利用荧光素黄在顶膜外翻肠类器官模型中测定肠道通透性

将 Lucifer Yellow 加入顶膜外翻的类肠体培养基中，为在三维模型中对三种主要的细胞旁路肠道通透性途径进行定性和定量分析提供了一种简便方法。该技术相对简单，使我们能够利用类肠体模型评估通透性。我们在坏死性小肠结肠炎的研究中应用了这一技术。

然而，该技术可利用类肠器官模型来研究任何人肠道疾病。今天演示实验操作的是我们实验室的博士后研究员Tyler Leiva博士、Alena Golubkova博士，以及研究助理主管Camille Schlegel。首先，在基底膜基质（BMM）中培养类肠器官7至10天，使用50% LWRN条件培养基，以生成顶膜外翻（apical-out）或AO类肠器官。

移除BMM圆顶周围的培养基，向一个孔中加入500微升细胞回收溶液（CRS）。刮取圆顶，用移液器反复吹打数次，使CRS与嵌入BMM圆顶中的肠类器官充分混匀，然后将此溶液转移至下一个孔。再次刮取圆顶，并反复吹打数次，随后将溶液转移至微量离心管中。

向第二孔中加入 500 µL CRS，用移液器吹打混匀，然后转移至第一孔。从第一孔开始，将 CRS 类肠器官 BMM 溶液收集至同一个 1.5 mL 微量离心管中，并对剩余各孔重复此收集步骤，直至所有孔中的内容物均转移至 CRS 中。将含有混合 CRS 溶液的微量离心管置于旋转仪上，在 4 °C 下孵育 1 小时。

然后在4摄氏度下以200 × g离心微量离心管3分钟，弃去上清液，并将类肠体沉淀重悬于1毫升50% LWRN条件培养基中。轻轻将500微升重悬的类肠体或培养基溶液转移至超低吸附24孔组织培养板的每个孔中。将培养板置于37摄氏度、5% CO2条件下孵育3天，之后进行实验。

使用前确保AO类器官在培养基中悬浮培养至少72小时。将每孔中悬浮的类器官连同培养基轻柔转移至微量离心管中。在室温下以300 × g离心3分钟，然后移除上清液。

每孔加入 10 微升浓度为 5 毫克/毫升的脂多糖（LPS）至 500 微升 50% LWRN 条件培养基中，配制主混合液；将处理组的 AO 类肠器官沉淀物重悬于 500 微升含 LPS 的 50% LWRN 条件培养基中。用移液器吹打混匀。将 500 微升悬液分装至 24 孔超低吸附培养板的每孔中。

同样将未处理对照组的AO类肠器官以每孔500微升含50% LWRN条件培养基的溶液重新悬浮，并将500微升该悬浮液分装至另一块24孔超低吸附培养板的每个孔中。使用含1%氧气、5%二氧化碳和94%氮气的模块化培养箱对经LPS处理的AO类肠器官诱导缺氧，并在缺氧和LPS条件下共培养类肠器官24小时。将未处理组以及LPS联合缺氧处理组的培养物置于含5%二氧化碳的培养箱中培养24小时。

为了使用 Lucifer Yellow（LY）测量旁细胞通透性，轻柔地将每个孔中的类肠体或培养基悬浮液转移至微量离心管中。将 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS）和 50% LWRN 条件培养基置于 37 摄氏度水浴中预热。在室温下以 300 × g 离心悬浮液 3 分钟。

移除培养基，用 500 微升预热的 DPBS 洗涤类肠体沉淀物，随后在 300 × g 离心 3 分钟。用微量移液器吸除上清液，并重复 DPBS 洗涤步骤一次。完成 DPBS 洗涤后，加入 450 微升预热的 50% LWRN 条件培养基，将悬液转移至 24 孔板中。

然后向每孔加入 50 µL 浓度为 2.5 mg/mL 的 LY。轻轻摇晃培养板以混匀，并将其置于含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 2 小时。用移液器小心地将每孔中的类肠体悬液转移至微量离心管中。

离心后弃去上清液，保留类肠体沉淀。用500 µL温的DPBS洗涤沉淀，再次离心。弃去上清液，保留沉淀。

用1000微升冷DPBS重悬沉淀前，重复用DPBS洗涤三次，并通过移液器剧烈混匀以解离类肠体。对于 Lucifer Yellow 标准曲线，按照文中所述用DPBS稀释配制标准品。将每种样品各150微升分装至96孔板中，每孔设三个复孔。

使用荧光酶标仪在激发波长428纳米、发射波长536纳米的条件下测定荧光值。使用统计学软件并通过四参数曲线拟合法对标准曲线进行插值，计算浓度。在50% LWRN培养基中悬浮培养72小时的类肠体进行免疫荧光染色显示，Zo-1位于类肠体外侧的顶膜表面，而β-catenin则位于基底外侧表面。

这表明类肠体出现了预期的极性反转，从而证实了类肠体的顶侧朝外（AO）构型。与未处理的对照组相比，经LPS和低氧处理的基底侧朝外（BO）类肠体表现出显著增加的通透性，这在荧光黄（Lucifer Yellow，LY）实验中表现为LY染料进入类肠体腔内的量增加。荧光黄实验还显示，与未处理的对照组相比，经处理的AO类肠体腔内LY的摄取量也显著增加。

与未处理的对照组相比，该实验确认了经LPS和缺氧处理的类肠体通透性增加。彻底洗涤类肠体沉淀物以确保清除所有肠腔外 Lucifer Yellow（LY）非常重要，这有助于在计算通透性时准确定量残留的肠腔内 LY。

对于定性分析，可通过荧光显微镜观察异硫氰酸荧光素葡聚糖（LY）被吸收进入类器官腔内的现象。在完成LY孵育及随后的洗涤步骤后，再进行微孔板读数前的解离操作。