Name: 用于癌症表观遗传学研究的ATAC-Seq优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学习ATAC-Seq优化技术用于癌症表观遗传学研究，通过Tn5转座酶消化和PCR扩增分析染色质可及性变化。该方法可识别疾病相关调控元件，为设计新治疗策略提供重要依据。

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我们衷心感谢北达科他大学基因组学核心设施提供的卓越技术协助。
本工作由美国国立卫生研究院 [P20GM104360 资助 M.T.，P20 GM104360 资助 A.D.] 以及北达科他大学医学院与健康科学学院生物医学科学系提供的启动资金 [资助 M.T.] 资助。

1. 实验开始前的准备工作
<ol>
	<li>配制裂解缓冲液储备液。 
	注意：不同细胞类型所需的最适核分离缓冲液可能有所不同。我们建议使用台盼蓝染色法，对原始文献8中所述的低渗缓冲液和CSK缓冲液12,13在每种细胞类型中进行测试。
	<ol>
		<li>配制低渗缓冲液（Greenleaf缓冲液）：混合10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM NaCl、3 mM MgCl2 和 0.1% NP-40。</li>
		<li>配制CSK缓冲液：混合10 mM PIPES（pH 6.8）、100 mM NaCl、300 mM蔗糖、3 mM MgCl2 和 0.1% Triton X-100。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保细胞培养条件处于最佳状态；在光学显微镜下观察细胞，确认无明显程度的凋亡现象。</li>
	<li>开启离心机，使其温度降至4 °C。</li>
</ol>
2. 细胞收获
<ol>
	<li>从细胞培养物中吸除培养基 &#60;80% 汇合度。根据所需细胞数量、处理条件等因素，细胞通常培养于 35 mm 或 60 mm 培养皿中。</li>
	<li>用 1 mL 或 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>加入0.5 mL或1 mL胰蛋白酶，孵育2–3分钟（根据细胞类型而定）。小心使用1 mL移液器充分混匀。</li>
	<li>向培养板中加入 1 mL 或 2 mL 培养基，充分混匀。转移至 15 mL 圆锥形离心管中。在 15 mL 管中以 300 x g 离心 3 分钟 g. 
	注意：建议使用水平转子以尽量减少细胞损失。</li>
	<li>吸除培养基并重悬细胞&#160;在1 mL或2 mL培养基中。 
	注意：制备均一的单细胞悬液至关重要。对于组织样本，可使用Dounce匀浆器进行匀浆，以减少大块细胞团或聚集体。某些组织需要过滤（例如细胞筛）和/或通过FACS细胞分选来分离活细胞，从而获得单细胞悬液。</li>
	<li>使用细胞计数器对细胞进行计数。 
	注意：本研究中使用了自动细胞计数仪（材料表) 被使用。</li>
	<li>离心所需的细胞体积（例如，含有 1 x 106 基于细胞计数的细胞）在300 x g 室温（RT）下持续3分钟。</li>
	<li>重悬含有 1 x 10⁶ 个细胞的细胞沉淀6 1 mL 冷 PBS 中的细胞 
	注意：如果细胞数量少于 1 x 106&#160;细胞，减少冷PBS体积，以制备相同浓度（1 x 106&#160;细胞/毫升</li>
</ol>
3. 细胞裂解
<ol>
	<li>转移 25 µL（= 2.5 × 104 细胞）转移至新的1.7 mL微量离心管中。离心&#160;500 × g 条件下离心 5 分钟 g 在 4 °C 下小心弃去上清液 
	注意：建议使用水平转子以尽量减少细胞损失。保留约 3 µL 上清液，以确保细胞不被丢弃。</li>
	<li>加入25 µL裂解缓冲液，轻轻吹打混匀使细胞重悬。冰上孵育5分钟。</li>
	<li>离心5分钟，500 x g g 在 4 °C 下并小心地&#160;弃去上清液。 
	注意：建议使用水平转子以尽量减少细胞损失。保留约 3 µL 上清液，以确保细胞不被丢弃。</li>
</ol>
4. Tn5 标签化反应
<ol>
	<li>立即将沉淀重悬于 25 µL Tn5 反应混合液中。Tn5 反应混合液的组成为：12.5 µL 2x Tagmentation DNA 缓冲液（TD 缓冲液）、1.25–5 µL Tn5 转座酶以及 11.25–7.5 µL 无核酸酶水。 
	注：Tn5 的标准用量为每 2.5 × 104 个细胞使用 2.5 µL。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 30 分钟。 
	&#8203;注：每 10 分钟混匀一次反应液。</li>
</ol>
5. DNA 纯化
注意：在扩增之前必须进行纯化。使用 MinElute PCR 纯化试剂盒（材料表）进行 DNA 纯化。
<ol>
	<li>加入 5 µL 的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）。</li>
	<li>立即加入 125 µL Buffer PB，并充分混匀。</li>
	<li>从第 2 步开始，按照 PCR 纯化试剂盒的操作说明进行操作。
	<ol>
		<li>将离心柱放入一个 2 mL 收集管中。</li>
		<li>将样品加入离心柱中，在室温下于 17,900 x g 离心 1 分钟。</li>
		<li>弃去穿流液，并将离心柱重新放回同一收集管中。</li>
		<li>向离心柱中加入 750 µL Buffer PE，在室温下于 17,900 x g 离心 1 分钟。</li>
		<li>弃去穿流液，并将离心柱重新放回同一收集管中。</li>
		<li>将离心柱在室温下离心 5 分钟，以彻底干燥膜。</li>
		<li>弃去穿流液，并将离心柱放入一个新的 1.7 mL 微量离心管中。</li>
		<li>用 10 µL Buffer EB 洗脱 DNA 片段。</li>
		<li>让离心柱在室温下静置 1 分钟。</li>
		<li>在室温下于 17,900 x g 离心 1 分钟，以洗脱 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. PCR 扩增
注意：为了进行测序，必须对转座（片段化）后的 DNA 进行 PCR 扩增。本示例中使用了 Nextera 试剂盒接头（材料表）。本研究中使用的引物列于表 1中。
<ol>
	<li>在200 µL PCR管中配制以下PCR反应体系（每样本50 µL）。PCR反应混合液组成如下：10 µL洗脱DNA（步骤5）、2.5 µL 25 mM Adapter 1、2.5 µL 25 mM Adapter 2、25 µL 2x PCR预混液和10 µL无核酸酶水</li>
	<li>执行PCR扩增程序第一部分（表2). 
	注意：初始扩增时，所有样本均使用标准热循环仪，并采用相同的反应条件。</li>
	<li>实时定量 PCR（每个样本总体积 14.5 µL）
	<ol>
		<li>使用PCR扩增第一部分（步骤6.2）产物的5 µL，配制以下反应体系，此次需加入SYBR Gold，并在实时荧光定量PCR仪中进行检测。</li>
		<li>按如下方法配制PCR反应混合液：5 µL 第6.2步的PCR产物，0.75 µL SYBR gold（1000倍稀释），5 µL 2x PCR预混液，以及3.75 µL无核酸酶水。 
		&#8203;注意：每个样本在达到饱和前进行文库扩增的精确循环数由qPCR确定表3以减少PCR中的GC含量和片段大小偏差10SYBR Gold 用无核酸酶水稀释。配制稀释液时，将 1 µL SYBR Gold（储存浓度 10,000x）加入到&#160;999 µL 无核酸酶水。文中提到的 RT-qPCR 运行时间 表3 约为 60 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据步骤6.3的运行参数确定所需增加的PCR循环次数。
	<ol>
		<li>循环次数 = 1/4 最大（饱和）荧光强度对应的循环数（通常为 3 或 4 个 PCR 循环）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR 扩增程序第二部分（体积 = 45 µL； 表4）：确定循环次数后，根据步骤6.4.1计算的结果设置额外的PCR循环数。例如，若计算出的循环数为3，则在下方程序中设置3个循环。总循环数为8（步骤6.2中的5个循环，加上步骤6.5中的3个额外循环）。</li>
</ol>
7. 磁珠纯化
注意：此处使用了 AMPure XP（材料表）磁珠。
<ol>
	<li>向上一步扩增的 PCR 产物中加入 150 µL 室温的磁珠。 
	注意：此步骤可使用自制的 AMPure 磁珠14。</li>
	<li>在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上静置 5 分钟。</li>
	<li>小心移除上清液。</li>
	<li>用 200 µL 80% 乙醇洗涤磁珠。 
	注意：80% 乙醇应现配现用。</li>
	<li>重复步骤 7.4。</li>
	<li>彻底去除乙醇。</li>
	<li>在室温下空气干燥样品 10 分钟。</li>
	<li>用 50 µL 洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0）重悬样品。</li>
	<li>重复磁珠纯化步骤（步骤 7.1–7.9），以进一步减少引物污染。</li>
</ol>
8. DNA 浓度与质量检测
<ol>
	<li>使用核酸定量试剂盒（材料表）测定DNA浓度。</li>
	<li>通过凝胶电泳（使用SYBR Gold染色，0.5×TBE缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶）或自动化电泳系统（例如TapeStation、bioanalyzer）检测扩增的DNA片段。</li>
</ol>
9. 测序
<ol>
	<li>使用扩增的DNA样本进行高通量测序12,13。 
	&#8203;注意：扩增的DNA样本已可用于高通量测序。为保留核小体DNA片段信息，建议采用双端测序而非单端测序。DNA片段的两端可指示转座酶结合的位置。为定位开放染色质区域，每个样本通常需要3000万条读长。</li>
</ol>
10. 数据分析
<ol>
	<li>基于碱基识别质量的数据过滤：将平均碱基质量分数最低值设为20（准确率为99%）。</li>
	<li>接头序列切除：使用合适的工具去除接头序列。 
	注意：采用Trim Galore封装工具（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）去除接头序列。对于Illumina Tn5制备的ATAC-seq文库，使用以下序列为接头序列：CTGTCTCTTATACACATCT。识别接头污染的最小序列长度设为5。</li>
	<li>基因组比对：使用Bowtie并设置以下参数&#34;-I 0 -X 2000 -m 1&#34;15将测序读段比对至相应基因组。以下为MDA-MB-231基底样乳腺癌细胞的比对质量示例： 
	至少有一个比对结果的读段比例：52.79% 
	比对失败的读段比例：13.10% 
	因-m参数限制而被抑制比对的读段比例：34.11%</li>
	<li>去重：使用Picard工具标记PCR重复序列16。</li>
	<li>生成用于数据可视化的基因组覆盖度文件：将去重后的成对末端读段转换为单端读段片段。使用bedtools中的genomeCoverageBed工具生成基因组覆盖度轨迹图17。</li>
</ol>

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<li>Bhattacharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+channel+proteins+ORAI3+and+STIM1+mediate+TGF-%CE%B2+induced+Snai1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression.</a> Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).</li>
<li>Schep, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+nucleosome+fingerprints+enable+high-resolution+mapping+of+chromatin+architecture+within+regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions.</a> Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).</li>
</ol>

作者声明，不存在与本文所述研究相关的任何重要或实质性的经济利益。

ATAC-seq 已被广泛用于绘制开放和活跃的染色质区域。癌细胞的进展通常由遗传改变和表观遗传重编程驱动，导致染色质可及性和基因表达发生改变。这种重编程的一个例子是在上皮-间质转化（EMT）及其逆向过程间质-上皮转化（MET）中观察到的现象，这些过程被认为是肿瘤转移期间关键的细胞重编程事件30。另一个例子是在管腔型乳腺肿瘤中，常观察到对激素治疗产生耐药性31。ATAC-seq 有助于在染色质水平上监测此类细胞表型变化，并可用于预测肿瘤起源细胞及癌症亚型4。
为了精确测量ATAC-seq中的染色质重塑，必须建立一种可重复且一致的实验方案。本文描述了一种ATAC-seq文库优化的标准策略。以MDA-MB-231和NMuMG细胞系的ATAC-seq数据为例，展示了优化过程。NMuMG细胞已被用于研究上皮-间质转化（EMT），而MDA-MB-231细胞则被用于研究其逆向过程——间质-上皮转化（MET）。这些细胞模型此前已被用于研究EMT和MET过程...

染色质可及性是全基因组范围内基因表达调控的关键前提1染色质可及性的改变通常与多种疾病状态相关，包括癌症。2,3,4多年来，研究人员已开发出多种技术，通过绘制染色质可及性区域来探究染色质景观。其中一些技术包括 DNase-seq（DNase I 超敏感位点测序）5FAIRE-seq（甲醛辅助分离调控元件）6，MAPit（单个模板甲基转移酶可及性检测方法）7，以及本文的重点 ATAC-seq（转座酶可及染色质检测）8DNase-seq 利用 DNase 的一个关键特性来绘制可及区域图谱，即优先消化不含组蛋白及其他蛋白质（如转录因子）的裸露 DNA。5FAIRE-seq 与 ChIP-seq 类似，均利用甲醛交联和超声处理，但无需进行免疫沉淀，而是通过酚-氯仿抽提分离无核小体区域。6MAPit 方法利用 GC 甲基转移酶在单分子分辨率下探测染色质结构7ATAC-seq 依赖于高活性转座酶 Tn58Tn5转座酶优先结合开放的染色质区域，并将测序接头插入可及区域。Tn5通过DNA介导的方式发挥作用 &#34;剪切并粘贴&#34; 转座酶预先结合接头后，通过该机制结合开放的染色质位点，切割DNA并连接接头8通过使用与这些接头退火的引物进行PCR扩增，回收Tn5结合区域。FAIRE-seq和DNase-seq需要大量的起始材料（约100,000至225,000个细胞），并在测序前需要独立的文库构建步骤。9另一方面，ATAC-seq 方案相对简单，且所需细胞数量较少（&#60;50,000 个细胞10与FAIRE-seq和DNase-seq技术不同，ATAC-seq的测序文库构建相对简便，因为Tn5转座酶已在片段化DNA的同时将测序接头标记至DNA片段上。因此，文库构建仅需使用适当的引物进行PCR扩增即可完成，无需进行末端修复和接头连接等前期处理步骤，从而节省了时间11其次，ATAC-seq 避免了 MAPit 所需的亚硫酸氢盐转化、克隆以及使用区域特异性引物进行扩增的步骤。7由于这些优势，ATAC-seq 已成为定义开放染色质区域的一种极为流行的方法。尽管 ATAC-seq 方法操作简便，但多个步骤仍需优化，以获得高质量且可重复的数据。本文讨论了标准 ATAC-seq 文库制备的优化流程，尤其强调以下三个参数：（1）裂解缓冲液组成，（2）Tn5 转座酶浓度，（3）细胞数量。此外，本文还提供了利用癌性和非癌性贴壁上皮细胞在优化条件下获得的示例数据。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>天然色</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L XL TipOne 吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>带滤芯且低吸附</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;L XL TipOne RPT 吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td>带滤芯且低吸附</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;L XL TipOne 吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840</td><td>带滤芯且低吸附，斜面级</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L TipOne RPT 吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1183-1810</td><td>带滤芯且低吸附</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L TipOne RPT 吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td>带滤芯且低吸附</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>YBP136010</td><td>遗传分析级</td></tr><tr><td>本研究中使用的所有细胞系均购自 ATCC</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>364658</td><td>SX2415</td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>磁珠纯化试剂盒</td></tr><tr><td>CellDrop 细胞计数仪</td><td>DeNovix</td><td>CellDrop FL</td><td>细胞计数仪</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>BioUltra 级，无水，&amp;ge;99%（滴定法）</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC615100020</td><td>无水；Fisher Scientific - Decon Labs 消毒产品</td></tr><tr><td>胎牛血清 - 经 TET 检测</td><td>R&amp;D Systems</td><td>S10350</td><td>三重 0.1 &amp;micro;m 过滤</td></tr><tr><td>Gibco DMEM 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td>[+] 4.5 g/L D-葡萄糖；[+] L-谷氨酰胺；[-] 丙酮酸钠</td></tr><tr><td>Gibco PBS 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Gibco 胰蛋白酶-EDTA 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>（0.25%），含酚红</td></tr><tr><td>甘油</td><td>IBI Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Qubit 荧光计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MilliporeSigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>IBI Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>BioXtra 级，&amp;ge;98%（酸量法），颗粒状（无水）</td></tr><tr><td>NEBNext 高保真 2x PCR 预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA 样本制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td>含 2x TD 和 Tn5 转座酶</td></tr><tr><td>NP-40（IGEPAL CA-630）</td><td>MilliporeSigma</td><td>I8896</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>PCR 检测系统</td><td>BioRad</td><td>1855484</td><td>CFX384 实时系统，C1000 Touch 梯度 PCR 仪</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1851</td><td>经 BioPerformance 认证，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen；核酸定量试剂盒</td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>MilliporeSigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠</td><td>自制</td><td>-</td><td>pH 5.2</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>IBI Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix，1.25 mL</td><td>BioRad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>T100 梯度 PCR 仪</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure 0.2 mL PCR 8联管条</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td>无弹性，天然聚丙烯</td></tr><tr><td>TempPlate 384孔 PCR 板</td><td>USA Scientific</td><td>1438-4700</td><td>单缺口，天然聚丙烯</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>MilliporeSigma</td><td>648311</td><td>ULTROL 级</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>IBI Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq 双端索引测序引物试剂盒</td><td>Illumina</td><td>PE-121-1003</td><td>双端测序</td></tr><tr><td>台盼蓝染液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>BioXtra 级，黏稠液体</td></tr><tr><td>水</td><td>MilliporeSigma</td><td>W3500</td><td>经无菌过滤，BioReagent 级，适用于细胞培养</td></tr></tbody></table>

atac-seq 在癌症表观遗传学研究中的优化

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

利用高通量测序技术检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）通过高活性Tn5转座酶来探测脱氧核糖核酸（DNA）的可及性。Tn5在可及的染色质区域切割DNA并连接适用于高通量测序的接头。在真核细胞中，基因组DNA被包装成染色质，即由DNA、组蛋白及其他蛋白质组成的复合物，该结构对转录机制构成物理屏障。响应外界信号时，转录因子会招募染色质重塑复合物，使转录机制能够接触DNA，从而激活基因表达。因此，在监测癌症进展等生物学过程中增强子和基因启动子活性时，鉴定开放染色质区域具有重要意义。由于该实验方案操作简便且所需细胞数量少，ATAC-seq已被广泛用于定义多种细胞类型（包括癌细胞）中的开放染色质区域。为了成功获取数据，在构建ATAC-seq文库时需考虑多个参数。其中，细胞裂解缓冲液的选择、Tn5酶的滴定以及起始细胞体积对癌细胞ATAC-seq文库的制备尤为关键。优化这些条件对于获得高质量数据至关重要。本文详细描述了针对上皮细胞类型的ATAC-seq优化方法。

为了获得成功且高质量的ATAC-seq数据，优化实验条件至关重要。ATAC-seq文库构建可分为五个主要步骤（图1），即细胞裂解、标签化（Tn5介导的片段化和接头插入）、基因组DNA纯化、PCR扩增以及数据分析。作为初始步骤，必须针对每种细胞类型首先优化细胞裂解（细胞核分离）缓冲液。在裂解乳腺癌细胞时，可使用原始ATAC-seq论文中描述的低渗缓冲液8或CSK缓冲液12,13。台盼蓝染色可用于确认细胞核的分离效果18。在MDA-MB-231、T47D、MCF7和A375等人源癌细胞系的ATAC-seq文库构建中，多个研究团队均采用了CSK缓冲液12,13,19,...

ATAC-seq 是一种DNA测序方法，利用高活性突变型转座酶Tn5来绘制由转录因子介导的染色质可及性变化图谱。ATAC-seq有助于揭示癌细胞表型改变背后的分子机制。本方案概述了在上皮细胞类型（包括癌细胞）中进行ATAC-seq的优化步骤。

ATAC-Seq 在癌症表观遗传学研究中的优化

高通量测序转座酶可及性染色质检测（ATAC-seq）利用转座酶探针检测脱氧核糖核酸（DNA）的可及性，通过...

ATAC-seq 能够帮助我们识别基因组中开放染色质区域的状态，这种状态在疾病条件下通常与正常状态相比发生改变。该技术具有所需细胞输入量少、Tn5 酶切步骤简化的实验流程、随后通过 PCR 扩增进行片段化 DNA 的分离和文库构建，以及更短的实验周期等优势，因而更具优越性。通过 ATAC-seq 比较正常与疾病状态下表观遗传景观的改变，有助于揭示与疾病相关的染色质调控元件，并为设计新的治疗策略提供有用信息。该技术操作简便，因为不包含任何关键的实验步骤。要获得成功的ATAC-seq结果，仅需进行几个标准化步骤。首先，从含有每毫升一百万个细胞的PBS细胞悬液中转移25微升至1.7毫升的微量离心管中，在4摄氏度下以500 ×g离心5分钟。小心弃去上清液，加入 25 µL 裂解缓冲液。轻轻吹打重悬细胞，在冰上孵育 5 分钟。于 4 °C 以 500 ×g 离心 5 分钟，小心弃去上清液。立即将沉淀重悬于25 µL Tn5反应混合液中，在37°C孵育30分钟，每10分钟混匀一次。向Tn5转座DNA溶液中加入5 µL 3 M醋酸钠和125 µL PB缓冲液。充分混匀。接下来，将离心柱放入一个2毫升收集管中，并将样品加入离心柱中。在室温下以17,900 ×g离心1分钟，弃去穿流液。向柱中加入PE缓冲液，离心柱子。将离心柱放回原来的收集管中，离心5分钟以彻底干燥膜。弃去穿流液，将离心柱转移至新的1.7毫升微量离心管中。用10微升洗脱缓冲液EB洗脱DNA片段，在室温下静置1分钟。然后在室温下以17,900 ×g离心1分钟，以洗脱DNA。在200微升PCR管中建立PCR反应，并进行PCR扩增程序第一部分。进行实时定量PCR时，通过加入5 µL PCR产物、0.75 µL 1,000倍稀释的SYBR Gold、5 µL 2X PCR主混合液以及3.75 µL无核酸酶水来配制PCR反应体系。根据运行参数确定所需的额外PCR循环次数。确定循环数后，使用先前计算出的额外循环数设置PCR反应。向扩增的PCR产物中加入150微升磁珠，室温孵育15分钟。将离心管置于磁力架上静置5分钟，小心移除上清液。用200微升80%乙醇洗涤磁珠，然后移除上清液。完全去除乙醇，并在室温下将样品空气干燥10分钟。最后，用50微升洗脱缓冲液重新悬浮。将离心管置于磁力架上，然后将洗脱液转移至新的1.7毫升微量离心管中。此处展示了使用台盼蓝比较细胞裂解效率的结果。NMuMG 细胞经低渗缓冲液和 CSK 缓冲液处理后，用台盼蓝染色。在经 CSK 处理的细胞中观察到更高的细胞裂解效率。ATAC-seq 文库由 MDA-MB-231 乳腺癌细胞制备。PCR 扩增后，在磁珠纯化前后，将 PCR 产物在 0.5X TBE、1.5% 琼脂糖凝胶上进行分析。引物大部分在初始磁珠纯化步骤中被去除。1X TAE 1%琼脂糖凝胶电泳和自动化电泳的DNA条带模式也已标出。此处显示的DNA片段使用SYBR Gold染色以可视化。同时展示了显示ERS1位点的基因组浏览器轨迹图。该图像显示了T47D细胞中ATAC-seq数据的基因组覆盖情况。使用了先前发表文献中的引物，其靶向区域以黄色标出。此处展示了一个柱状图，描述了ATAC-seq文库中引物扩增子的富集情况。ATAC-seq 文库使用低渗缓冲液或 CSK 缓冲液制备。代表性图像显示了 ATAC-seq 优化的基因组浏览器可视化结果。来自 25,000 个细胞起始量条件的 ATAC-seq 数据显示出最高的无核小体片段富集度，而 100,000 个细胞起始量条件则呈现出最高的单核小体 DNA 水平。此处展示了来自不同细胞数量的ATAC-seq数据的基因组浏览器轨迹。该代表性图像显示了HOMER峰注释分析结果。HOMER将每个峰分类为启动子近端峰或远端峰。细胞数量、裂解缓冲液的选择以及Tn5酶的浓度等参数取决于细胞类型，是必须标准化的最关键参数。在切割-连接技术中，Tn5与蛋白A融合，广泛用于通过针对目标蛋白的特异性抗体来鉴定该目标蛋白的DNA结合位点。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

用于癌症表观遗传学研究的ATAC-Seq优化

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。...

通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）是一种全基因组范围检测染色质可及性的方法。本方案为针对人淋巴细胞（Th1/Th2）优化的逐步ATAC-seq实验流程，涵盖从分子实验到最终计算分析的完整步骤。该方案适用于无下一代测序方法经验的研究人员。...

通过ATAC-Seq技术绘制原代人T淋巴细胞全基因组染色质可及性图谱

本文介绍了将工程化分裂型TET2酶（CiDER）导入哺乳动物细胞的详细实验方案，用于化学诱导DNA羟甲基化及表观遗传重塑。...

一种可化学诱导DNA羟甲基化与表观遗传重塑的工程化分裂型TET2酶

本文介绍了一种优化的高通量染色质免疫沉淀测序（ChIP-sequencing）实验方案及相应的计算分析流程，用于从冻存的肿瘤组织和细胞系中确定全基因组范围内的染色质状态模式。...

利用高通量ChIP-测序在肿瘤组织中进行全基因组染色质状态作图的整合平台

本文介绍了一种在活化的人类CD4+淋巴细胞上进行转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）的实验方案。通过引入一种新的裂解缓冲液，该方案经过优化，可将线粒体DNA读段的污染从50%降至3%。...

线粒体DNA污染低的原代人CD4+ T淋巴细胞ATAC-seq检测

在此，作者展示了MULTI-seq在表型分析及后续配对的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）中的应用价值，用于表征视网膜中的转录组和染色质可及性谱型。...

利用单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序对视网膜基因表达与染色质可及性进行多重分析

我们介绍一种针对脂肪细胞的高通量测序转座酶可及染色质分析（ATAC-seq）方案，该方法专门利用携带核荧光标记的转基因报告小鼠分离的脂肪组织，通过细胞核分选实现。...

使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪组织进行脂肪细胞特异性ATAC-Seq

本文概述了一种从小鼠骨髓中分离中性粒细胞并构建ATAC-seq文库的实验方案，旨在确保中性粒细胞的高存活率和高质量文库的制备。文章提供了骨髓细胞制备、免疫磁珠分选及文库构建的详细步骤，为中性粒细胞研究领域的新手研究人员提供了有价值的参考指南。...

小鼠骨髓来源中性粒细胞的ATAC-Seq文库制备

本文介绍了一种快速简便的ATAC-seq实验方案，仅需30 µL线虫沉淀，即可应用于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

完整 Caenorhabditis elegans L4 幼虫中的染色质可及性分析

学习ATAC-Seq优化技术用于癌症表观遗传学研究，通过Tn5转座酶消化和PCR扩增分析染色质可及性变化。该方法可识别疾病相关调控元件，为设计新治疗策略提供重要依据。

ATAC-Seq 在癌症表观遗传学研究中的优化

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