用于癌症表观遗传学研究的ATAC-Seq优化

ATAC-seq使我们能够识别基因组中开放染色质区域的状态，与正常状态相比，该区域在疾病状态下经常发生改变。更少的细胞输入，简化的Tn5消化方案，然后通过PCR扩增分离片段DNA和文库制备，以及更短的实验时间使其成为一种更具优势的技术。通过ATAC-seq比较正常和疾病状况之间改变的表观遗传景观可以阐明与疾病相关的染色质调节元件，并有助于设计新的治疗策略。

这种技术很容易执行，因为它不包括任何关键的实验步骤。要获得成功的 ATAC-seq 结果，只需要几个标准化步骤。首先，将 25 微升从含有每毫升 100 万个细胞的 PBS 细胞悬液转移到 1.7 毫升微量离心管中，并在 500 G 下在 4 摄氏度下离心五分钟。

小心地弃去上清液，并加入25微升裂解缓冲液。通过轻轻上下移液重新悬浮细胞，并在冰上孵育五分钟。在4摄氏度下以500G离心5分钟，然后小心地弃去上清液。

立即将沉淀重新悬浮在25微升Tn5反应混合物中，并在37摄氏度下孵育30分钟。每10分钟混合一次溶液。向Tn5标记的DNA溶液中加入5微升3摩尔乙酸钠和125微升缓冲PB。

混合均匀。接下来，将离心柱放入2毫升收集管中，并将样品施加到离心柱上。在室温下以17， 900 g离心一分钟，并丢弃流出物。

将PE缓冲液添加到色谱柱中，然后旋转色谱柱。将离心柱放回同一收集管中，离心五分钟以完全干燥膜。丢弃流通物，并将离心柱放入新的1.7毫升微量离心管中。

用10微升缓冲液EB洗脱DNA片段，让色谱柱在室温下静置一分钟。然后在室温下以17， 900 G离心一分钟以洗脱DNA。在200微升PCR管中设置PCR反应，并进行PCR扩增程序第一部分。

对于实时 QPCR，通过加入 5 微升 PCR 产物、0.75 微升 1， 000 倍稀释的 SYBR 金、5 微升 2X PCR 预混液和 3.75 微升无核酸酶水来制备 PCR 反应混合物。使用运行参数确定所需的额外PCR循环次数。确定周期数后，使用之前计算的其他周期设置 PCR。

向扩增的PCR产物中加入150微升磁珠，并在室温下孵育15分钟。将试管放在磁性支架上五分钟，然后小心地除去上清液。用200微升80%乙醇洗涤珠子，并除去上清液。

完全除去乙醇，并在室温下风干样品10分钟。最后，用50微升洗脱缓冲液重新悬浮。将试管放在磁性支架上，然后将洗脱液转移到新鲜的1.7毫升微量离心管中。

此处显示了使用台盼蓝的细胞裂解效率比较。用低渗缓冲液和CSK缓冲液处理NMuMG细胞，并用台盼蓝染色。在CSK处理的细胞中观察到更高的细胞裂解效率。

ATAC-seq文库由MDA-MB-231乳腺癌细胞制备。PCR扩增后，在磁珠纯化前后在0.5X TBE，1.5%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。引物大多通过初始磁珠纯化去除。

还指示来自 1X TAE 1% 琼脂糖凝胶电泳和自动电泳的 DNA 条带图。SYBR Gold用于可视化此处所示的DNA片段。此处提供了显示ERS1位点的基因组浏览器轨迹。

T47D细胞中ATAC-seq数据的基因组覆盖率如图所示。使用先前出版物的引物，其目标区域以黄色突出显示。此处显示了描述ATAC-seq文库中引物扩增子富集的条形图。

ATAC-seq文库由低渗缓冲液或CSK缓冲液制备。代表性图像显示了用于ATAC-seq优化的基因组浏览器可视化。来自25， 000个细胞输入条件的ATAC-seq数据显示无核小体片段的富集最高，而100， 000个细胞输入条件的单核小体DNA最高。

此处显示了显示来自不同细胞数的ATAC-seq数据的基因组浏览器轨迹。这张代表性图像描述了HOMER峰注释分析。HOMER将每个峰分类为启动子近端或远端峰。

细胞裂解缓冲液的细胞输入次数选择和取决于细胞类型的Tn5酶浓度是必须标准化的最关键参数。在切割和粘性技术中与蛋白A融合的Tn5被广泛用于使用针对目标蛋白质的特异性抗体鉴定目标蛋白质的DNA结合位点。