使用 In Vivo 成像技术在哺乳动物宿主活跃感染期间筛选 Candida albicans 突变菌株的形态发生表型

白色念珠菌的形态发生由多种环境信号触发。通过在体内研究形态发生过程，我们正在明确该生物体如何整合并响应所有这些环境信号。该技术的主要优势在于，它使我们能够在不存在体外模型系统可能引入的偏倚或人为假象的情况下研究形态发生。

很少有人具备皮内注射的经验。我强烈建议初次接触此技术的人员联系动物资源兽医以获得学习指导。本次操作演示将由本实验室团队的博士后研究员 Rohan Wakade 进行。

在接种前，至少用不含叶绿素的饲料喂养动物七天，以完成接种前的准备。注射前一天，用牙签从一个菌落中取少量白色念珠菌细胞。接种25毫升YPD培养基，并重复此过程数次，以获得来自多个不同菌落的细胞。

将培养物在30摄氏度的摇床培养箱中以175转/分钟的转速振荡培养过夜。取1毫升培养物，在500 × g离心2分钟，然后用1毫升无菌DPBS将酵母洗涤3次。将沉淀重悬于1毫升无菌DPBS中，并将培养物按1:100比例稀释。

使用血细胞计数板对细胞进行计数，并据此调整细胞密度。接下来，通过将参照菌株与实验菌株等体积混合，制备用于注射的接种物。使用棉签蘸取市售脱毛膏，均匀涂抹于麻醉动物双耳的内侧和外侧表面。

两到三分钟后，先用干燥的纱布轻轻擦拭耳部，随后使用浸透无菌水的纱布垫擦拭，以彻底清除脱毛膏残留物。用70%乙醇对耳部表面进行消毒后，通过反复倒置小瓶或涡旋振荡充分混匀接种物。用胰岛素注射器吸取20至30微升接种物。

将针头保持垂直向上，轻轻敲击注射器，确保筒内任何气泡均升至顶部。小心地将空气和多余的接种物排回接种管或废液管中，使活塞位于10 µL刻度处。将非处方双面皮肤胶带贴在小型锥形或圆底塑料管上，将耳朵搭在胶带上，注意避免移位麻醉用鼻罩。

保持注射器针头几乎与皮肤平行，避开较大的静脉，将针尖刺入皮肤最外层，直至斜面完全进入皮肤，然后缓慢将接种物皮内注射。成功的皮内注射会在皮肤上形成一个小气泡。注射后保持针头在原位15至20秒再从耳部拔出，以尽量减少渗漏。

根据机构规程，使用生物危害标签标记笼具，表明笼内动物已感染白色念珠菌。使用与制备接种物时相同的洗涤培养物，在 RPMI 1640 培养基中制备细胞 1 至 50 的稀释液，该培养基需添加 10% 经加热灭活的胎牛血清，并在 37°C 下以旋转振荡方式孵育四小时。使用显微镜检查样品。

至少计数100个细胞，记录每种菌株的酵母细胞和丝状细胞数量。将长工作距离物镜旋转到位，并在镜头上滴加一滴浸油。降低镜头，以避免放置盖玻片时可能造成的损坏。

将1.5号盖玻片置于载物台开口上方，并用胶带固定。升高物镜，使浸油与物镜镜头和盖玻片均接触。将麻醉鼻罩固定在显微镜载物台上，确保动物处于成像位置时，鼻罩能完全覆盖其鼻部。

将麻醉小鼠的鼻部放入鼻罩中。在物镜上方的盖玻片上滴加一滴无菌水。调整麻醉鼻罩并安置小鼠，使小鼠的耳朵位于水滴上方。

取另一块盖玻片，将盖玻片的边缘与小鼠身体平行放置，使其边缘接触小鼠耳根与头部连接处。通过铰链式动作，将盖玻片的自由边缘缓缓放下至显微镜载物台上。当盖玻片接触显微镜载物台时，会将小鼠耳朵压平。

用胶带将顶部盖玻片牢固固定，施加适当压力以保持耳朵平整，同时避免胶带粘住小鼠的毛发或胡须。除非使用带有环境控制舱的显微镜，否则应用无菌铺巾松散覆盖小鼠身体，以维持其正常的体温环境。采用白光宽场成像，调节焦平面至耳部组织，并聚焦于血管中流动的红细胞。

为了获得足够高的信噪比，从而能够确定视野中所有细胞的形态，可调整激光功率或成像速度。为避免组织损伤，应使用尽可能低的激光功率。选择一个在参照菌株中可见清晰丝状结构、且大多数生物体分布足够分散、其形态可被确定的视野。

设置Z轴层叠图像的顶部和底部焦平面。无需覆盖感染区域的整个深度，但需注意，位于成像体积顶部或底部的生物体通常会被排除在分析之外。采集Z轴层叠图像，对每个通道进行伪彩着色以区分不同菌株，并将各通道叠加。

保存图像。使用成像软件将Z轴层叠图像进行最大强度投影，生成二维图像。根据菌株类型和形态，对最大投影图像中观察到的每个生物体进行计数。

该参考菌株在体外可快速形成菌丝，而EFG1缺失株则无法形成菌丝。EFG1缺失株在体内也表现出显著的菌丝形成缺陷。

大约9%的EFG1缺失细胞在体内以菌丝形式生长。类似地，与参照菌株相比，CYR1缺失突变株在体外表现出菌丝形成缺陷。相比之下，53%的CYR1缺失突变细胞在体内以菌丝形式生长。

CYR1 空白突变体形成的菌丝比参照菌株更短。接种时必须保持针头与皮肤平行。目的是将接种物置于皮肤外层下方不远处。

该技术还可与表达荧光蛋白的小鼠品系联用，这些小鼠的特定宿主细胞表达荧光蛋白，从而允许我们在活体条件下研究宿主与病原体之间的相互作用。