Name: 视网膜组织中免疫染色半胱天冬酶-9的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 了解免疫组织化学方法用于定量视网膜组织中caspase-9的表达水平。该技术结合共聚焦显微镜成像，可识别细胞凋亡与非凋亡功能，为神经科学和细胞生物学研究提供可靠工具。

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本工作获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（NSF-GRFP）资助号 DGE - 1644869，以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）的资助，资助编号为 F99NS124180 NIH NINDS 多样性专项 F99（授予 CKCO），国家眼科研究所（NEI）5T32EY013933（授予 AMP），国家神经疾病与卒中研究所（RO1 NS081333、R03 NS099920，授予 CMT），以及美国国防部陆军/空军（DURIP，授予 CMT）的支持。

本方案遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。啮齿类动物实验已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准并接受其监督。
1. 视网膜组织的制备与冷冻切片
<ol>
	<li>通过腹腔注射麻醉剂（氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg））处死动物，并使用蠕动泵对接受视网膜静脉阻塞（RVO）处理的小鼠进行4%多聚甲醛（PFA）灌注固定。 
	注意：在实施安乐死和灌注前，应通过夹趾反应确认动物麻醉深度。有关灌注的详细信息，请参见8。更多灌注操作细节可参考16。</li>
	<li>使用镊子小心摘除眼球，并将眼球置于1 mL 4% PFA中，于4 °C条件下过夜固定。随后用1 mL 1×PBS洗涤三次，每次10分钟，并将样本置于摇床上振荡洗涤。</li>
	<li>将眼球浸入1 mL 30%蔗糖溶液中，持续3天，直至眼球沉降至管底，表明蔗糖已充分渗透。</li>
	<li>使用30 G注射器向眼球内注入最佳切割温度包埋剂（OCT），直至眼球呈现圆形（约注入50 µL）。</li>
	<li>将眼球置于冷冻模具中，用OCT包埋至完全覆盖，并于-80 °C冷冻，待进行冷冻切片时取出。</li>
	<li>使用恒冷切片机将包埋的眼球组织以20 µm厚度切片并贴附于载玻片上。
	<ol>
		<li>从冷冻模具中取出OCT包埋块。</li>
		<li>在恒冷切片机的样品头（chuck）上添加少量OCT，将包埋块固定其上，并置于恒冷切片机内直至冻结牢固。</li>
		<li>以20 µm厚度连续切片，直至观察到视网膜组织。 
		注意：可通过30倍放大倍数（3倍物镜，10倍目镜）的光学显微镜确认。视网膜组织可通过颜色和形态与OCT介质区分开来。</li>
		<li>将视网膜组织按每张载玻片四片连续切片的方式收集。 
		注意：视网膜切片的推荐排布方式见图1A。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用可去识别处理组和基因型信息的编号标记载玻片。</li>
	<li>将载玻片储存于-20 °C，待染色时取出。</li>
</ol>
2. 免疫组织化学
注意：进行免疫组织化学染色时应使用固定的冷冻保存组织，以维持细胞形态。选择与活体光学相干断层扫描（OCT）图像相对应层面的切片in vivo7。使用从恒冷箱切片机收集的前两组切片，或从视网膜组织深入150 µm处的切片。
<ol>
	<li>将载玻片置于黑暗且湿润的载片盒中。</li>
	<li>通透与封闭：用 300 µL 的 1× PBS 洗涤视网膜横切面 5 分钟，以去除 OCT 包埋剂，随后弃去 PBS。</li>
	<li>通过加入 300 µL 含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS，在室温（RT）下处理 2 小时以通透组织，随后弃去溶液。</li>
	<li>加入 300 µL 封闭液（含 10% 正常山羊血清（NGS）、1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS，过滤后使用），于 4 °C 过夜孵育以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>一抗孵育：将一抗用封闭液稀释。所用一抗包括 anti-cl-caspase-9（1:800）、anti-CD31（1:50）以及直接标记的一抗 anti-caspase-7-488（1:150）。 
	注意：请根据生产商推荐的条件选择合适的一抗稀释比例。
	<ol>
		<li>倾去切片上的封闭液，向视网膜载片上加入 100 µL 一抗混合液。</li>
		<li>于 4 °C 过夜孵育切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 300 µL 的 1× PBS 洗涤切片 4 次，每次 5 分钟。 
	注意：若组织切片非常脆弱，建议通过毛细作用去除洗涤液，即用吸水纸接触载玻片一角，避免移位视网膜切片。</li>
	<li>为避免同一宿主来源的一抗之间发生交叉标记，应在使用直接标记抗体前先完成二抗染色步骤。</li>
	<li>二抗孵育：将二抗以 0.1% 的浓度溶于封闭液中。例如，检测兔源的 anti-cl-caspase-9 时，使用山羊抗兔 IgG-568 作为二抗。
	<ol>
		<li>向视网膜组织上加入 200 µL 二抗混合液。</li>
		<li>于室温孵育 2 小时。</li>
		<li>用 300 µL 的 1× PBS 洗涤 4 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>用 0.02% 稀释度的 DAPI 溶液 300 µL 对细胞核染色 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 300 µL 的 1× PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在视网膜切片上滴加 500 µL Fluoromount-G 封片介质以保存荧光信号，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。</li>
</ol>
3. 共聚焦成像
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜获取染色切片的图像。
	<ol>
		<li>打开共聚焦显微镜。</li>
		<li>将玻片放置在载物台上。</li>
		<li>调节焦距，清晰观察视网膜切片。 
		注意：每个切片至少采集四幅图像，每只视网膜采集四个切片。参见视网膜成像示意图以了解建议的成像区域（图1B，C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用具备Z轴层扫功能的共聚焦显微镜，结合20x或40x物镜，对caspase、血管及细胞核染色进行成像。 
	注意：实验中所有成像的参数和软件设置应保持一致。20x物镜可提供由细胞核染色清晰界定的视网膜各层的整体概览，而40x物镜可提供更详细的细胞结构信息。
	<ol>
		<li>通过点击采集设置，为每个通道设置合适的曝光时间和激光强度。</li>
		<li>通过点击Z轴序列设置Z轴层扫，调整上下参数以覆盖组织的完整厚度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照冰冻切片过程中分配的掩码编号保存图像。</li>
</ol>
4. 半胱天冬酶水平的定量分析
<ol>
	<li>将 405、470、555 和 640 通道的图像文件拖动到 FIJI 的控制台。</li>
	<li>点击 图像 &#62; 颜色 &#62; 合并通道。</li>
	<li>按如下方式为文件分配颜色：555 通道设为红色，470 通道设为绿色，405 通道设为灰色，640 通道设为青色。</li>
	<li>通过点击 图像 &#62; 堆栈 &#62; Z 投影 来压缩 Z 堆栈。</li>
	<li>点击 投影类型：最大强度。</li>
	<li>点击 图像 &#62; 颜色通道工具 打开通道界面。</li>
	<li>打开 亮度与对比度 界面。</li>
	<li>选择 按通道设置参数。
	<ol>
		<li>进入 通道 并选择一个通道。</li>
		<li>将光标置于表达半胱天冬酶（caspase）的细胞上方，并记录像素值。</li>
		<li>将光标置于背景区域上方，并记录像素值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测试参数
	<ol>
		<li>进入 亮度与对比度&#160;界面。</li>
		<li>点击 选择。</li>
		<li>输入最小显示值（即表达半胱天冬酶细胞的标注像素值）。</li>
		<li>输入最大显示值（即背景区域的标注像素值）。</li>
		<li>点击 确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有通道重复步骤 4.8–4.9。</li>
	<li>从盲法处理的组织中随机选取图像测试参数。 
	注：仅当其他图像的背景值不适宜时，才调整亮度和对比度参数。</li>
	<li>参数确定后，打开图像文件并压缩 Z 堆栈。</li>
	<li>为半胱天冬酶通道以及等凝集素（isolectin）血管标记通道设置亮度和对比度参数。</li>
	<li>使用点工具，通过血管标记物与半胱天冬酶表达的共定位情况来定量血管阳性区域的数量。</li>
	<li>重复步骤 4.14，但使用 Hoechst 作为神经元阳性区域的标记物。</li>
	<li>在电子表格中按图像记录各项数值。</li>
	<li>按组织切片对数值取平均值。</li>
	<li>对各切片的平均值再取平均值，该结果即为每只眼的读数。</li>
</ol>
5. 内皮细胞caspase-9相关性的遗传学验证
<ol>
	<li>使用经RVO处理的Casp9FL/FL-VECad-CreERT2小鼠获取的视网膜组织7。</li>
	<li>按照上述第2节所述方法，对视网膜进行caspase-9（被敲除的caspase）、caspase-7（下游效应caspase）、血管标志物以及DAPI的免疫染色。</li>
	<li>按照上述第3和第4节所述方法进行成像与定量分析。</li>
</ol>
6. 靶向视网膜静脉阻塞中的caspase-9
<ol>
	<li>获取经视网膜静脉阻塞（RVO）处理后的小鼠眼球，并按照文献7所述方法将caspase-9抑制剂Pen1-XBir3局部应用于眼球。</li>
	<li>按照上述第2节所述方法，对视网膜进行caspase-7（一种下游效应caspase）、血管标志物和DAPI的免疫染色。</li>
	<li>按照上述第3和第4节所述方法进行成像和定量分析。</li>
</ol>

<ol><li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+cell+death%2C+inflammation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li>
<li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamirez%2C+MLG+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22">Seminars in Cell & Developmental Biology</a>. 82, Academic Press. 79-85 (2018).</li>
<li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+therapeutic+targets+in+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li>
<li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9%3A+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728(2021).</li>
<li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147 (4), 742-758 (2011).</li>
<li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+caspases+in+the+nervous+system%3A+implications+for+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980(2021).</li>
<li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li>
<li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137(2015).</li>
<li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li>
<li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li>
<li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+in+the+balance%3A+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li>
</ol>

作者声明存在以下竞争利益：C.M.T. 拥有以下专利申请：US20200164026、US20190142915 和 US20150165061。C.M.T. 与 S.S. 共同拥有一项专利申请 US 20140024597。C.M.T.、A.M.P. 和 M.I.A. 共同拥有一项专利申请 US2020058683。C.M.T. 与 Y.Y.J. 共同拥有一项专利申请 WO2018013519。M.I.A. 和 C.M.T. 被列为纽约市哥伦比亚大学受托人提交的专利申请 WO/2020/223212 的发明人。其余作者声明不存在竞争利益。

Caspase 是一个由多个成员组成的蛋白酶家族，其在细胞死亡和炎症中的作用已被广泛研究；然而，最近发现该家族中的一些成员还具有多种非死亡相关功能4,5。目前对 Caspase 功能的大部分认识主要来源于细胞培养实验以及人类疾病中的推断性数据。尽管已知在疾病状态下存在 Caspase 的异常诱导、激活或失活，但要从功能上明确 Caspase 是否驱动疾病病理过程仍具挑战性。许多用于检测特定 Caspase 的工具会同时识别多个家族成员，从而削弱了使用这些试剂所获得数据的功能相关性17。本文提供了一种在复杂组织中研究 Caspase 的实验方案，并以视网膜为例进行说明。在神经系统中，Caspase 的表达在出生前和出生后均呈下调状态，这使得可利用特异性抗体检测疾病模型中 Caspase 水平的变化。
尽管本实验方案的重点在于图像处理与分析，但该技术的成功还依赖于细致的组织制备、免疫组织化学（IHC）以及显微成像，以确保数...

半胱天冬酶（caspase）是一类蛋白酶家族，参与调控发育过程中的细胞死亡、免疫反应以及疾病中的异常细胞死亡1,2。尽管已知在多种神经退行性疾病中半胱天冬酶家族成员会被激活，但明确具体是哪种半胱天冬酶驱动疾病病理过程仍具挑战性3。此类研究需要借助工具来识别、表征并验证各个半胱天冬酶家族成员的功能。从机制和治疗角度而言，区分出相关的特定半胱天冬酶至关重要，因为已有大量文献表明半胱天冬酶具有多种不同的生物学作用4,5。因此，若目标是通过靶向某种半胱天冬酶以获得治疗效益，则必须实现对相关家族成员的特异性靶向。传统检测组织中半胱天冬酶水平的技术包括蛋白质印迹法（western blotting）、酶活性检测以及荧光测定方法3,6。然而，这些方法均无法实现细胞特异性的半胱天冬酶水平检测，在某些情况下，裂解后的半胱天冬酶往往也无法通过传统的蛋白质分析方法被检测到。已知半胱天冬酶在同一组织中可发挥凋亡性和非凋亡性等多种功能7，因此，准确理解发育和疾病相关通路，需要对细胞特异性的半胱天冬酶水平进行细致的表征。
本研究展示了在神经血管缺氧-缺血模型——视网膜静脉阻塞（RVO）中caspase的激活及其功能7,8。在视网膜等复杂组织中，RVO所诱导的缺氧-缺血可影响多种细胞类型，包括胶质细胞、神经元和血管系统7。在成年小鼠视网膜中，通过免疫组织化学（IHC）检测发现健康组织中caspase的表达极低7，但在发育过程中9或视网膜疾病模型中则并非如此10,11。免疫组织化学是一种在生物医学研究中广泛应用的技术，可用于验证疾病及病理靶点、通过空间定位发现新功能，并实现蛋白质的定量分析。当裂解型caspase产物无法通过Western印迹或荧光定量分析检测，或需明确特定caspase在细胞中的具体定位，或需通过定位手段研究caspase信号通路时，应采用免疫组织化学方法。
为了确定在视网膜静脉阻塞（RVO）中具有功能相关性的半胱天冬酶（caspase），本研究使用经过验证的半胱天冬酶抗体和细胞标志物抗体进行免疫组化（IHC）分析。实验室先前的研究表明，在缺血性脑卒中模型中，caspase-9 可迅速被激活，使用高特异性抑制剂抑制 caspase-9 可保护神经元免于功能障碍和死亡12。由于视网膜属于中枢神经系统（CNS），因此可作为研究 caspase-9 在神经血管损伤中作用的理想模型系统13。为此，采用小鼠 RVO 模型来研究 caspase-9 的细胞特异性定位与分布，及其在神经血管损伤中的意义。RVO 是工作年龄成年人失明的常见原因，由血管损伤引发14。研究发现，caspase-9 在内皮细胞中以非凋亡方式表达，而在神经元中则无表达。
作为一种组织，视网膜可被观察为平铺标本，便于观察血管网络，也可观察为横切面，以突出显示视网膜的神经元层结构。通过横切面中caspase蛋白表达的定量分析，可确定特定caspase在视网膜神经元连接及视觉功能中的潜在关键作用，从而明确caspase(s)在视网膜中的定位。在完成鉴定与验证后，可通过诱导型细胞特异性敲除所鉴定的caspase，实现对该caspase的靶向研究。针对潜在治疗性研究，可利用特异性工具抑制活化的caspase，以检验目标caspase的相关性。对于caspase-9，使用了一种细胞通透性高、高度选择性的抑制剂7,15 Pen1-XBIR3。本研究中采用了2月龄雄性C57BL/6J品系小鼠，以及以C57BL/6J为背景的他莫昔芬诱导型内皮细胞caspase-9敲除（iEC Casp9KO）品系小鼠。这些动物接受了视网膜静脉阻塞（RVO）小鼠模型处理，其中C57BL/6J小鼠接受了caspase-9选择性抑制剂Pen1-XBir3治疗。所述方法可推广应用于中枢和外周系统其他疾病模型的研究7,15。

<table><tbody><tr><td>抗 Caspase-7 488</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB-56529AF488</td><td>使用比例为 1:150</td></tr><tr><td>抗裂解型 Caspase-9</td><td>Cell Signaling</td><td>9505-S</td><td>使用比例为 1:800</td></tr><tr><td>抗 CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>使用比例为 1:50</td></tr><tr><td>共聚焦转盘显微镜</td><td>Biovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI 2.3.0</td><td>开源软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluormount G</td><td>Fisher</td><td>50-187-88</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>iCasp9FL/FL × VECad-CreERT2 小鼠</td><td>实验室构建</td><td></td><td>参见 Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>异凝集素（594, 649）</td><td>Vector</td><td>DL-1207</td><td>使用比例为 1:200</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>灌注泵&amp;nbsp;</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen1-XBir3</td><td>实验室构建</td><td></td><td>参见 Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Prism 9.1</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Fisher</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Vis-a-View 4.0</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

视网膜组织中免疫染色caspase-9的定量分析

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

半胱天冬酶（caspase）家族已知可介导多种超出细胞死亡范围的细胞通路，包括细胞分化、轴突导向以及增殖。自从发现细胞死亡蛋白酶家族以来，人们一直在寻找可用于识别并拓展该家族特定成员在发育、健康及疾病状态下功能的研究工具。然而，目前许多广泛使用的商业化caspase工具对靶向的caspase并不具有特异性。在本报告中，我们阐述了采用一种新型抑制剂结合遗传学方法及免疫组织化学检测手段，在神经系统中识别、验证并靶向caspase-9的研究策略。具体而言，我们以视网膜神经元组织作为模型，用于识别和验证caspase的存在及其功能。该方法能够探究特定细胞类型中caspase-9的凋亡性与非凋亡性功能，并可推广应用于其他复杂组织及感兴趣的caspase分子。深入理解caspase的功能有助于拓展当前细胞生物学的知识体系，同时因其在疾病中的参与作用，也有助于发现潜在的治疗靶点。

本方案可使用户分析并定量视网膜组织中的caspase-9水平。此外，该方案还提供了进一步识别、验证及特异性靶向caspase-9及其下游底物的工具。所总结的步骤可对荧光显微照片中的caspase水平及细胞特异性进行可量化的分析。所有图示均展示了未损伤及损伤后1天P-RVO视网膜横切面中总视网膜、内皮细胞和神经元内指定caspase水平的代表性荧光显微图像及定量结果。当使用Hoechst染色时，视网膜横切面可清晰显示视网膜节细胞层（RGL）、内核层（INL）和外核层（ONL）中的视网膜细胞核。此外，视网膜血管可见于视网膜网状层，或位于RGL与INL之间以及INL与ONL之间。由于血管的组织学特性，当视网膜被切片时，血管表现为不连续且分离的结构，分布于网状层中以提供血液供应。图2显示caspase-9在损伤后1天的P-RVO中受到高度调控。图3通过使用可诱导的内皮细胞敲除小鼠验证了内皮细胞中caspase-9的功能相关性。图4表明，通过药物学手段靶向活化的casp...

本文介绍了一种详细的免疫组织化学实验方案，用于在复杂组织中识别、验证和靶向具有功能相关性的半胱天冬酶（caspases）。

视网膜组织中免疫染色Caspase-9的定量分析

半胱天冬酶家族已知可介导多种超出细胞死亡的细胞通路，包括细胞分化、轴突导向以及……

本方案提供了一种详细的免疫组织化学方法，用于在复杂组织中识别、验证和靶向具有功能相关性的半胱天冬酶。该技术的主要优势在于能够探究细胞类型特异性的凋亡性及非凋亡性caspase-9功能，并可推广应用于其他复杂组织及感兴趣的半胱天冬酶。深入了解半胱天冬酶的功能有助于拓展当前细胞生物学领域的认知，同时因其参与多种疾病过程，也有助于发现潜在的治疗靶点。使用染色后视网膜切片的共聚焦显微镜图像开始定量分析半胱天冬酶（caspase）水平。具体操作为：将405、470、555和640通道的图像文件拖动至Fiji的控制台，依次点击图像、颜色和合并通道（merge channels）选项卡，为各通道文件分配对应颜色。然后通过点击图像堆栈并选择Z投影来压缩Z堆栈。将投影类型设置为最大强度。通过点击图像，然后选择颜色通道工具，打开通道界面。接下来，打开亮度和对比度界面。要按通道选择参数，请进入通道的标签页并选择一个通道。将光标置于背景上方，记录像素值。然后将光标置于表达caspase的细胞上，标注其像素值。为测试参数，请进入亮度与对比度界面并点击选择，输入最小显示值或表达caspase的细胞的像素值。然后输入显示的最大值或背景像素值，再点击确定。从盲法处理的组织中选择随机图像，并针对每个通道重复参数选择，以测试所有通道的参数。参数设定后，打开图像文件并压缩Z轴堆栈。设置caspase通道的亮度和对比度参数，以及作为血管标志物通道的凝集素（isolectin）的相应参数。使用点状工具，通过血管标志物与caspase表达的共定位作为阳性区域的读数，定量分析阳性血管区域的数量。然后以钩状结构（hooks）作为阳性神经元区域的标志物，定量分析阳性血管区域的数量。根据每张图像在电子表格中标注数值，并按区段对数值取平均。对区段的平均值再取平均，该值将作为每只眼的读数。该方案确定了caspases的细胞定位以及caspases表达的神经视网膜层。视网膜横切面经染色后可显示视网膜神经节细胞层（RGL）、内核层（INL）和外核层（ONL）中的视网膜细胞核。在横切面上，视网膜血管呈现为分离且不连续的结构，分别供应RGL与INL之间的网状层以及INL与ONL之间的网状层。视网膜横切面还可鉴定出视网膜静脉阻塞后一天时受到严格调控的caspase-9。在内皮细胞敲除小鼠中，caspase-9 抑制在降低神经元caspase-7表达方面效果更显著，这验证了内皮细胞caspase-9的功能相关性。代表性分析显示，通过药物抑制caspase-9活性可阻断视网膜静脉阻塞后caspase-7的表达。该技术的成功依赖于精细的组织制备以及免疫组化和显微成像，以确保数据的一致性、有效性和可靠性。该方法可与蛋白质印迹分析相结合，用于半定量比较caspase信号通路。本技术提供了检测靶向RVO中活化caspase-9的治疗策略有效性的步骤。该方法也可应用于其他组织，包括脑组织。

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视网膜组织中免疫染色半胱天冬酶-9的定量

白内障是全球致盲的首要原因。太阳紫外线辐射（UVR）是白内障发生的主要危险因素。目前已建立远紫外B波段（UVR-B）诱导白内障的动物模型。本文介绍白内障形成的研究方法：紫外线辐射暴露、定量RT-PCR和免疫组织化学。...

分子机制的表征 体内 UVR 诱导的白内障

来源：Lani-Louzada, R.，等．大鼠手术诱导性青光眼的角膜缘血管丛全周烧灼术．J. Vis. Exp.

烧灼诱导眼内高压后视网膜神经节细胞胞体的定量分析

本文所述方案用于整体视网膜标本的结构评估。内容包括组织解剖、将标本贴附于亲水化处理的聚四氟乙烯（PTFE）膜插片上、通过团注方式加载荧光标记物，以及比较碳二亚胺与多聚甲醛固定在细胞和突触组分免疫组织化学分析中的应用效果。...

用于成像和免疫组织化学的视网膜全层铺片制备的优化方案

心肌梗死（MI）不仅会导致心脏功能受损，还会引发杏仁核的细胞凋亡，杏仁核是参与心肌梗死后行为学改变的脑区。本方案描述了如何诱导心肌梗死、采集杏仁核组织，并检测其中的caspase-3活性——一种细胞凋亡的标志物。...

通过光谱荧光法测定心肌梗死后大鼠杏仁核中的 Caspase-3 活性

本方案描述了从人血液样本中获取单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）的工作流程，一种在不损害细胞活力和行为的前提下，将炎症性半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）报告系统高效导入人MDM的简便方法，以及一种基于成像的技术，用于在活细胞中检测炎症性半胱天冬酶的激活。...

人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化

本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内...

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

本实验方案描述了两种通过荧光底物结合流式细胞术或荧光分光光度计来检测caspase活性的方法。...

使用荧光定量法或流式细胞术检测Caspase活性

已建立一种保护性检测方法，用于监测视网膜血管对糖尿病或糖尿病视网膜病变相关损伤（如氧化应激和细胞因子）导致的细胞死亡的抵抗能力。...

一种检测小鼠视网膜血管免受糖尿病相关死亡的保护作用的实验方法

本文介绍了一种制备小鼠视网膜冷冻切片并对感光细胞进行免疫染色的实验方案。该方法可帮助研究人员稳定地获得形态保存良好、免疫染色质量高的小鼠视网膜冷冻切片。...

小鼠视网膜的冷冻切片与免疫染色

我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内...

小鼠视网膜神经节细胞的转染 体内 电穿孔

了解免疫组织化学方法用于定量视网膜组织中caspase-9的表达水平。该技术结合共聚焦显微镜成像，可识别细胞凋亡与非凋亡功能，为神经科学和细胞生物学研究提供可靠工具。

视网膜组织中免疫染色Caspase-9的定量分析

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