在根尖肠模型中使用路西法黄测定肠通透性

将荧光法黄应用于顶端肠的培养基提供了一种简单的方法，用于在 3D 模型中对所有三种主要的细胞旁肠通透性途径进行定量和定性分析。这是一种相对简单的技术，使我们能够使用肠样模型评估通透性。我们正在坏死性小肠结肠炎的研究中使用这种技术。

然而，这种技术可用于利用肠样模型研究任何人类肠道疾病。今天展示这些程序的将是我们的博士后研究学者Tyler Leiva博士和Alena Golubkova博士，以及我们实验室的研究助理主管Camille Schlegel。首先，使用50%LWRN条件培养基将嵌入在BMM中的Android培养7至10天，用于顶端输出或AO肠样生成。

从BMM圆顶周围取出培养基，并在一个孔中加入500微升细胞回收溶液或CRS。刮擦圆顶，上下移液数次，使CRS与嵌入BMM圆顶中的肠样物均质化，然后将该溶液添加到下一个孔中。同样，刮擦圆顶并上下移液几次，然后将溶液转移到微量离心管中。

向第二个孔中加入500微升CRS，上下移液以使其充分混合，然后将其转移到第一个孔中。从第一个孔开始，将CRS肠样BMM溶液汇集到相同的1.5毫升微量离心管中，并对其余孔重复此池化，直到所有孔的内容物都在CRS中。将含有混合CRS溶液的微量离心管放在旋转器上，在4摄氏度下放置一小时。

然后将微量离心管在4摄氏度下以200×g离心三分钟，然后除去上清液，并将肠样沉淀重新悬浮在一毫升50%LWRN条件培养基中。轻轻地将500微升重悬的肠样或培养基溶液转移到超低附着24孔组织培养板的每个孔中。在实验前将板在 37 摄氏度下用 5% CO 2 孵育三天。

确保 AO 类肠药物在使用前至少暂停 72 小时。轻轻地将悬浮在培养基中的所有肠样从每个孔转移到微量离心管中。在室温下以300×g离心三分钟，除去上清液。

每孔向500微升50%LWRN条件培养基中加入10微升每毫升5毫克脂多糖或LPS以制备预混液，并将处理组的AO肠样颗粒重新悬浮到500微升LPS加50%LWRN条件培养基中。上下移液以彻底混合。将500微升悬浮液等分到24孔超低附着板的每个孔中。

同样，将未处理的对照组的AO肠样重新悬浮在每孔500微升50%LWRN条件培养基中，并将500微升该悬浮液等分到单独的24孔超低附着板的每个孔中。使用含有 1% 氧气、5% 二氧化碳和 94% 氮气的模块化培养箱在 LPS 处理的 AO 类肠中诱导缺氧，并将具有缺氧和 LPS 的类肠孵育 24 小时。将未处理和LPS加缺氧处理的培养物置于5%二氧化碳培养箱中24小时。

要使用路西法黄或LY测量细胞旁通透性，将肠样或培养基悬浮液从每个孔轻轻转移到微量离心管中。在 37 摄氏度的水浴中加热 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水或 DPBS 和 50% LWRN 条件培养基。在室温下以300×g离心悬浮液三分钟。

取出培养基，用500微升温热的DPBS洗涤肠样沉淀，然后以300×g离心三分钟。用微量移液管除去上清液，再次重复DPBS洗涤步骤。DPBS洗涤后，加入450微升温热的50%LWRN条件培养基，并将悬浮液加入24孔板中。

然后向每个孔中加入 50 微升每毫升 2.5 毫克 LY。轻轻旋转板以混合，并将其置于5%二氧化碳培养箱中两个小时。轻轻地将每个孔中的肠悬浮液移入微量离心管中。

离心并除去上清液，留下肠样沉淀。使用500微升温热的DPBS洗涤沉淀并离心。除去上清液，留下沉淀。

在用1000微升冷DPBS重新悬浮沉淀之前，重复DPBS的三次洗涤，并通过使用移液管剧烈混合来解离肠样。对于路西法黄标准曲线，如文中所述制备在DPBS中稀释的标准品。在96孔板上每孔吸取150微升每个样品一式三份。

在荧光板读数器上测量428纳米激发峰和536纳米发射峰处的荧光。使用统计软件和插入标准曲线的四参数曲线计算浓度。在50%LWRN培养基中悬浮72小时的类肠免疫荧光染色显示肠外顶表面为Zo-1，而基底外侧表面可见β连环蛋白。

它表明肠样的预期极性反转证实了肠的AO构象。与未处理的对照相比，用LPS和缺氧处理的基底外侧出或BO肠样显示出显着增加的通透性，这在路西法黄或LY测定中通过增加LY染料对肠腔的摄取而得到证明。路西法黄测定还表明，与未处理的对照相比，经处理的AO类肠管腔中LY的摄取增加。

它证实了与未处理的对照相比，用LPS和缺氧治疗的AO肠样肠的通透性增加。重要的是要彻底清洗肠样颗粒，以确保去除所有腔外 LY。它允许在计算通透率时准确量化剩余的腔内 LY。

对于定性分析，可以通过荧光显微镜观察肠样，以便将LY摄取到管腔中。在LY孵育和随后的洗涤步骤之后，然后从微孔板读数中解离。