Name: 通过蓝光LED照明技术 估算 TLC板上化合物的产量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 学习使用蓝光LED照明技术结合薄层色谱法估算化合物产量。该方法安全高效、成本低廉，可同时测量多个样品，适用于生物化学和天然产物研究。

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本研究由中国台湾科技部资助（MOST 108-2320-B-110-007-MY3）。

本方案以洛伐他汀为例进行描述。&#160;洛伐他汀从培养一周的土曲霉中提取。
1. 化合物提取
注意：有关化合物提取的详细信息，请参见图1。
<ol>
	<li>在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，参见材料表）培养基上，于30 °C培养Aspergillus terreus。</li>
	<li>于40 °C干燥培养物24 h。使用灭菌镊子将干燥的培养物转移至50 mL离心管中，并加入15 mL乙酸乙酯。</li>
	<li>涡旋振荡混合物1 min，使其充分混匀，随后在40 °C、200 rpm振荡条件下孵育1 h。</li>
	<li>使用40 kHz超声波清洗仪（参见材料表），在40 °C条件下对混合物进行1 h超声处理。</li>
	<li>在室温下以5,000 x g离心1 min，随后通过11 µm滤纸过滤。</li>
	<li>在分液漏斗中用等体积的无菌水萃取滤液。</li>
	<li>相分离后，收集有机相，然后在旋转蒸发仪（参见材料表）中蒸发溶剂。将残留物溶解于2 mL乙酸乙酯中。</li>
</ol>
2. 通过正相吸附柱分离粗提物
<ol>
	<li>使用非极性硅胶作为固定相装填色谱柱，并以正己烷:乙酸乙酯:三氟乙酸（H:E:T；80:20:0.1，v/v/v）作为流动相。</li>
	<li>将2 mL提取物（步骤1）上样至色谱柱，以1 mL/min的流速加入流动相进行洗脱。 
	注意：流速通过旋塞手动控制。</li>
	<li>采用薄层色谱法（TLC）检测流出液，确认洛伐他汀的存在，随后在45 °C下使用旋转蒸发仪蒸发至溶剂完全除去。此步骤约需20–25分钟。</li>
	<li>将残留物溶于1 mL乙酸乙酯中，再加入等体积的1%三氟乙酸溶液并混合。</li>
	<li>将混合液在室温下以5,000 × g 离心1分钟，收集有机层至新的玻璃试管中。</li>
</ol>
3. 薄层色谱（TLC）板的制备与点样
<ol>
	<li>使用毛细管移液器将5 µL样品和洛伐他汀标准品（见材料表）点样至薄层色谱板的起始线上，薄层色谱板两侧各留出1 cm边缘。</li>
	<li>将薄层色谱板在通风橱中室温下干燥5分钟。</li>
	<li>用镊子轻轻将薄层板放入含有流动相溶剂的饱和玻璃展开槽中，用玻璃盖盖上展开槽，使薄层板充分展开。</li>
	<li>当溶剂前沿上升至距薄层板顶端1 cm时，将薄层板从展开槽中取出。</li>
</ol>
4. 蓝光LED照射器分析
<ol>
	<li>用铅笔标记溶剂线。在通风橱中于室温下干燥10分钟。</li>
	<li>干燥后，立即将薄层板浸入10% H2SO4溶剂中，随后在通风橱中于室温下再干燥10分钟。</li>
	<li>将薄层板置于加热板上，直至出现棕色斑点。注意避免过热，否则可能影响洛伐他汀的显色观察。</li>
	<li>将薄层板转移至蓝光LED照明仪中，使用兼容的免费软件（MiBio Fluo）进行扫描（参见材料表）。</li>
</ol>
5. 利用回归模型进行产量估算
<ol>
	<li>使用 ImageJ 软件（参见材料表）测量条带的尺寸。</li>
	<li>基于洛伐他汀标准品的递减浓度（包括 1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.5 mg/mL 和 0.25 mg/mL），利用数据分析与绘图软件（参见材料表）建立回归模型。</li>
	<li>应用该回归模型估算样品的产量。</li>
</ol>

<ol><li>Pyka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+progress+of+selected+drugs+in+TLC%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Detection progress of selected drugs in TLC.</a> BioMed Research International. 2014, 732078(2014).</li>
<li>Hess, A. V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitally+enhanced+thin-layer+chromatography%3A+An+inexpensive%2C+new+technique+for+qualitative+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis.</a> Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).</li>
<li>Ullah, Q., Mohammad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamins+determination+by+TLC%2FHPTLC-a+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Planar+Chromatography+-+Modern+TLC%22%5BJournal%5D)">Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review.</a> Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).</li>
<li>Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+identification+of+xanthine+oxidase+inhibitor+and+antioxidant+from+Erycibe+obtusifolia+by+a+drug+discovery+platform+composed+of+multiple+mass+spectrometric+platforms+and+thin-layer+chromatography+bioautography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography.</a> Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).</li>
<li>Duncan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+separations%3A+A+comparison+of+HPLC+and+TLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC.</a> Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).</li>
<li>Sherma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+in+food+and+agricultural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis.</a> Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).</li>
<li>Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+acetylsalicylic+acid+in+pharmaceutical+drugs+by+TLC+with+densitometric+detection+in+UV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV.</a> Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).</li>
<li>Poole, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+chromatography+at+the+turn+of+the+century%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Planar chromatography at the turn of the century.</a> Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).</li>
<li>Rapid Johnson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((simple+quantitation+in+thin-layer+chromatography+using+a+flatbed+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner.</a> Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).</li>
<li>El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+derivative+spectrophotometric%2C+TLC-densitometric%2C+and+HPLC+determination+of+acebutolol+HCL+in+presence+of+its+acid-induced+degradation+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).</li>
<li>Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase+ion-pair+HPLC+and+TLC-densitometric+methods+for+the+simultaneous+determination+of+ciprofloxacin+hydrochloride+and+metronidazole+in+tablets%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets.</a> Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).</li>
<li>Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+TLC-densitometric+method+for+the+quantification+of+a+steroidal+drug%2C+danazol+in+its+pharmaceutical+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Planar+Chromatography+-+Modern+TLC%22%5BJournal%5D)">Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations.</a> Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

本研究介绍了一种新方法——蓝光LED照明仪，用于在无需使用高效薄层色谱（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）等昂贵且专用设备的情况下定量化合物，并将该方法与生物测定法和紫外检测法进行了比较，以评估其定量性能。结果表明，蓝光LED照射法是一种相对安全、有效的协议，可用于定量薄层色谱板上目标化合物的产率。
既往研究已报道了多种无需使用专用定量设备的定量方法，所有这些研究均表明，其定量准确性接近使用专用设备的水平2,9,10,11,12（表2）。例如，El-Gindy 等人10比较了基于高效液相色谱法（HPLC）和薄层色谱-光密度法（TLC-densitometri...

薄层色谱法（TLC）在有机化学领域被广泛用作一种定性和定量分析技术1,2,3。TLC 的主要优点在于其检测速度快、样品需求灵活，且无需专用设备4。迄今为止，尽管已建立多种先进方法，薄层色谱法仍是鉴定混合物中未知样品的主要手段。然而，该方法面临的挑战在于缺乏安全且低成本的设备来量化样品产率，尤其是在预算有限的发展中实验室中。因此，本研究旨在开发一种高效、安全且低成本的方法，与薄层色谱法结合使用，以估算样品的产率。
与高效薄层色谱（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）相比，这些方法对样品要求严格、耗时较长且样品前处理步骤繁琐1,5，而薄层色谱（TLC）具有多项优势。首先，在样品前处理方面，HPLC 和 GC 无法检测粗提物，因为粗提物可能堵塞 HPLC 和 GC 的色谱柱。其次，当样品不适合紫外检测（HPLC 分析的关键要求）或挥发性较低（GC 分析的关键要求）时，TLC 仍可用于此类样品，且通过使用显色试剂，可使分离出的样品在薄层板上清晰可见6,7,8。第三，对于普通用户而言，与 TLC 相比，HPLC 和 GC 通常需要较长时间的独立操作前培训。此外，定量 TLC 分析，即高效薄层色谱（HPTLC），可通过高灵敏度扫描仪将 TLC 板上的信息数字化。然而，HPTLC 系统的成本相对较高。因此，开发一种经济高效且快速的 TLC 板样品定量方法是一个重要课题。
已有类似方法用于薄层色谱（TLC）产率的定量分析；例如，Johnson9 报道了一种通过将平板扫描仪连接至计算机来定量分析TLC板上样品的技术。2001年，El-Gindy 等人10 开发了TLC-光密度法（TLC-densitometric method），该方法利用光密度检测化合物，此后 Elkady 等人11 也应用了该技术。2007年，Hess2 提出了数字增强型薄层色谱法（digitally enhanced-TLC, DE-TLC），该方法结合数码相机与紫外光用于检测TLC板上化合物的产率。Hess 还比较了高效薄层色谱法（HPTLC）与DE-TLC方法的成本差异，并得出结论：由于DE-TLC成本低廉，适用于高中和大学实验室2。然而，TLC-光密度法的成本仍然较高，且紫外光源的操作需要经过充分培训，以避免使用者暴露于紫外辐射。因此，开发一种与TLC兼容、高效、安全且低成本的样品产率定量方法具有重要意义。
本研究描述了一种使用蓝光LED照明仪在薄层色谱板上检测样品的方案，建立了一个具有高可靠性的回归模型（高R平方值），用于测量条带的尺寸，进而确定化合物的产率。最后发现，蓝光LED照明法是一种相对安全的与. 紫外检测法），价格低廉（与. 气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）和高效薄层色谱（HPTLC），以及高效与生物测定法用于产量定量。

<table><tbody><tr><td>美国细菌学琼脂</td><td>Condalab</td><td>1802.00</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus terreus&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td>ATCC 20542</td><td></td></tr><tr><td>蓝光LED照明器</td><td>MICROTEK</td><td>Bio-1000F</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>HERAEUS Megafuge 8</td><td></td></tr><tr><td>小型紫外灯</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>MACRON</td><td>MA-H078-10</td><td></td></tr><tr><td>滤纸 125mm</td><td>ADVANTEC</td><td>60311102</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>免费软件</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>洛伐他汀标准品</td><td>ACROS</td><td>A0404262</td><td></td></tr><tr><td>MiBio Fluo&amp;nbsp;</td><td>MICROTEK</td><td>V1.04</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>C-ECHO</td><td>HH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab</td><td>9.1</td><td>https://www.originlab.com/origin</td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖肉汤 H</td><td>STBIO MEDIA</td><td>110533</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>EYELA</td><td>SB-1000</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Fluka</td><td>30743-2.5L-GL</td><td></td></tr><tr><td>薄层色谱硅胶板 60 F254</td><td>MERCK</td><td>1.05554.0001</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>10229873</td><td></td></tr><tr><td>超声波振荡仪</td><td>DELTA</td><td>DC600</td><td></td></tr></tbody></table>

估计薄层色谱板上化合物的产率 通过 蓝光led照射技术

Estimating the Yield of Compounds on the TLC Plate via the Blue-LED Illumination Technique

薄层色谱法（TLC）是一种易于实施的分析技术，已广泛应用于有机化学研究中，用于定量未知样品的产率。本研究建立了一种利用蓝光LED照明器估算TLC板上样品产率的有效、廉价且安全的方法。实验以从Aspergillus terreus中提取的洛伐他汀作为示例化合物。基于洛伐他汀标准品建立的回归模型用于评估洛伐他汀的产率。比较了三种方法：生物测定法、紫外检测法和蓝光LED照射法。结果表明，蓝光LED照射法在时间效率上显著优于紫外检测法和生物测定法。此外，由于生物测定法存在生物危害风险（如微生物感染），紫外检测法存在紫外线暴露风险，蓝光LED照射法相对更为安全。与需要专用仪器且独立操作前需长期培训的昂贵方法（如气相色谱法GC、高效液相色谱法HPLC和高效薄层色谱法HPTLC）相比，使用蓝光LED照明器是一种经济可行的TLC板样品产率估算方案。

本研究提出了利用蓝光LED照射法来估算化合物的产量，并对该方法进行了验证，同时与生物测定法和紫外检测法进行了比较（表1）。针对这三种方法，分别基于条带尺寸与标准品浓度建立了回归模型，用于预测样品的产量。首先，在生物测定法的结果中，抑菌圈尺寸与洛伐他汀标准品之间的决定系数（R²）为0.99，回归模型预测的样品产量为0.56 mg（图2）。其次，在紫外检测法中，洛伐他汀标准品与薄层色谱板上条带尺寸之间的R²为0.97，回归模型预测的样品产量为0.53 mg（图3）。值得注意的是，条带边缘模糊，且观察到信号强度相对较低的条带（图3A）。第三，在蓝光LED照射法中，洛伐他汀标准品与薄层色谱板上条带尺寸之间的R²为0.98，回归模型预测的样品产量为0.54 mg（图4）。使用蓝光LED照射仪预测的产量更接近以生物测定法作为对照的结果。条带尺寸与洛伐他汀的含量成正比，且蓝光LED...

本实验方案开发了一种利用蓝光LED照射技术估测薄层色谱板上化合物产率的方法。该方法具有安全、高效、成本低廉的优点，并可使研究人员同时测量多个样品。

估计薄层色谱板上化合物的产率 通过 蓝光LED照射技术

薄层色谱法（TLC）是一种易于操作的分析技术，已在有机化学研究中被广泛用于量化产物收率……

本实验方案建立了一种利用蓝光LED照射技术估测薄层色谱（TLC）板上化合物产率的方法。该方法的优势在于，蓝光LED照射技术安全、有效且成本低廉，并允许研究人员同时检测多个样品。该方法还可应用于生物化学与天然产物化学领域。首先，在 40 摄氏度下将培养物干燥 24 小时。使用灭菌镊子将干燥后的培养物转移至 50 毫升离心管中，并加入 15 毫升乙酸乙酯。涡旋剧烈振荡混合物一分钟，然后在 40 摄氏度下孵育该离心管，同时以 200 转/分钟振荡一小时。然后将混合物置于40千赫兹的超声波清洗仪中，在40摄氏度下超声处理1小时。接着在室温下以5,000 ×g离心1分钟，并通过11微米的滤纸过滤。在分液漏斗中用等体积的无菌水萃取滤液。相分离后，收集有机相，在旋转蒸发仪中将其蒸发，并将残余物溶解于2 mL乙酸乙酯中。使用正相硅胶作为固定相装填色谱柱，以正己烷-乙酸乙酯和三氟乙酸作为流动相。将2 mL提取物上样至色谱柱，以1 mL/min的流速加入流动相溶剂，洗脱提取物。通过薄层色谱法（TLC）验证流出液中存在洛伐他汀后，在45摄氏度下使用旋转蒸发仪蒸发至溶剂完全除去。将残留物溶解于1毫升乙酸乙酯中，然后与等体积的1%三氟乙酸混合。在室温下以5,000 ×g离心1分钟，收集有机层至新的玻璃试管中。使用毛细管移液器将五微升样品和洛伐他汀标准品点样至薄层色谱板的起始线上，薄层色谱板两侧各留出一厘米的边缘。随后将薄层色谱板置于通风橱中，室温下干燥五分钟。用镊子轻轻将薄层色谱板放入含有流动相溶剂的饱和玻璃展开缸中。用玻璃盖盖住层析缸，使薄层板充分展开。当溶剂前沿上升至距离薄层板顶端1厘米处时，将薄层板从层析缸中取出。用铅笔标记溶剂前沿位置，并在通风橱中室温下干燥10分钟。干燥后，立即将板浸入10%硫酸溶液中，然后在室温下于通风橱中干燥10分钟。接着，将板置于加热板上，直至出现棕色斑点。将板转移至蓝光LED照明仪上，使用兼容的免费软件进行扫描。生物测定法结果显示，抑制圈尺寸与洛伐他汀标准品之间的决定系数（R平方）为0.99，根据回归模型预测，样品得率为0.56毫克。紫外检测法结果显示，洛伐他汀标准品与薄层色谱板上条带尺寸之间的决定系数（R平方）为0.97，回归模型预测的样品得率为0.53毫克。然而，观察到条带边缘模糊，且信号强度相对较低。对于蓝光LED照射法，洛伐他汀标准品与TLC板上条带尺寸之间的R平方值为0.98，根据回归模型预测的样品产量为0.54毫克。使用蓝光LED照明器预测的产量更接近生物测定法结果，且获得了清晰的条带。如果薄层板过热，洛伐他汀的显色可能难以观察。

estimating-yield-compounds-on-tlc-plate-via-blue-led-illumination

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科研

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Biology

生物学

通过蓝光LED照明技术 估算 TLC板上化合物的产量

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学习使用蓝光LED照明技术结合薄层色谱法估算化合物产量。该方法安全高效、成本低廉，可同时测量多个样品，适用于生物化学和天然产物研究。

估计薄层色谱板上化合物的产率通过蓝光LED照射技术

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