Name: CRISPR-Cas9介导的斑马鱼心脏中的精确敲入编辑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 了解CRISPR-Cas9介导的精确敲入编辑技术，用于在斑马鱼胚胎中模拟长QT综合征相关基因变异。该方法结合荧光报告系统实现高效基因编辑检测与表型分析，为心血管疾病机制研究及药物筛选提供可靠的疾病模型平台。

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本研究由加拿大卫生研究院项目资助（T.W.C.）以及加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（T.W.C.）支持。

斑马鱼相关研究均遵循西蒙菲莎大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会的政策与程序，并在协议编号 #1264K-18 下完成。
1. 精确编辑的 CRISPR 组分设计
<ol>
	<li>为了设计用于切除包含敲入（KI）靶位点序列的双sgRNA引导序列，首先确定目标基因的斑马鱼同源基因。 
	注意：图2 概括了使用双sgRNA CRISPR-Cas9方法实现精确编辑的步骤。</li>
	<li>接下来，使用设计软件工具（例如CRISPOR24），选择物种为Danio rerio，并选择将使用的Cas酶。 
	注意：本研究中的目标基因为zkcnh6a（Ensembl转录本ID：ENSDART00000090809.6；UniProt蛋白ID：B3DJX4），目标突变为氨基酸R56Q。
	<ol>
		<li>对于双sgRNA方法，选择一个位于目标外显子上游的sgRNA位点，以及另一个位于其紧邻下游内含子内的sgRNA位点。</li>
		<li>确保所选sgRNA具有高特异性且预测的脱靶结合率低。利用CRISPOR评分系统筛选脱靶结合最少的引导序列。不考虑在潜在脱靶位点的种子序列中无错配的引导序列。</li>
		<li>根据CRISPOR评分，确定最可能的潜在脱靶位点（选择前三个外显子区域的潜在脱靶位点），用于第6.1.3步基于PCR的Sanger测序基因分型。</li>
		<li>选定两个sgRNA后，获取各自的反向互补序列，从而获得四个寡核苷酸：两个位于突变位点上游的互补寡核苷酸和两个位于下游的互补寡核苷酸。</li>
		<li>在四个寡核苷酸上分别添加与所选引导质粒兼容的限制性酶切位点；若要插入DR274质粒，使用5'端的BsaI限制性酶切位点以形成粘性末端。确保从CRISPOR选出的引导序列5'端包含BsaI识别位点，互补链5'端也包含BsaI识别位点，以保证引导序列在DR274质粒中的正确方向（见图3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了设计在斑马鱼中用于HDR的外源模板（图1），选择两个序列片段，用于侧接pKHR5质粒中携带的mVenus YFP报告基因。 
	注意：预期的修饰/编辑可包含在上游或下游片段中。
	<ol>
		<li>通过Ensembl数据库，在目标基因序列中定位靶位点，并包括约2 kb的侧翼序列（同源臂），用于构建模板。 
		注意：同源臂可以是对称或非对称的25,26，通常在靶位点上下游各约1 kb。</li>
		<li>将模板分为两个片段，分别插入mVenus YFP报告基因的两侧（见图4）。确保切割位点位于内含子中，以免中断编码序列。 
		注意：如果该基因已有充分研究，请检查内含子中是否存在功能性区域，如剪接位点或调控区域。靠近5'或3'端的区域更常参与mRNA剪接。</li>
		<li>在模板序列中引入修饰，包括：i）在引导RNA的原间隔序列邻近基序（PAM）或种子序列中引入同义突变（注意Cas酶可能识别的其他PAM位点），以防止Cas酶再次切割；ii）引入感兴趣的修饰；iii）创建限制性内切酶位点，以便将模板克隆至含有mVenus YFP报告基因的pKHR5质粒中（见图3）。 
		注意：在本研究中，第一个模板片段在R56Q突变位点上游包含XhoI，下游包含SalI；第二个模板片段在引导RNA靶序列上游包含EcoRI，下游包含BamHI。如果所选限制性酶切位点存在于模板序列内部，则需引入突变使其失活，或采用其他方法如Gibson组装。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚胎显微注射用CRISPR组分的制备
<ol>
	<li>在显微注射前1周准备Cas9。使用Cas9蛋白或制备 Cas9 mRNA 通过体外 转录 
	注意：本研究中使用了Cas9 mRNA，因为其效率往往更高。
	<ol>
		<li>使用适当的抗生素（如氨苄青霉素）扩增市售的含有Cas9质粒的XL1 Blue大肠杆菌琼脂斜面菌种。取675 µL液体培养物与325 µL甘油混合，制备甘油菌保存液，用于在−80 °C长期保存。</li>
		<li>使用剩余的液体培养物进行质粒小提纯化，具体操作按照质粒小提试剂盒提供的说明书进行。将最终纯化的DNA溶于50 µL试剂盒提供的洗脱缓冲液中。对产物进行定量分析 通过 使用分光光度计检测产量和纯度。</li>
		<li>将2 µg纯化后的DNA线性化 通过 使用适当的限制性内切酶进行限制性酶切，并根据目标酶的要求使用相应的缓冲液和孵育时间。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒纯化线性化质粒，并将其重悬于30 µL提供的洗脱缓冲液中。</li>
		<li>在定量产物后，以此作为模板 体外 使用针对目标启动子的相应转录试剂盒进行转录。按照所提供的方案操作并纯化 通过 氯化锂沉淀27. 将纯化的 RNA 重悬于 10 µL 无核酸酶的 H2O并定量，然后在−20 °C保存，用于显微注射混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备两条sgRNA引导序列。
	<ol>
		<li>通过扩增市售的 XL1 Blue 细菌琼脂穿刺培养物（见 材料表 除使用卡那霉素代替氨苄青霉素外，其余步骤均与上述MLM3613（步骤2.1.1）相同（详见正文）。</li>
		<li>将上述设计的两对互补单链寡核苷酸（ssODNs）引物对分别用1×退火缓冲液重悬，配制成浓度为100 µM的溶液，随后进行退火处理。</li>
		<li>分别针对两种sgRNA，在独立的反应中使用热循环仪使互补的单链寡核苷酸（ssODN）退火。将每对互补的ssODN各2 µg与50 µL退火缓冲液混合，95 °C孵育2分钟，然后在45分钟内缓慢冷却至25 °C。</li>
		<li>消化一种市售的含有gRNA骨架的质粒。使用1 µL BsaI、2 µL相应缓冲液和ddH₂O，对2 µg DR274质粒进行消化。2在37 °C下反应1小时，将体积从0调整至20 µL。通过琼脂糖凝胶电泳确认线性化（可选：使用PCR纯化试剂盒进行纯化）。28.</li>
		<li>在两个独立的连接反应中（每个sgRNA对应一个反应），将退火后的ssODN与线性化的DR274质粒进行连接。采用3:1的插入片段与载体摩尔比，通过在线连接计算器计算相应的质量。将所需质量的插入片段和载体与1 µL T4 DNA连接酶、2 µL连接缓冲液以及ddH₂O混合。20至12 µL，室温孵育12 h。</li>
		<li>将2 µL连接产物通过标准方法转化至合适的感受态细胞（如10β细胞）中，随后使用 commercially available Miniprep Kit 扩增并纯化产物。可选：为此产物制备甘油菌种保存液。</li>
		<li>使用位于间隔序列末端附近尽可能靠近的3'端下游限制性酶切位点，将每种向导RNA的2 µg质粒线性化以进行转录。对于DR274质粒，使用HindIII进行线性化，然后使用PCR纯化试剂盒纯化RNA模板，并溶于30 µL洗脱缓冲液中。</li>
		<li>使用RNA转录试剂盒转录两条向导RNA。按照制造商的方案操作并进行纯化 通过 氯化锂沉淀27将两种纯化的sgRNA引导物重悬于10 µL无核酸酶的H₂O中。2O，定量后于−20 °C保存，用于显微注射混合液。 
		注意：RNA转录试剂盒无法引入5'帽结构或poly-A尾。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备双链外源HDR报告基因模板。 
	注意：该模板分为两部分合成，分别位于mVenus YFP报告基因的上游和下游。这两个片段为通过商业供应商订购的合成构建体，随后依次连接至pKHR5质粒（含有mVenus YFP）中。
	<ol>
		<li>通过扩增市售的 DH5α 菌株细菌培养物来制备 pKHR5 质粒（参见 材料表 与上述 MLM3613 相同的方式（步骤 2.1.1）进行操作（详见说明）。 
		注意：pKHR5 质粒包含 mVenus YFP 报告基因序列。</li>
		<li>将上述设计的两个模板片段用TE缓冲液重悬至100 µM，然后转入10β细胞中。</li>
		<li>使用步骤1.3.3中选定的限制性内切酶，对第一段模板（位于mVenus YFP报告基因上游的片段）和pKHR5质粒进行酶切消化。 
		注意：由于所选限制性酶切位点在多克隆位点（MCS）中位置相近，因此必须对pKHR5进行依次酶切消化。</li>
		<li>为制备上游模板片段的pKHR5质粒，用SalI酶切4 µg的pKHR5（按步骤2.2.4进行），然后使用PCR纯化试剂盒进行纯化。用30 µL ddH₂O重悬。2O，并以此作为使用XhoI进行第二次消化反应的模板。使用PCR纯化试剂盒纯化产物。</li>
		<li>通过以下组分消化制备第一段模板：2 µg 模板片段（步骤 2.3.2）、1 µL XhoI、1 µL SalI、2 µL 相应缓冲液和 ddH₂O2将体积调至20 µL，在37 °C孵育1小时，然后纯化凝胶产物。</li>
		<li>将步骤 2.3.5 中的上游模板片段按照步骤 2.2.5 所述反应条件连接至已准备好的 pKHR5 载体中。将连接产物转化至感受态 10β 细胞中，扩增后使用质粒小提试剂盒（miniprep）进行纯化（可选：可为此产物制备甘油菌保存液）。</li>
		<li>使用步骤 2.3.6 中连接产物（该产物包含已连接至 pKHR5 质粒中 mVenus YFP 报告基因上游的第一模板片段），进行消化以制备第二段模板（位于 mVenus 报告基因下游）。用 BamHI 酶切 4 µg 连接产物（来自步骤 2.3.6，操作同步骤 2.2.4），然后使用 PCR 纯化试剂盒进行纯化。用 30 µL ddH₂O 重悬。2O，并以此作为EcoRI第二次消化反应的模板。使用PCR纯化试剂盒纯化产物。</li>
		<li>通过将2 µg模板片段（步骤2.3.2）、1 µL BamHI、1 µL EcoRI、2 µL适当缓冲液和ddH₂O加至终体积20 µL，进行第二模板片段的制备2将反应体积调整至20 µL，37 °C孵育1 h，然后进行凝胶纯化以获得产物。</li>
		<li>使用步骤 2.2.5 中所述的反应条件，将下游模板片段连接至已准备好的 pKHR5 载体（来自步骤 2.3.7）。将连接产物转化至感受态细胞中，扩增后使用质粒小提试剂盒进行纯化。为此最终产物制备甘油菌保存液，该产物在 pKHR5 中包含位于 mVenus YFP 报告基因两侧的两个模板片段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Cas9 mRNA、两条sgRNA和外源HDR报告模板配制显微注射混合物。
	<ol>
		<li>将200 ng/µL的Cas9 mRNA、每种100 ng/µL的sgRNA以及200 ng/µL的外源HDR报告模板混合于1×注射缓冲液中，总体积为20 µL。</li>
		<li>将显微注射混合液于 −20 °C 保存，经三次冻融循环后弃去未使用部分。 
		注意：将此显微注射混合液 4 nL 注入每枚胚胎的卵黄囊中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 斑马鱼繁殖与胚胎显微注射
注意：斑马鱼繁殖及单细胞胚胎显微注射的实验方案此前已有描述29,30,31。
<ol>
	<li>用于繁殖时，选用 AB 品系且年龄为 6-12 个月的斑马鱼。在受精后约 40 分钟的单细胞阶段注射胚胎（见图 5）。 
	注：注射胚胎的生物学性别未知；性别二态性在约 3 个月龄前不明显32。</li>
</ol>
4. CRISPR-Cas9 编辑的斑马鱼幼体报告基因筛选
<ol>
	<li>在显微注射CRISPR-Cas9组分后，通过观察斑马鱼幼鱼中YFP的整合情况，筛选成功的HDR编辑个体。
	<ol>
		<li>在25 mm的培养皿中，使用0.3%三卡因甲磺酸盐（MS-222，用HEPES和氢氧化钠缓冲至pH 7.0–7.4）对24条受精后3天（dpf）的斑马鱼幼鱼进行麻醉，直至其失去自我翻正反射（通常需1–2分钟）。麻醉完成后，将每条幼鱼转移至24孔板的独立孔中。</li>
		<li>使用能够检测GFP/YFP的显微镜，观察每条幼鱼眼部报告基因的荧光信号。</li>
		<li>拍摄每条幼鱼的图像，并记录报告基因表达的有无情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. CRISPR-Cas9 编辑的斑马鱼幼虫表型分析
<ol>
	<li>在完成报告基因筛选后，对每条幼鱼进行心脏表型分析（心率、心包尺寸、心电图）。需对等量的报告基因阳性与阴性幼鱼进行表型分析。
	<ol>
		<li>使用CCD相机（例如blackfly USB3）及视频与图像采集软件（例如ImageJ的Micromanager）在幼鱼麻醉状态下测量心率和心包尺寸。</li>
		<li>测量心率时，使用Micromanager创建感兴趣区域（ROI），以捕获心脏区域并排除其他结构。
		<ol>
			<li>将视频作为图像序列导入ImageJ，并确保在图像数量一栏中输入正确的帧数。</li>
			<li>文件打开后，使用矩形选择工具在心脏区域内绘制ROI，避免包含其他运动结构，并将该ROI在ROI管理器中（分析 | 工具 | ROI管理器）保存。</li>
			<li>点击插件 | 安装，选择心率算法以将代码安装至默认文件夹，然后在插件选项卡底部选择该插件。从弹出窗口中记录每分钟心跳次数（bpm）。 
			注：图像检测算法为自主编写，通过检测与心室收缩相关的单个像素密度变化来测定心率。代码位于&#160;https://github.com/dpoburko/zFish_HR。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用ImageJ等免费工具测量心包尺寸，通过自由绘制ROI圈定心包膜及其中一只眼睛。在ImageJ中打开图像，使用多边形选择工具首先围绕心包膜绘制ROI，并如步骤5.1.2所述在ROI管理器中保存；然后对眼睛重复相同操作。在ROI管理器中选中这两个ROI，点击测量。记录每个ROI的面积，以便后续计算每条幼鱼中心包膜面积相对于眼面积的归一化值。</li>
		<li>在完成心率与心包尺寸测量后，记录单条幼鱼的心电图（ECG）。 
		注：斑马鱼心电图记录的实验方案已有文献报道33,34,35,36。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. CRISPR-Cas9 编辑的斑马鱼幼虫的基因分型
<ol>
	<li>在表型分析之后，进行靶位及潜在脱靶位点的基因分型，以确认HDR基因编辑的准确性和精确性。
	<ol>
		<li>用0.3% MS-222麻醉每条3 dpf幼鱼，剪尾并采用HOTShot法提取基因组DNA37将每个剪下的尾尖组织在15 µL的25 mM NaOH中于95 °C孵育20分钟。随后加入1.5 µL Tris-HCl中和，并在13,800 x g 30秒。保留上清液，其中含有提取的基因组DNA。</li>
		<li>将幼虫回收至E3培养基中，若需继续培养或研究，则放回饲养系统。</li>
		<li>以提取的基因组DNA为模板，对靶位点及潜在脱靶位点进行基于PCR的Sanger测序。 
		注意：可选：对于某些基因区域，套式 PCR 方法可能更有利。</li>
		<li>确保靶向引物设计覆盖突变位点及最近的sgRNA结合位点。设计单独的测序引物，用于检测插入的同源臂与目标基因之间的序列过渡，以确认其整合至目标基因。针对步骤1.2.3中确定的三个最可能的脱靶位点，设计相应的测序引物。 
		注意：引物设计软件通常会推荐可用的引物，但可能需要进行定制化调整以获得最佳结果。</li>
		<li>整合每条斑马鱼的靶向与脱靶基因分型、心率、心包尺寸、心电图表型及报告基因数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

利用 CRISPR-Cas9 实现精确基因编辑面临同源定向修复（HDR）机制效率低下以及难以高效检测的挑战。本文介绍了一种基于 CRISPR-Cas9 的双 sgRNA 外显子替换方法，可在斑马鱼中实现精确编辑，并通过直观的视觉方式检测阳性编辑结果。通过在 zkcnh6a 基因中产生精确编辑，验证了该方法的有效性。本文还展示了如何通过心率、心包尺寸和心电图形态等非侵入性表型指标，评估基因编辑斑马鱼幼虫的心脏功能。从引入基因编辑到完成表型分析，整个流程可在约 1 周内完成。
上述编辑和表型分析方法的优势在于CRISPR修饰设计简便、在多种生理系统中具有广泛适用性、能够插入较大的基因或基因片段，以及能够长期追踪变异在发育过程和多代之间的效应。该方法实现精确编辑的成功可能与大尺寸模板（包含报告基因插入片段和较长的同源臂）有关，已知这可提高斑马鱼中编辑的效率14；同时也可能得益于双sgRNA引导策略，该策略此前已在斑马鱼TALEN介导的编辑中被有效应用8。
<p cla...

基于CRISPR的基因编辑策略在动物模型中的应用，使得在整体生物水平上研究可遗传的遗传性疾病、发育过程及毒理学成为可能1,2,3。斑马鱼是一种强大的模型，其在多种生理特征上比小鼠或人源细胞模型更接近人类4。斑马鱼已被广泛应用于正向5和反向遗传筛选6，并开发了大量遗传工具和策略。斑马鱼中全面的遗传图谱构建与基因注释工作，促进了基因编辑技术的发展，使其成为实现靶向基因敲除（KOs）和精确基因敲入（KIs）的主要手段7。
尽管如此，斑马鱼中精确的敲入（KI）编辑仍受限于较低的效率以及准确检测的困难。虽然转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）已成功用于并优化了敲入编辑8，CRISPR 技术凭借更简单的 sgRNA 靶向方式提供了更优的基因编辑策略。大量研究已利用 CRISPR 在斑马鱼中实现精确的敲入编辑9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20，但这些通过 CRISPR 介导的同源定向修复（HDR）实现的编辑通常效率较低，内在成功率不高，需依赖基因分型作为主要筛选手段9,10,14,21。这表明斑马鱼中亟需一种高效的敲入 CRISPR 系统，以及一种可靠的高通量检测精确编辑的方法。
本研究旨在描述一种在斑马鱼心脏中生成精确心脏基因敲入（KI）的平台，并实现对成功编辑的简单、高通量检测。文中介绍了一种基于CRISPR-Cas9的双sgRNA外显子替换方法，该方法借鉴自TALEN技术8。该策略利用双sgRNA引导切除目标序列，并通过包含目的基因敲入片段以及一种基因编码的内含子报告基因的外源模板序列进行替换（图1）。将基因编码的荧光报告基因整合至目标基因的内含子序列中，可实现对阳性编辑事件的高效检测。随后描述了一个表型分析平台，用于评估斑马鱼幼体的心脏电生理功能，以无创方式表征与遗传性长QT综合征（LQTS）相关的基因变异体——这是一种可增加个体发生心源性猝死风险的心脏电活动紊乱疾病。
这些方法将促进斑马鱼基因敲入（KI）编辑技术在模拟遗传性疾病以及回答生物学和生理学问题方面的获取与应用，例如基因表达模式的绘制和发育调控的研究。由于斑马鱼心脏的电生理特性比小鼠模型更接近人类，因此它们可能作为可进行遗传操作的心脏疾病模型系统尤为理想7,22,23。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;程序&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR 基础设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>欧洲生物信息研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院 (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>开源 (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>新英格兰生物实验室 (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 相机</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415C 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZNA 凝胶回收试剂盒</td><td>Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000 恒温摇床</td><td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 Ultra 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000 分光光度计</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A 皮升注射仪</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源供应器</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini Sub Cell GT 电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec 斑马鱼饲养系统</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;服务&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基因合成</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger 测序</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&amp;beta; 感受态细胞</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PCR 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM 核苷酸混合物</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI 内切酶（含缓冲液）</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI 内切酶（含缓冲液）</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 质粒（XL1 Blue 细菌琼脂斜面）</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI 内切酶（含缓冲液）</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII 内切酶（含缓冲液）</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 质粒（XL1 Blue 细菌琼脂斜面）</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222（三卡因）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 质粒（DH5&amp;alpha; 细菌琼脂斜面）</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI 内切酶（含缓冲液）</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalI 内切酶（含缓冲液）</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶（含缓冲液）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq 聚合酶</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 盐酸盐</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI 内切酶（含缓冲液）</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;配方&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>溶液</td><td>组分</td><td>供应商</td><td></td></tr><tr><td>退火缓冲液（pH 7.5–8.0）</td><td>10 mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 培养基（pH 7.2）</td><td>5 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.17 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>注射缓冲液（pH 7.5）</td><td>20 mM HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9介导的斑马鱼心脏精准敲入编辑

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

动物模型中的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）可实现对生理现象研究的精确基因操作。斑马鱼作为一种有效的遗传学模型，已被广泛用于在器官和整体生物水平上研究与遗传性疾病、发育过程及毒理学相关的诸多科学问题。由于斑马鱼基因组已被充分注释并完成图谱绘制，目前已开发出多种基因编辑工具。然而，利用CRISPR技术进行精确敲入编辑的效率以及检测的便捷性仍是当前的限制因素。本文介绍了一种基于CRISPR-Cas9的敲入方法，并通过检测一个与心脏复极化相关且与电生理紊乱疾病——长QT综合征（Long QT Syndrome, LQTS）有关的基因中发生的精确编辑，展示了该方法的简便检测流程。该方法采用两条单导向RNA（sgRNA），可切除并替换目标序列，同时插入一个基因编码的报告基因。通过描述对野生型和基因编辑斑马鱼幼体进行非侵入性的心脏电生理表型测量，验证了该方法的应用价值。该策略可在完整生物体中高效研究疾病相关变异体，同时为插入外源性目的序列（如报告基因、直系同源基因或基因编辑工具）提供了新的可能性。

通过在斑马鱼的zkcnh6a基因中引入并简便检测精确编辑，成功构建了与长QT综合征相关的R56Q变异，凸显了这种双sgRNA外显子替换CRISPR方法的有效性。图6显示了一例在单细胞胚胎阶段注射了上述CRISPR组分的代表性3天龄幼鱼。图6A显示眼晶状体中YFP mVenus报告基因的表达，表明模板成功整合。图6B和C分别为从野生型鱼和报告基因阳性鱼尾部组织样本中提取基因组DNA后获得的Sanger测序色谱图。检测发现，报告基因阳性鱼均存在G到A的精确编辑，该编辑将R56Q变异引入zkcnh6a基因。基因分型结果显示YFP报告基因表达与R56Q精确基因编辑之间存在100%的相关性，验证了该荧光筛选工具的可靠性。
在3 dpf时对基因编辑的斑马鱼幼鱼进行表型分析。图7展示了野生型...

本方案描述了一种利用CRISPR-Cas9技术在斑马鱼胚胎中实现精确基因敲入编辑的方法。同时提供了一套表型分析流程，以证明该技术在模拟与长QT综合征相关基因变异中的应用价值。

CRISPR-Cas9介导的斑马鱼心脏精准敲入编辑

动物模型中的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）可实现精确的基因操控，用于生理学研究……

本方案提供了一套用于精确整合及简便可视化检测CRISPR编辑效果的流程，并展示了编辑后表型分析的实例。该方法的主要优势在于CRISPR编辑的检测简便，可高效、快速地鉴定出成功的编辑事件。该方法可实现斑马鱼中与疾病相关变异体的简便构建与特征分析。在此，我们正在研究长QT综合征。随后可进一步探索药物治疗的随访研究。首先设计两条sgRNA引导序列，通过鉴定目的基因的斑马鱼直系同源物来切除敲入靶位点序列。使用 Ensembl 在目标基因序列中定位靶位点，包括用于构建模板的两干碱基侧翼序列。使用 CRISPOR 等设计软件工具，并选择斑马鱼（Danio rerio）物种和 Cas 酶。对于双 sgRNA 方法，选择一个位于目标外显子上游的 sgRNA 和另一个位于紧邻下游内含子内的 sgRNA。确保所选的sgRNA具有高特异性和低预测脱靶结合。使用CRISPOR评分来鉴定脱靶结合最少的向导RNA。接下来，确定最可能的潜在脱靶位点，用于基于PCR的Sanger测序基因分型。选择两个 sgRNA 后，分别获取各自的反向互补序列，两个位于突变位点上游的互补寡核苷酸，以及两个位于突变位点下游的互补寡核苷酸。在每条寡核苷酸上添加相容的限制性酶切位点，以便将引导序列插入选定的质粒中。为了将选定的引导序列整合到 DR274 质粒中，使用 5' 端的 BSA1 限制性酶切位点产生黏性末端，并在引导序列的 5' 端构建 BSA1 识别位点。接下来，通过选择两个位于 PKHR5 质粒中 M 静脉 YFP 报告基因两侧的序列片段，设计用于斑马鱼 HDR 的外源模板。将该模板分为两个片段，分别插入 M 静脉 YFP 报告基因的两侧。确保切割位点位于内含子中，以避免破坏编码序列。根据手稿中所述的所有必要修改，以便将目标片段克隆至 PKHR5 质粒中。在受精后约 40 分钟的单细胞阶段对胚胎进行显微注射。受精后三天，将斑马鱼幼鱼转移至含有 0.3% MS222 的 25 毫米培养皿中进行麻醉，直至其失去自我翻正反射。麻醉后，将幼虫转移至24孔板的孔中。使用能够检测GFP或YFP的显微镜，观察幼虫眼部报告基因的荧光。拍摄幼虫图像后，记录报告基因表达的有无情况。为了确认精确且准确的HDR基因编辑，首先对受精后三天的幼虫进行基因分型，麻醉方法如前所述，并采用“hotshot”法从尾部组织中提取基因组DNA。将剪下的尾部组织加入15微升25毫摩尔的氢氧化钠溶液中，95摄氏度孵育20分钟，然后用1.5微升盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）中和。以13,800 ×g离心30秒，保留含有提取基因组DNA的上清液。将幼虫回收至E3培养基中，若需进一步研究，则将其放回饲养系统。以提取的基因组DNA为模板，对靶位点及潜在脱靶位点进行基于PCR的Sanger测序。确保靶向引物设计能够覆盖突变位点及最近的sgRNA结合位点。设计一条独立的测序引物，用于检测插入的同源臂与靶基因之间的连接序列，以确认目的基因的整合。设计引物用于对三个最有可能的脱靶位点进行测序。汇总每条斑马鱼的靶向与脱靶基因分型、心率、心包尺寸、心电图表型以及报告基因数据，确保各项数据可识别。在岛状区域观察到 YFP M 静脉报告基因的表达，作为模板成功整合的阳性报告信号。报告基因阳性的斑马鱼均携带精确编辑 G2A，该编辑将 R56Q 变异引入 ZKCNH6A。此处展示了以眼区面积为参照的心包尺寸测量比值。在R56Q基因编辑的斑马鱼幼鱼中，观察到随着心包水肿加重，出现与心脏复极化障碍相关的心动过缓趋势。此处展示了受精后三天斑马鱼幼鱼心脏的ECG记录。该方法最关键的环节是向导RNA的设计，这在CRISPR实验中十分常见。高效的向导序列对于成功的CRISPR编辑至关重要。可采用其他CRISPR方法以实现更高的精确性或附加功能。此外，还可插入较大的基因，例如原位编辑复合物，从而构建一种体内可诱导的编辑系统。

crispr-cas9-mediated-precise-knock-in-edits-in-zebrafish-hearts

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

CRISPR-Cas9介导的斑马鱼心脏中的精确敲入编辑

转基因操作和基因组编辑对于功能验证基因和cis-调控元件的作用至关重要。本文针对新兴的模式鱼类——三刺棘背鱼，详细介绍了用于产生基因组修饰（包括Tol2介导的荧光报告转基因构建体、TALENs和CRISPRs）的显微注射方案。...

三刺鱼转基因与基因组编辑的显微注射技术

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在斑点叉尾鮰胚胎中进行基因编辑的简单高效的显微注射方案。在该方案中，将引导RNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞胚胎的卵黄中。本方案已通过敲除两个与斑点叉尾鮰免疫相关的基因得到验证。...

将CRISPR/Cas9蛋白显微注射入斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）胚胎中进行基因编辑

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

我们介绍了在进化模型系统 Astyanax mexicanus...

墨西哥洞穴鱼基因功能的操作

本文介绍了一种用于制备和培育CRISPR/Cas9基因组敲除电鱼的实验方案。详细阐述了开展该实验所需的分子生物学操作、繁育条件和饲养要求，适用于一种裸背电鳗目（gymnotiform）和一种长颌鱼科（mormyrid）电鱼，并介绍了通过显微注射技术获得Cas9诱导的F0代插入缺失（indel）幼鱼的方法。...

沉默电火花：利用CRISPR/Cas9在弱电鱼中进行基因组编辑

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

早期发育依赖于母源遗传的产物，而这些产物中许多的功能目前尚不清楚。本文描述了一种利用 CRISPR-Cas9...

利用母源性crispant确定母源性表达基因在早期发育中的作用

CRISPR-Cas 技术已彻底改变了基因组编辑领域。然而，发现并分离出理想的种系编辑仍是一个主要瓶颈。因此，本实验方案描述了一种可靠的方法，利用标准的 PCR、限制性酶切和凝胶电泳技术，快速筛选经 CRISPR 注射的 F0...

斑马鱼生殖系编辑的精子筛选快速分离方法

本方案描述了如何在无PAM限制的情况下进行高效的腺嘌呤碱基编辑，以利用zSpRY-ABE8e构建精确的斑马鱼疾病模型。...

利用zSpRY-ABE8e实现高效无PAM限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

在此，我们介绍一种在斑马鱼幼鱼中用荧光蛋白标签标记蛋白质的实验方案，该方案为新近开发并经过改进的方法 体内...

荧光标记法用于可视化斑马鱼中低表达蛋白

本文介绍了一种通过将稳定的zpc:cas9基因敲入品系与Tol2介导的sgRNA表达盒递送相结合，以产生母源突变体的实验方案。...

利用zpc:cas9基因敲入斑马鱼产生母源突变体

了解CRISPR-Cas9介导的精确敲入编辑技术，用于在斑马鱼胚胎中模拟长QT综合征相关基因变异。该方法结合荧光报告系统实现高效基因编辑检测与表型分析，为心血管疾病机制研究及药物筛选提供可靠的疾病模型平台。

CRISPR-Cas9介导的斑马鱼心脏精准敲入编辑

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