验方案详细描述了利用该方法制备多种类型敲入小鼠的技术。
实验室小鼠有许多有用的近交系16。在近交系背景下进行基因改造可排除遗传背景对表型的影响。本文介绍了一种在最常用的近交系小鼠品系C57BL/6J17的受精卵中诱导基因盒敲入和floxed突变的方法。此外，还讨论了转基因小鼠制备的时间线以及所用的辅助技术，包括超数排卵和胚胎移植的诱导。

<table><tbody><tr><td>盐酸阿替美唑</td><td>ZENOAQ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>自动伤口夹</td><td>BD</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>自动伤口夹施加器</td><td>BD</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jackson Laboratory Japan</td><td>-</td><td>大于10周龄</td></tr><tr><td>校准移液管，100 µL</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-100</td><td>用于收集受精卵和胚胎移植</td></tr><tr><td>Cas9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36499</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 核酸酶反应缓冲液</td><td>NEB</td><td>B7203</td><td></td></tr><tr><td>CellTram 4r&amp;nbsp;油</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td>http://crispor.tefor.net/</td><td>用于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑实验的网络工具</td></tr><tr><td>crRNA</td><td>IDT</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>凝胶/PCR提取试剂盒</td><td>FastGene</td><td>FG-91302</td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素（hCG）</td><td>ASKA Animal Health</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>ICR 小鼠</td><td>Jackson Laboratory Japan</td><td>-</td><td>大于10周龄，体重28 g或以上</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOnezumi</td><td></td><td>https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html</td><td>用于自动化基因敲除策略以生成基因敲除小鼠的网络应用程序</td></tr><tr><td>M16培养基</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>M2培养基</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>美托咪啶</td><td>ZENOAQ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>用于持卵移液管的火焰抛光和微注射针的弯曲</td></tr><tr><td>显微操作装置</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>可编程移液管拉制仪</td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Maruishi Pharmaceutical</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>MILLEX-GV 0.22 &amp;micro;m 滤器</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGV033R</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Nacalai</td><td>26114-75</td><td>用于受精卵培养和注射腔室</td></tr><tr><td>培养皿（35 mm，未处理）</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td>用于受精卵培养</td></tr><tr><td>压电显微操作仪</td><td>PRIME TECH</td><td>PMM-150</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>FastGene</td><td>FG-90502</td><td>小量制备旋转柱试剂盒</td></tr><tr><td>PMM操作液</td><td>PRIME TECH</td><td>KIT-A</td><td>微注射用操作液</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素（PMSG）</td><td>ASKA Animal Health</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>QIAGEN</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水</td><td>IDT</td><td>-</td><td>tracrRNA辅助试剂</td></tr><tr><td>精细止血钳</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>C-18</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>SIGMA</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>带缝合线的缝合针</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>C11-60B2</td><td></td></tr><tr><td>无丝细壁硼硅酸盐玻璃&lt;br/&gt;</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-75-10</td><td>用于微注射针和持卵移液管</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>IDT</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和flox等位基因

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas 技术实现了转基因小鼠的快速且简便的制备。具体而言，通过将 CRISPR 因子（以及单链寡核苷酸 DNA 供体）电穿孔导入受精卵，可高效地制备敲除小鼠和点突变小鼠。相比之下，基因盒（&#62;1 kb）敲入小鼠和 floxed 小鼠主要通过显微注射 CRISPR 因子和双链 DNA 供体至受精卵中来制备。基因组编辑技术也提高了转基因小鼠制备的灵活性。现在已可在多种优良的近交系小鼠品系中，于目标基因组区域引入预期的突变。我们的团队已根据包括日本在内的多个国家的研究需求，通过受精卵显微注射 CRISPR-Cas9 技术，成功制备了超过 200 个基因盒敲入小鼠品系和超过 110 个 floxed 小鼠品系。其中部分基因组编辑使用了 BALB/c、C3H/HeJ 和 C57BL/6N 近交系，但大多数使用的是 C57BL/6J 品系。与电穿孔方法不同，在多种近交系小鼠中通过受精卵显微注射进行基因组编辑并不容易。然而，在单一近交系遗传背景下构建的基因盒敲入小鼠和 floxed 小鼠，其重要性与基因人源化、荧光报告基因以及条件性基因敲除小鼠模型相当。因此，本文提供了在 C57BL/6J 小鼠中通过受精卵显微注射 CRISPR 因子和双链 DNA 供体以制备基因盒敲入和 floxed 小鼠的实验方案。本文仅聚焦于原核显微注射，而非胞质注射。除受精卵显微注射外，我们还概述了整个制备流程的时间线以及相关辅助技术，如超数排卵诱导和胚胎移植。

使用本方案进行基因盒敲入和条件性敲除小鼠制备的结果见表1和表2。由于每种基因编辑小鼠品系目前均用于独立的未发表项目，因此未说明靶基因；取而代之的是描述了靶向的染色体区域。
基因分型分析采用先前报道的方法进行18。在此基因分型方法中，即使发生了预期的基因组编辑，若供体DNA插入到非预期的染色体位点，这些小鼠也不会被计为阳性个体。因此，所展示的是真正可用于实际研究目的的首建小鼠（founder mice）的制备效率，而非基因组编辑本身的效率。
13个独立基因盒敲入小鼠的中位生产效率为20.8%，最高为39.5%，最低为7.9%（表1）。该效率被认为已具有足够的实用性。在进行基因盒敲入时，未靶向任何导致胚胎致死的基因。在此非致死性基因靶向条件下，中位出生率为34.0%（最高43.3%，最低15.9%）。由于该出生率与未进行遗传操作的胚胎移植出生率相当，我们认为所引入的基因组编辑元件的毒性以及受精卵显微注射造成的物理损伤不太会影响胚胎发育。
10只独立的条件性基因敲除小鼠的平均制备效率为7.7%，最高为20.7%，最低为2.1%（表2）。尽管部分靶基因功能尚不明确，其平均出生率为30.2%，最高为43.8%，最低为17.3%。该出生率与基因盒敲入小鼠相当，表明显微注射操作对条件性基因敲除小鼠胚胎发育的影响可忽略不计。
<img alt="受精卵操作时间线，小鼠繁殖实验中胚胎移植的逐日安排。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64161/64161fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：受精卵显微注射时间线。 白色和深色分别表示光照和黑暗周期。小鼠维持在14小时光照/10小时黑暗的循环条件下。PMSG：孕马血清促性腺激素；hCG：人绒毛膜促性腺激素 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64161/64161fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="M16培养基中细胞培养的培养皿示意图，矿物油覆盖，比较不同条件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64161/64161fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：培养皿的制备。（A）注射前受精卵的培养皿。在35 mm塑料培养皿中放置两滴M16培养基（每滴20–25 µL）。（B）注射后受精卵的培养皿。在35 mm塑料培养皿中放置10滴M16培养基（每滴10–20 µL），滴液表面覆盖矿物油（3 mL）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64161/64161fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">靶向染色体区域</td>
			<td colspan="6">数量</td>
			<td rowspan="3">基因敲入插入长度 (kb)</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">同源臂长度 (kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">胚胎</td>
			<td rowspan="2">新生个体</td>
			<td rowspan="2">检测数量（断奶个体）</td>
			<td rowspan="2">无rTG的基因敲入</td>
			<td rowspan="2">rTGc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注射数量</td>
			<td>移植数量</td>
			<td>5'臂</td>
			<td>3'臂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2qE2</td>
			<td>349</td>
			<td>331</td>
			<td>114 (34.4%)a</td>
			<td>114</td>
			<td>9 (7.9%)b</td>
			<td>5 (4.4%)d</td>
			<td>1.0</td>
			<td>1.0</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2qE2</td>
			<td>231</td>
			<td>215</td>
			<td>78 (36.3%)a</td>
			<td>74</td>
			<td>15 (20.3%)b</td>
			<td>23 (31.1%)d</td>
			<td>2.2</td>
			<td>1.0</td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5qG2</td>
			<td>288</td>
			<td>262</td>
			<td>90 (34.4%)a</td>
			<td>81</td>
			<td>19 (23.5%)b</td>
			<td>18 (22.2%)d</td>
			<td>1.6</td>
			<td>2.0</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6qB1</td>
			<td>278</td>
			<td>259</td>
			<td>58 (22.4%)a</td>
			<td>46</td>
			<td>11 (23.9%)b</td>
			<td>11 (23.9%)d</td>
			<td>4.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6qE3 [ROSA26]</td>
			<td>295</td>
			<td>277</td>
			<td>97 (35.0%)a</td>
			<td>23</td>
			<td>2 (8.7%)b</td>
			<td>4 (17.4%)d</td>
			<td>6.5</td>
			<td>1.1</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6qE3 [ROSA26]</td>
			<td>246</td>
			<td>219</td>
			<td>87 (39.7%)a</td>
			<td>83</td>
			<td>22 (26.5%)b</td>
			<td>18 (21.7%)d</td>
			<td>5.8</td>
			<td>1.1</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7qF5</td>
			<td>279</td>
			<td>268</td>
			<td>116 (43.3%)a</td>
			<td>114</td>
			<td>45 (39.5%)b</td>
			<td>44 (38.6%)d</td>
			<td>1.4</td>
			<td>3.1</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11qB4</td>
			<td>405</td>
			<td>353</td>
			<td>56 (15.9%)a</td>
			<td>47</td>
			<td>8 (17.0%)b</td>
			<td>12 (25.5%)d</td>
			<td>1.7</td>
			<td>1.0</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11qD</td>
			<td>310</td>
			<td>294</td>
			<td>100 (34.4%)a</td>
			<td>98</td>
			<td>15 (15.3%)b</td>
			<td>76 (77.6%)d</td>
			<td>1.0</td>
			<td>1.8</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12qE</td>
			<td>368</td>
			<td>320</td>
			<td>86 (26.9%)a</td>
			<td>84</td>
			<td>12 (14.3%)b</td>
			<td>19 (22.6%)d</td>
			<td>3.4</td>
			<td>1.1</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12qF1</td>
			<td>315</td>
			<td>265</td>
			<td>76 (28.7%)a</td>
			<td>72</td>
			<td>17 (23.6%)b</td>
			<td>28 (38.9%)d</td>
			<td>1.0</td>
			<td>1.1</td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14qE5</td>
			<td>256</td>
			<td>215</td>
			<td>48 (22.3%)a</td>
			<td>48</td>
			<td>11 (22.9%)b</td>
			<td>21 (43.8%)d</td>
			<td>3.1</td>
			<td>1.0</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14qE5</td>
			<td>287</td>
			<td>285</td>
			<td>85 (29.8%)a</td>
			<td>72</td>
			<td>15 (20.8%)b</td>
			<td>19 (26.4%)d</td>
			<td>2.6</td>
			<td>1.0</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：通过显微注射法生产基因敲入小鼠。 该表格显示了出生率以及获得携带预期敲入等位基因且无供体DNA随机整合（rTG）的小鼠的效率。在所有项目中均成功获得了携带预期敲入等位基因的小鼠。a：新生小鼠数/移植胚胎数；b：携带敲入等位基因的小鼠数/检测小鼠总数；c：无法确定是否存在预期等位基因；d：携带rTG等位基因的小鼠数/检测小鼠总数；rTG：供体质粒的随机整合；W/O：无。
<table fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">靶向染色体区域</td>
			<td colspan="5">数量</td>
			<td rowspan="3">floxed 长度 (kb)</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">同源臂长度 (kb)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">胚胎</td>
			<td rowspan="2">新生小鼠</td>
			<td rowspan="2">检测数量（断奶个体）</td>
			<td rowspan="2">无 rTG 的 floxed 个体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注射数</td>
			<td>移植数</td>
			<td>5' 臂</td>
			<td>3' 臂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3qC</td>
			<td>325</td>
			<td>313</td>
			<td>93 (29.7%)a</td>
			<td>87</td>
			<td>9 (10.3%)b</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4qB1</td>
			<td>210</td>
			<td>200</td>
			<td>36 (18.0%)a</td>
			<td>29</td>
			<td>6 (20.7%)b</td>
			<td>1.6</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4qC4</td>
			<td>272</td>
			<td>256</td>
			<td>112 (43.8%)a</td>
			<td>100</td>
			<td>5 (5.0%)b</td>
			<td>2.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5qF</td>
			<td>143</td>
			<td>137</td>
			<td>40 (29.2%)a</td>
			<td>40</td>
			<td>6 (15.0%)b</td>
			<td>1.8</td>
			<td>1.0</td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5qF</td>
			<td>255</td>
			<td>227</td>
			<td>80 (35.2%)a</td>
			<td>76</td>
			<td>2 (2.6%)b</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1.1</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9qE3.1</td>
			<td>289</td>
			<td>261</td>
			<td>80 (30.7%)a</td>
			<td>77</td>
			<td>9 (11.7%)b</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10qB3</td>
			<td>284</td>
			<td>269</td>
			<td>88 (32.7%)a</td>
			<td>78</td>
			<td>3 (3.8%)b</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1.1</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10qC1</td>
			<td>243</td>
			<td>231</td>
			<td>40 (17.3%)a</td>
			<td>38</td>
			<td>4 (10.5%)b</td>
			<td>2.1</td>
			<td>1.0</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14qE5</td>
			<td>390</td>
			<td>372</td>
			<td>139 (37.4%)a</td>
			<td>135</td>
			<td>5 (3.7%)b</td>
			<td>1.1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17qA3.3</td>
			<td>383</td>
			<td>374</td>
			<td>99 (26.5%)a</td>
			<td>95</td>
			<td>2 (2.1%)b</td>
			<td>2.1</td>
			<td>0.6</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：通过显微注射生产条件性基因敲除小鼠（floxed mice）。 该表格显示了出生率以及获得携带目标flox等位基因且无供体DNA随机整合（rTG）的小鼠的效率。在所有项目中均成功获得了携带目标flox等位基因的小鼠。a：出生仔鼠数/移植胚胎数；b：携带flox等位基因的小鼠数/检测小鼠总数。rTG：供体质粒的随机整合；W/O：无。

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

CRISPR-Cas 技术实现了转基因小鼠和点突变小鼠的快速、简便构建。具体而言，转基因小鼠和点突变小鼠可轻松...

我们的实验方案有助于创建需要进行高级小鼠体内实验的基因修饰小鼠，例如基因表达可视化、基因人源化以及条件性基因敲除。本文所介绍的小鼠受精卵基因组编辑技术，能够高效、快速且简便地实现基因表达盒插入（knock-in）和 flox 等高级遗传修饰。由于基因修饰小鼠广泛应用于神经科学、免疫学、代谢、生殖以及传染病等多种研究领域，本研究所提出的技术将为这些广泛的科研领域提供基础性支持。进行实验操作的是本实验室的技术人员 Natsumi Iki、Miyuki Ishida 和 Yoko Tanimoto。首先，准备两个 35 毫米的培养皿用于受精卵培养，并将其放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中备用。收集输卵管，并将其置于培养皿盖上的 20 微升 M2 培养液滴中，该培养液含有 0.75 毫克/毫升的透明质酸酶。使用精细尖头镊子夹取一个输卵管，通过伞部灌注约 50 微升含透明质酸酶的 M2 培养基。30 秒后，用玻璃毛细管吸取形态正常的受精卵及少量培养基，将其转移至新鲜的 M16 培养基液滴中进行洗涤。随后，将洗涤后的受精卵收集至培养皿中，并重复此操作，直至所有受精卵均被回收。 使用程序化拉针仪拉制若干玻璃毛细管。通过撞击微加工仪尖端附着的玻璃小球，将显微注射针尖打断。在1,000倍显微镜下检查针尖大小，并确保显微注射针尖直径约为1微米。使用显微操作仪在距离针尖约2至3毫米处弯曲显微注射针。将1至1.5厘米的操作液注入显微注射针的中心，并将其安装到带有压电驱动器的手动显微注射仪固定架上。接着，将持卵针安装到另一侧的手动显微注射仪固定架上，并通过逐渐加压将操作液移至显微注射针的尖端。将手动显微注射仪固定架安装到显微操作器上。准备一个含有三滴液体的注射腔：第一滴为10 µL的M2培养基，第二滴为5 µL含12%聚乙烯吡咯烷酮的M2培养基，第三滴为5 µL的crRNA、tracrRNA、Cas9蛋白与供体DNA溶液的混合物。用矿物油覆盖液滴，并将注射室置于倒置显微镜载物台上。在50倍放大倍数的倒置显微镜下，将显微注射移液管插入12% PVP液滴中。反复吸入和排出12% PVP，以清洗显微注射针尖内部，然后将其转移至RNPD液滴中。将手动显微注射器置于负压状态。将RNPD溶液吸入显微注射针中，并等待吸入足够体积的液体。在50倍放大倍数下，使液体充满显微注射针的整个内腔。然后，停止进液，将手动显微注射仪调至正压，使RNPD溶液逐渐排出。将显微注射针尖移入油中。取50个受精卵置于M2液滴中，并轻轻将持卵针插入同一液滴内。将显微注射针转移至含有受精卵的M2液滴中。切换至20倍物镜，并对准显微注射毛细管的尖端。固定一枚受精卵后，通过移动显微操作仪，将焦点调整至原核。将显微注射针插入受精卵，并使针尖靠近原核。当针尖到达原核膜时，施加压电脉冲以刺穿。当显微注射针穿入原核后，注入RNPD溶液，并观察原核的膨胀现象。当原核完全膨胀后，迅速抽出显微注射针，并对雌性和雄性原核执行相同的操作。通过将已注射的受精卵转移到M2液滴中的另一位置，以区分注射前后的受精卵，并继续完成M2液滴中所有受精卵的注射。注射完成后，将受精卵转移至新的M16培养皿中。注射后10分钟挑选存活的受精卵。移除因注射而裂解的受损受精卵，并将存活的受精卵分配至M16培养皿的各个液滴中。用移液管吸取少量培养液、加入一些气泡作为标记，同时吸入受精卵，用于转移。使用微型剪刀在输卵管的壶腹部与伞部之间进行切口。将受精卵引入切口的同时，确认已注入气泡。在13个独立的基因盒敲入小鼠实验中，中位生产效率为20.8%，最高达39.5%，最低为7.9%。在此非致死性基因靶向条件下，中位出生率为34.0%，最高为43.3%，最低为15.9%。在10个独立的floxed小鼠实验中，中位生产效率为7.7%，最高为20.7%，最低为2.1%。尽管多个靶基因的功能尚不明确，其中位出生率为30.2%，最高为43.8%，最低为17.3%。注射针尖的直径不宜过细，手动注射器的压力应调整至适当水平，以确保针内溶液顺利注入，并使原核缓慢膨胀。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

受精卵显微注射用于在小鼠中产生基因盒敲入和絮状等位基因

显微注射是一种成熟且有效的方法，可用于将外源物质导入受精的斑马鱼胚胎中。本文中，我们展示了一种可靠的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行mRNA过表达以及吗啉代寡核苷酸基因敲降研究。...

斑马鱼胚胎中mRNA和吗啉代反义寡核苷酸的显微注射

本视频展示了如何在单细胞阶段将吗啉代寡核苷酸（morpholino）或 mRNA...

显微注射斑马鱼胚胎以分析基因功能

本视频介绍了显微注射技术，这是一种创建转基因C.

性腺显微注射：一种将化合物直接递送至线虫 C. elegans 生殖系的方法

本视频介绍了一种通过胚胎显微注射将化合物递送至斑马鱼卵黄囊的技术。...

胚胎显微注射：一种将化合物递送至斑马鱼卵黄的技术

本方案描述了在斑马鱼中利用Gal4-VP16作为主要报告基因、GFP/RFP作为次要报告基因进行基因捕获插入突变的方法。大约每十尾高表达的F0代鱼中，就有一尾能够产生同时表达GFP和RFP的基因捕获后代。该筛选流程可轻松扩展，以适应进行插入突变筛选实验的实验室规模。...

利用Gal4在斑马鱼中进行基因捕获

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）系统为基因工程提供了有力工具，并实现了外源基因的靶向整合。本文描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的高效DNA靶向整合策略 体内...

CRISPR/Cas9介导的靶向整合 体内 使用基于同源介导末端连接的策略

高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

学习利用CRISPR-Cas9和供体DNA对小鼠受精卵进行显微注射的技术，以高效产生基因盒敲入和条件性等位基因小鼠。该方法适用于神经科学、免疫学等多种研究领域的体内基因功能研究。

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

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