通过颈内动脉注射癌细胞模拟脑转移

那么为什么这个协议很重要呢？好吧，脑转移瘤的治疗非常具有挑战性，并且该协议产生了具有最小颅外肿瘤的临床相关小鼠模型。该技术可以客观分析颅内肿瘤的药物分布和反应。

该技术的主要优点是该模型具有高度可重复性，并且在注射后相对较短的时间内发展脑转移。动物之间的疾病进展相似，使研究人员更容易标准化实验、治疗时间表和终点。我对初学者的建议是练习使用镊子和注射器，同时通过解剖显微镜观察，熟悉颈部周围的解剖标志并在兽医在场的情况下练习协议。

首先使用10毫升完全生长培养基将BT-474癌细胞以两倍10的接种密度接种到六个细胞的T-75烧瓶中，直到细胞达到70%至80%的汇合度后再注射。注射当天，弃去生长培养基，用PBS洗涤细胞单层两次，加入5毫升预热的细胞培养解离试剂。在 37 摄氏度下孵育五分钟或直到细胞脱落。

五分钟后，从培养箱中取出烧瓶并轻轻敲击以帮助细胞分离。加入五毫升含有10%FBS的完全生长培养基以淬灭解离试剂活性。通过移液轻轻重悬溶液中的细胞以减少细胞团块。

将细胞悬液转移到50毫升管中，并在室温下以180G离心三分钟。倒出上清液并将细胞沉淀重悬于不含钙和镁的 10 毫升 HBSSS 中，以尽量减少细胞结块。在室温下以180G离心细胞悬液三分钟，倒出上清液以除去残留的血清或解离试剂，并将细胞沉淀重悬于3毫升HBSS中。

将 100 微米的细胞过滤器放在新鲜的 50 毫升锥形管上，并通过细胞悬液以去除细胞团块。使用台盼蓝计算活细胞的数量，并用HBSS将细胞悬液稀释至细胞浓度为2.5乘以10至每毫升六个细胞。将管子水平放在冰上，并定期轻轻摇动管子以尽量减少结块。

细胞悬液可以在冰上储存最多六个小时。用于识别的耳孔鼠标，并使用电动剪从颈部区域剃掉皮毛。用胶带清洁裸露皮肤上多余的毛发。

将眼部润滑剂涂抹在眼睛上以防止干燥。使用粘在手术板上的线钩住上门牙，然后用胶带固定前腿和后腿，从而轻轻地固定鼠标。这一步在手术过程中伸展身体并保持颈部伸直。

对于术前皮肤准备，用局部消毒剂（如聚维酮碘）擦拭颈部，以减少皮肤微生物群落负荷并去除松散的毛发。从皮肤中心清洁，向外工作以防止切口部位再次污染。使用70%乙醇重复该过程，并交替进行三轮碘和乙醇消毒。

在继续手术之前，通过捏伤测试检查反射以确保麻醉死亡。在动物身上铺上无菌手术布。在解剖显微镜下，用剪刀沿着小鼠颈部区域的中线做一个垂直的15毫米切口，从下颌下方5毫米开始到胸廓入口。

使用两对倾斜的镊子，分开皮肤和下面的唾液腺，并应用牵开器以保持气管暴露。使用两对细角镊子，钝性地解剖气管附近的肌肉和脂肪组织，露出右颈动脉鞘。颈动脉鞘是覆盖颈总动脉、静脉和迷走神经的纤维层，该束可通过鲜红色的颈总动脉可见。

清除颈总动脉尾部的一部分到周围筋膜的颈动脉分叉处，并将其与迷走神经和静脉分开。从周围神经和筋膜中分离并清除颈动脉分叉。将细镊子放在颈外动脉下方，并在动脉下方进行5-0丝线缝合。

打结并收紧缝合线并切断多余的线。将细镊子放在颈总动脉下，并在动脉下进行5-0丝线缝合。打一个结，并在建议的注射部位附近的位置收紧缝合线。

剪开多余的缝合线，留下约10毫米的线。切割并润湿一条约 10 x 5 毫米的低绒毛一次性雨刷。折叠条并将其放置在建议的注射部位的颈动脉下方。

这将在注射过程中支撑容器。在拟议的注射部位的颈总动脉口，放置第三个松结结。只有在注射后才会收紧。

轻轻搅拌细胞悬液，用31号针头将200微升细胞悬液吸入胰岛素注射器中。将注射器装入连接到激活脚踏板的注射器驱动器中。用 31 号针头将细插管连接到注射器并灌注管路。

检查颈动脉位置是否良好并加压。使用两个细角镊子，一个轻轻张紧到第一个结扎的末端，另一个握住 31 号针，慢慢地将针头与斜面向上插入血管腔，注意不要刺穿它。以每秒10微升的速度缓慢将先前制备的100微升细胞悬液注入颈总动脉。

这将向第五个细胞输送2.5乘以10进入血管。成功的注射可以通过清除颈动脉血管中的血液来可视化。拔出针头后立即轻轻提起并收紧松散的结扎，以防止回流和出血。

修剪多余的缝合线并取下一块湿润的低绒毛一次性雨刷。使用 P-200 移液器，用 150 至 200 微升无菌水或生理盐水冲洗手术腔两次。检查出血后，将软组织、唾液腺和皮肤重新定位在颈动脉和气管上。

使用缝合针架，镊子和可吸收或不可吸收的6-0单丝缝合线以连续模式关闭切口的皮肤层。通过皮下注射注射每公斤丁丙诺啡50微克和每公斤美洛昔康1毫克作为术后疼痛缓解。将动物移至温暖干净的笼子中以从麻醉中恢复。

将凝集素注射到小鼠的颈总动脉中，有或没有颈外动脉结扎。当颈外动脉结扎时，在脸颊组织中观察到凝集素减少。结果显示，结扎不影响大脑输送。

使用表达荧光素酶的HER2扩增的乳腺癌细胞系监测肿瘤进展。BT474脑转移模型显示，从颈动脉内注射后第五周开始，生物发光信号增加，此后逐渐增加。从第五周到第八周，异质信号强度提示颅内肿瘤伴有复杂的液体灌注。

肿瘤区域内的钆浓度随着钆从血液循环泄漏到肿瘤组织中而增加。与未受累的脑区域相比，在肿瘤区域检测到更高的纳米药物水平，证实了BT-474小鼠中纳米药物和脑转移的积累。随着BT-474脑转移模型的进展，动物开始减轻高达20%的体重，使注射后九周的中位生存时间。

组织学结果描述肿瘤是单侧定位的，与颈动脉注射部位相匹配，其中肿瘤大多显示为固体孤立肿块。经常观察到空旷的空间口袋，由坏死细胞组成，而一些动物中也存在较小的生长物。尝试该方案时要记住的最重要的事情是在插入针头之前正确准备和定位颈动脉，然后在插入针头期间施加适当的张力。

该模型对于探索药物输送到大脑以及治疗脑转移的新疗法的疗效的研究人员很有用。