Name: 使用 体内 成像筛选哺乳动物宿主活动性感染期间 白色念珠 菌突变菌株的形态发生表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜在哺乳动物宿主体内筛选白色念珠菌突变菌株的形态发生表型。该方法通过皮内注射技术实现无创成像，帮助研究人员在真实感染环境中研究真菌致病机制。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R01AI33409及爱荷华大学卡弗医学院儿科系资助。

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<li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+and+filaments+have+specialized%2C+independent+activities+in+a+zebrafish+model+of+Candida+albicans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection.</a> Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).</li>
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<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li>
<li>Brothers, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase-driven+phagocyte+recruitment+controls+Candida+albicans+filamentous+growth+and+prevents+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634(2013).</li>
<li>Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recipe+for+the+preparation+of+a+rodent+food+that+eliminates+chlorophyll-based+tissue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology.+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199(1995).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该模型利用共聚焦显微镜获取图像 C. albicans 生物体在哺乳动物宿主组织内生长时的形态发生表型，从而能够在活跃感染过程中评估形态发生表型。形态发生过程在 C. albicans 发病机制，并已通过多种方法被广泛研究 体外 检测方法2,3,4。然而，没有 体外 该检测方法能够完全模拟宿主复杂的生物化学和结构环境。
本方案重点介绍此方法的使用 体内 成像系统用于筛选一系列/文库 C. albicans 突变体以鉴定感染过程中参与形态发生的基因。利用 C. albicans 表达不同荧光蛋白的菌株使我们能够定量分析 体内 形态发生 C. albicans 与参考菌株相比，突变菌株的形态发生情况在相同感染区域进行比较，可确保生物体处于相同的环境条件下。这使得我们能够对发生菌丝化的细胞百分比以及菌丝化程度进行定量测量。将突变菌株的测量结果相对于参考菌株进行归一化处理，有助于更准确地比较不同突变菌株之间的表型差异。
此处展示的代表性结果表明，in vitro 与 in vivo 表型之间可能存在显著差异。C. albicans efg1ΔΔ 突变株通常被用作形态发生实验的阴性对照，因其在几乎所有 in vitro 条件下均无法形成菌丝20。尽管 in vivo 结果与 in vitro 结果非常相似，但即使是这种严重受损的菌株，偶尔也能在宿主组织环境中形成菌丝（图 3）。这凸显了宿主环境在诱导形态发生方面的强大作用。
相比之下， cyr1ΔΔ突变菌株表现出显著的不一致性 体外 和 体内 生长；尽管没有一种突变细胞发生丝状化 体外大约一半的细胞以丝状形式生长 体内 (图4)10,21有趣的是，这些丝状结构明显短于参考菌株形成的丝状结构，表明 CYR1 有助于影响菌丝生长速率或维持丝状表型的能力。为便于分析菌丝长度，采用图像的二维投影测量菌丝的曲线路径长度。对于在三维空间中生长的菌丝的二维投影，任何沿非平行于成像平面轴向生长的菌丝 xy 平面投影中的长度将短于其真实长度。由于参照菌株也会出现相同的缩短效应，因此对二维投影中丝状结构长度分布的评估仍可实现参照菌株与突变菌株之间的定量比较。相较于三维分析，二维条件下的丝状结构长度分析所需图像处理工作量更小，因此可在普通台式计算机上相对较快地完成。采用这种简化的分析方法，可将丝状结构长度分布纳入筛选流程，从而在不显著降低通量的前提下，更细致地评估各突变株进行形态发生的潜力。
此处展示的代表性研究使用了DBA2/N小鼠，该品系小鼠的补体系统存在缺陷，导致无法将中性粒细胞募集至炎症部位 C. albicans 感染22这些研究的目的是探讨调控机制 C. albicans 在宿主组织内的菌丝形成。因此，选用DBA2/N小鼠以避免因特定品系对中性粒细胞的易感性或抗性而干扰实验结果。随着中性粒细胞的抗C. albicans 反应可能影响丝状化过程23，中性粒细胞向感染部位的募集可能会影响形态发生实验的结果。如果某菌株具有形成菌丝的能力 体内 但当中性粒细胞存在时，菌丝形成会受到强烈抑制，因此在DBA2/N小鼠中可检测到菌丝形成，而在具有完整中性粒细胞趋化功能的小鼠中则难以观察到该现象。因此，选用作为宿主的小鼠品系是使用本方案时的一个重要因素。
观察到的现象是 efg1ΔΔ突变菌株无法形成菌丝 体内 不太可能与宿主中性粒细胞反应相关，因为该菌株同样无法形成菌丝 体外观察到的丝状化现象 体内 与 cyr1ΔΔ突变株与其无法形成菌丝的现象不一致 体外斑马鱼模型的数据 C. albicans 感染表明，响应的中性粒细胞在抑制形态发生过程中具有重要作用24因此，使用缺乏中性粒细胞反应的DBA2/N小鼠不太可能解释菌丝形成增加的现象 cyr1ΔΔ 体内 与……相比 体外然而， 体内 环境显然正在影响形态发生过程 cyr1ΔΔ菌株；因此，对该菌株的进一步研究可能提供有关调控机制的重要信息 C. albicans 活性感染期间的形态发生。此处描述的方案设计为一种筛选实验，用于鉴定诸如 cyr1ΔΔ突变株可用于未来的研究。
使用低流量气体麻醉系统对此方案非常有帮助（图1A、B）。在本方案的初期开发阶段，小鼠采用氯胺酮与赛拉嗪混合的注射麻醉剂进行麻醉。尽管使用该麻醉方法可进行有限的成像，但麻醉持续时间难以预测，必须快速结束成像过程，以避免小鼠在成像期间从麻醉中苏醒。传统的吸入式麻醉系统体积庞大，且需要高流量的麻醉气体，通常必须在通风橱内使用。因此，在共聚焦显微镜有限的空间条件下，使用传统吸入式麻醉系统极为困难，且可能无意中使研究人员暴露于麻醉剂中。采用低流量吸入式麻醉系统可在为动物提供稳定麻醉的同时，保障操作人员的安全。低流量鼻罩便于动物在接种和显微成像过程中的准确定位。小口径、低容积的输送管路可使用相对较长的管道，使麻醉机可放置在足够远的位置，避免干扰显微成像操作。
普通小鼠饲料中的叶绿素会导致组织产生显著的自发荧光25。这会在图像中引入大量背景噪声，使得获取高质量、高空间分辨率的图像变得困难。在成像前让动物食用无叶绿素饲料7天，可显著降低组织中的自发荧光背景，但沉积在毛发中的叶绿素仍会造成干扰。使用市售的化学脱毛膏去除耳廓上的毛发，可有效减少毛发产生的自发荧光（图1C、D）。因此，结合使用无叶绿素饲料和充分的脱毛处理，可显著降低自发荧光，大幅提高图像质量。由于在成像前已去除耳部毛发，动物毛发的颜色不会影响该成像系统。本方案已成功用于研究白色念珠菌（C. albicans）在BALB/c（白色）、C57BL/6（黑色）和DBA2/N（棕色）小鼠中的感染。该方案也可用于缺乏不同宿主基因的C57BL/6基因敲除小鼠，从而为今后研究哺乳动物宿主免疫系统如何影响菌丝形成提供可能。本模型的一个特点未在本方案中详细讨论：由于该成像系统具有非侵入性，同一动物可在数天内多次成像，从而实现对单个感染过程的动态追踪。这一特点将在未来关于宿主-病原体相互作用的研究中发挥关键作用。
总之，本方案可获得高空间分辨率的图像 C. albicans 在活体哺乳动物宿主组织中生长，从而实现对突变菌株形态发生过程的准确评估8,9,10. 本文展示的结果说明了如何利用该方案对文库进行筛选 白色念珠菌 突变体。在 C. albicans 迄今为止检测的突变体中，具有已知形态发生缺陷的突变体占很大比例 体外 易于发生丝状化 体内9,10。这凸显了包含一个 体内 此类系统在旨在阐明机制的实验中 C. albicans 发病机制

白色念珠菌 是一种常见的人类真菌病原体，可引起黏膜皮肤疾病、播散性疾病和局部组织感染1一个关键特征是 白色念珠菌 生理学上的复杂多态性生长与其作为共生菌和病原体的双重角色密切相关2,3,4在营养丰富的条件下 体外 在30 °C时，通常以卵圆形出芽酵母形式生长。多种环境刺激，包括营养缺乏、pH变化、37 °C培养、血清暴露以及在琼脂中包埋培养，均可诱导其转变为极性生长模式，从而形成真正的菌丝和/或假菌丝。5极性生长的起始及由此导致的丝状生物生长被称为形态发生。
由于形态发生对生物体的毒力具有重要意义，菌丝形成的调控机制已被广泛研究6,7。存在一个复杂的信号通路网络和转录调控机制，可触发形态发生。尽管白色念珠菌（C. albicans）的形态发生与其致病性密切相关，但大多数研究形态发生的实验均采用体外（in vitro）刺激来诱导菌丝形成。目前越来越明确的是，不同的体外（in vitro）菌丝化模型在所激活的特定调控通路上并不完全相同。此外，尚无任何体外（in vitro）培养条件能够紧密模拟宿主内的复杂环境。鉴于白色念珠菌（C. albicans）作为人类病原体的重要性，本实验方案的目标是利用中等通量的系统，在哺乳动物宿主的主动感染过程中研究其形态发生，从而允许研究人员筛选白色念珠菌（C. albicans）突变体文库。
为了促进这些研究，一种 体内 成像系统已开发出来，使我们能够获得高空间分辨率的图像 C. albicans 使用倒置共聚焦显微镜观察麻醉小鼠耳廓感染过程中的细胞变化8,9,10由于耳廓皮肤非常薄，因此无需进行组织解剖即可获得这些图像。因此，可在宿主组织内感染活跃部位直接测量定量表型数据。本文所述方案包括将不同荧光蛋白表达盒转化至一个参考菌株和一个或多个突变菌株中11,12表达荧光蛋白的菌株随后混合，并共同皮内注射。感染建立后，采用共聚焦成像技术定量分析菌丝形成的频率以及所形成菌丝的长度。突变菌株获得的数据均以同一组织区域内存在的参照菌株数据进行归一化处理，从而提供内部对照。该系统已使我们能够成功筛选多个系列的 C. albicans 突变菌株，其中许多存在形态发生缺陷 体外9,10许多菌株易于形成菌丝 体内，凸显了其重要性 体内 用于研究形态发生的模型。

<table><tbody><tr><td>#1.5 盖玻片</td><td>Thermo-Fisher</td><td>20811</td><td>足以覆盖万能载物台开口的尺寸</td></tr><tr><td>0.1 mL 胰岛素注射器</td><td>EXELint</td><td>26018</td><td>可使用5/16规格的注射器&quot;&amp;ndash;1/2&quot; 长且29&amp;ndash;32 G</td></tr><tr><td>dPBS 中的 3.7% 甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBJ5734</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇/30% 水</td><td>Decon Laboratories</td><td>A05061001A</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒片</td><td>Covidien</td><td>5110</td><td>替代方法：用70%异丙醇浸泡的纱布垫</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;白色念珠菌&lt;/em&gt; 参考菌株和实验菌株</td><td>SN250</td><td>FGSC 在线目录</td><td>特定的 &lt;em&gt;白色念珠菌&lt;/em&gt; 菌株的选择因实验和研究者的目标而异。我们使用了源自 SC5314 的菌株以及其他临床分离株。</td></tr><tr><td>无叶绿素小鼠饲料</td><td>Envigo</td><td>2920x</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7050</td><td>能够运行成像软件以进行图像采集与分析的计算机。多种成像软件可供选择，具体取决于所使用的显微镜型号及用户系统。</td></tr><tr><td>棉签 applicator</td><td>Pro Advantage</td><td>76200</td><td></td></tr><tr><td>DBA2/N（6-12 周龄小鼠）</td><td></td><td></td><td>BALB/c 和 C57/BL6 小鼠也可使用。&amp;nbsp; 后者可利用广泛可用的基因敲除小鼠模型，以及通过荧光蛋白的表达来标记特定细胞类型（如吞噬细胞）的小鼠模型。</td></tr><tr><td>用于将织物固定在皮肤上的双面胶带（时尚胶带）</td><td>当地药店或杂货店</td><td></td><td>专为固定衣物与人体皮肤接触位置而设计的双面胶带。&amp;nbsp; 这通常可在药店和各类商店的非处方药区域购得。&amp;nbsp; 必须使用这种类型的胶带，因为它专为轻柔粘附皮肤而设计。&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 示例：&amp;nbsp;&lt;br/&gt; https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&amp;和关键词&lt;br/&gt; 时尚胶带&amp;amp;qid=1649174406&amp;amp;sprefix=&lt;br/&gt; 时尚胶带,配件,70&amp;amp;sr=8-40&lt;br/&gt; https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&amp;和关键词&lt;br/&gt; 时尚胶带&amp;amp;qid=1649174320&amp;amp;sprefix=&lt;br/&gt; 时尚胶带、配件、70&amp;amp;sr=8-26&lt;br/&gt; https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&amp;和关键词&lt;br/&gt; 时尚胶带&amp;amp;qid=1649174406&amp;amp;sprefix=&lt;br/&gt; 时尚胶带、配件、70&amp;amp;sr=8-29</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>14190-144</td><td>必须无菌；每次实验均需打开新的容器</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>纱布垫</td><td>Pro Advantage</td><td>P157112</td><td></td></tr><tr><td>凝胶眼润滑剂</td><td>当地药店或杂货店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 或 FIJI 分析软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>ImageJ（FIJI）</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Akorn</td><td>J119005</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8（SP8平台）配Leica 11506375物镜镜头</td><td>Leica</td><td>DMi8（SP8）</td><td>物镜&amp;nbsp; （Leica 11506375）在此使用&amp;nbsp; 使用25倍水浸物镜，可在近似耳组织折射率的条件下提供高数值孔径（0.95）。&lt;br/&gt; 显微镜（Leica DMi8（SP8平台））配备488 nm和638 nm半导体激光线，并具有无滤光片&amp;nbsp; 使用计算机控制的可调带宽进行发射光检测的光谱检测。&lt;br/&gt; 载物台必须留有足够的空间，以确保物镜能够到达底部盖玻片处，而不会与载物台发生碰撞。</td></tr><tr><td>低流量麻醉系统或传统麻醉蒸发器</td><td>Kent Scientific International</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Nair 脱毛乳液</td><td>当地药店或杂货店</td><td></td><td>非处方脱毛霜</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-101L</td><td></td></tr><tr><td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR 质粒</td><td></td><td></td><td>荧光蛋白表达转化载体&amp;nbsp; 由 Robert Wheeler 博士慷慨提供（Seman 等，2018，Infection and Immunity；Bergeron 等，2017，Infection and Immunity）</td></tr><tr><td>压力敏感型实验室胶带</td><td>胶带 &amp;amp; Label Graphic Systems Inc</td><td>1007910</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640细胞培养基</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>塑料15 mL锥形管或Falcon 5 mL圆底聚苯乙烯管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>在注射过程中安全固定动物耳朵</td></tr></tbody></table>

使用 in vivo 成像技术在哺乳动物宿主活跃感染期间筛选 candida albicans 突变菌株的形态发生表型

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

白色念珠菌 是一种重要的人类病原体。其在不同形态形式之间转换的能力是&#160;其发病机制；这些形态学变化受复杂信号网络的调控，该网络会响应环境刺激而发挥作用。这些调控组分已被广泛研究，但几乎所有的研究都采用了多种 体外 刺激以触发菌丝形成。为了确定形态发生如何在致病过程中受到调控，我们开发了一种 体内 显微成像系统，用于获取在哺乳动物宿主内发生菌丝形成的生物体的高空间分辨率图像。本文所述方案介绍了利用该系统筛选小型样本集合的方法 C. albicans 突变菌株，使我们能够鉴定在感染部位发生形态发生过程中的关键调控因子。文中展示了代表性结果，证明某些形态发生调控因子（如转录调控因子 Efg1）具有一致的表型 体外 和 体内 而其他调控因子（如腺苷酸环化酶 Cyr1）则具有显著不同的表型 在体 与……相比 体外.

此处展示的结果基于先前已发表的报告9,10。本分析的目的是定量评估突变型 C. albicans 菌株在活动性感染过程中发生形态发生的潜力。在三维复杂 in vivo 环境中生长的生物体中，区分假菌丝与菌丝的典型参数可能难以评估，尤其是在观察共聚焦成像所生成的二维横截面时。因此，本筛选分析的重点是识别以丝状形态与酵母形态生长的生物体。对于后续更深入的研究，包括三维重建分析，本方法可进一步优化以区分酵母、菌丝和假菌丝。
在参考菌株或突变菌株中荧光蛋白的表达 C. albicans 可直接检测菌株形态 体内 (图3 和 图 4）。通常情况下，定量光镜分析应在图像中极少或没有像素达到饱和时进行效果最佳。然而，在本实验方案中，图像的饱和往往有助于简化分析过程。荧光蛋白在细胞内的定位并非均匀分布，通常在母细胞酵母中的信号强度高于菌丝部分。幸运的是，在研究形态发生时，信号的空间分布而非其强度决定了实验结果。因此，在本检测中，获取大量像素处于饱和状态的图像反而有利于对形态发生的量化分析。
为了说明评估形态发生的重要性 体内，以参考菌株（SN250）及两个突变株为代表性结果进行展示：其中一个突变株缺失转录因子 Efg1，另一个缺失腺苷酸环化酶 Cyr1。 体外，这两种菌株均不以丝状形式生长20,21. 当培养时 体外 在添加10%血清的RPMI培养基中，参考菌株迅速形成菌丝，而 efg1ΔΔ 和 cyr1ΔΔ菌株不会图3 和 图4）。在这些条件下， efg1ΔΔ突变体表现出一定程度的极性生长，其子代细胞相比母细胞略微伸长。这凸显了使用明确的菌丝化定义的重要性。任何此类定义本质上都具有一定的任意性，但为表型的一致性评估所必需。在本研究中，菌丝状生长模式被定义为：子代细胞的最长维度超过母细胞两倍以上的个体。根据此定义，伸长的 efg1ΔΔ细胞不呈丝状。
与其一致 体外 表型，该 efg1ΔΔ 表现出显著的丝状化缺陷 体内约 9% 的 efg1ΔΔ细胞以丝状形式生长 体内 (图3）。相比之下，53% 的 cyr1ΔΔ突变细胞以丝状体形式生长 体内 (图4）。尽管数量 cyr1发生丝状化的ΔΔ突变细胞 体内 显著低于参照菌株，该菌株的 cyr1ΔΔ突变体形成菌丝 体内 与完全缺乏形态发生的情况相比，代表了显著的变化 体外. 从形态上观察，由……形成的丝状结构 cyr1ΔΔ突变株似乎比参考菌株更短。为了进行定量评估，使用丝状细胞的二维投影来测量其曲线路径长度 体内 图像（图4E）。中位长度 cyr1ΔΔ菌株的丝状结构比参考菌株的短29%。
<img alt="使用吸入和注射方法对小鼠进行麻醉的医学实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：麻醉与接种。（A）使用诱导室进行麻醉诱导。（B）通过鼻罩维持麻醉，以便根据需要重新调整小鼠体位。（C）使用棉签涂抹脱毛膏。已涂抹眼用润滑凝胶以保护麻醉期间的小鼠眼睛。（D）右侧耳部脱毛效果良好，与未经处理的左侧耳部形成对比。（E）将C. albicans注射至小鼠耳部皮肤内。使用两端贴有双面胶带（时尚胶带）的锥形管尖端固定耳部。（F）皮内注射的特写。皮肤内形成苍白的隆起水泡，表明皮内注射成功。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于神经学研究的小鼠显微成像装置；该过程涉及光学检查与分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：成像准备。（A）为成像准备的显微镜载物台。麻醉鼻罩已固定到位。盖玻片用胶带固定在载物台上，覆盖物镜开口。另有备用胶带。加热载物台已预热至 37 °C（未显示）。（B）将麻醉后的小鼠放入麻醉鼻罩中。（C）将小鼠轻微旋转，使接种侧耳朵朝向底部盖玻片/物镜方向。然后将耳朵压平贴紧底部盖玻片，并通过在耳朵上方放置第二块盖玻片将其固定。（D）用胶带将上方盖玻片固定在载物台上，以确保耳朵相对于显微镜载物台的位置固定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="丝状细胞生长比较；明场与荧光显微镜观察，柱状图；遗传学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3: 体外 和 体内 形态学的 efg1ΔΔ 突变菌株 (A) 宽场成像的 WT 和 efg1ΔΔ 突变株之后 体外 在RPMI + 10% 血清中培养细胞以诱导菌丝形成 37 °C 4 小时。比例尺表示 10 µm使用图像编辑软件调整图像对比度以方便观察。B) 菌丝形成百分比 体外 在野生型（WT）和 efg1ΔΔ 突变菌株。Und = 未检测到（未观察到菌丝）。柱高表示三次独立实验中菌丝状细胞百分比的中位数，每次实验至少统计100个细胞。误差线表示标准差（结果通过student's t检验进行比较） t-测试， p &lt; 0.001). (C共聚焦显微图像显示野生型（绿色）和 efg1ΔΔ突变体（红色）生长 在体 接种后24小时。箭头指示示例 efg1符合我们定义的“丝状”的ΔΔ突变细胞。比例尺代表 50 µm. (D) 菌丝形成百分比 在体 在野生型（WT）和 efg1ΔΔ 突变菌株。柱高表示两次独立实验中丝状细胞百分比的中位数。误差线表示标准差（结果通过学生t检验进行比较） t-测试， p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="丝状细胞分析；显微镜图像、柱状图、散点图；细胞形态学研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4: 体外 和 体内 形态 cyr1ΔΔ 突变菌株 (A宽场成像图像 cyr1ΔΔ 突变株之后 体外 在RPMI + 10% 血清中培养细胞以诱导菌丝形成 37 °C 4小时。比例尺表示 10 µm使用图像编辑软件调整图像对比度以方便观察。B) 菌丝形成百分比 体外 在野生型（WT）和 cyr1ΔΔ 突变菌株。Und = 未检出（未观察到菌丝）。柱高表示三次独立实验中菌丝状细胞百分比的中位数，每次实验至少统计100个细胞。误差线表示标准差（结果通过学生t检验进行比较） t-测试， p &lt; 0.001). (C共聚焦显微图像显示野生型（绿色）和突变型（红色）的对比 cyr1ΔΔ突变体（红色）生长 体内 接种后24小时。比例尺表示 50 µm. (D) 菌丝形成百分比 在体 在WT和 cyr1ΔΔ 突变菌株。柱高表示两次独立实验中丝状细胞百分比的中位数。误差线表示标准差（结果通过学生t检验进行比较） t-测试， p &lt; 0.001). (E) 纤丝长度分布 体内通过z-stack二维投影中的曲线路径长度测量所得。每个点代表一条丝状结构的长度。以酵母形态生长的细胞未被纳入本分析。条形表示丝状结构长度的中位数。使用Mann-Whitney U检验分析时，长度分布具有显著差异（p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种用于筛选中等规模样本的方法 白色念珠菌 利用非侵入性共聚焦显微镜，在哺乳动物宿主内活动感染期间筛选与形态发生表型相关的突变体文库。

使用 In Vivo 成像技术在哺乳动物宿主活跃感染期间筛选 Candida albicans 突变菌株的形态发生表型

白色念珠菌是一种重要的人类病原体。其在不同形态形式之间转换的能力是其致病性的核心；这些形态学……

白色念珠菌的形态发生由多种环境信号触发。通过在体内研究形态发生过程，我们正在明确该生物体如何整合并响应所有这些环境信号。该技术的主要优势在于，它使我们能够在不存在体外模型系统可能引入的偏倚或人为假象的情况下研究形态发生。很少有人具备皮内注射的经验。我强烈建议初次接触此技术的人员联系动物资源兽医以获得学习指导。本次操作演示将由本实验室团队的博士后研究员 Rohan Wakade 进行。在接种前，至少用不含叶绿素的饲料喂养动物七天，以完成接种前的准备。注射前一天，用牙签从一个菌落中取少量白色念珠菌细胞。接种25毫升YPD培养基，并重复此过程数次，以获得来自多个不同菌落的细胞。将培养物在30摄氏度的摇床培养箱中以175转/分钟的转速振荡培养过夜。取1毫升培养物，在500 × g离心2分钟，然后用1毫升无菌DPBS将酵母洗涤3次。将沉淀重悬于1毫升无菌DPBS中，并将培养物按1:100比例稀释。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并据此调整细胞密度。接下来，通过将参照菌株与实验菌株等体积混合，制备用于注射的接种物。使用棉签蘸取市售脱毛膏，均匀涂抹于麻醉动物双耳的内侧和外侧表面。两到三分钟后，先用干燥的纱布轻轻擦拭耳部，随后使用浸透无菌水的纱布垫擦拭，以彻底清除脱毛膏残留物。用70%乙醇对耳部表面进行消毒后，通过反复倒置小瓶或涡旋振荡充分混匀接种物。用胰岛素注射器吸取20至30微升接种物。将针头保持垂直向上，轻轻敲击注射器，确保筒内任何气泡均升至顶部。小心地将空气和多余的接种物排回接种管或废液管中，使活塞位于10 µL刻度处。将非处方双面皮肤胶带贴在小型锥形或圆底塑料管上，将耳朵搭在胶带上，注意避免移位麻醉用鼻罩。保持注射器针头几乎与皮肤平行，避开较大的静脉，将针尖刺入皮肤最外层，直至斜面完全进入皮肤，然后缓慢将接种物皮内注射。成功的皮内注射会在皮肤上形成一个小气泡。注射后保持针头在原位15至20秒再从耳部拔出，以尽量减少渗漏。根据机构规程，使用生物危害标签标记笼具，表明笼内动物已感染白色念珠菌。使用与制备接种物时相同的洗涤培养物，在 RPMI 1640 培养基中制备细胞 1 至 50 的稀释液，该培养基需添加 10% 经加热灭活的胎牛血清，并在 37°C 下以旋转振荡方式孵育四小时。使用显微镜检查样品。至少计数100个细胞，记录每种菌株的酵母细胞和丝状细胞数量。将长工作距离物镜旋转到位，并在镜头上滴加一滴浸油。降低镜头，以避免放置盖玻片时可能造成的损坏。将1.5号盖玻片置于载物台开口上方，并用胶带固定。升高物镜，使浸油与物镜镜头和盖玻片均接触。将麻醉鼻罩固定在显微镜载物台上，确保动物处于成像位置时，鼻罩能完全覆盖其鼻部。将麻醉小鼠的鼻部放入鼻罩中。在物镜上方的盖玻片上滴加一滴无菌水。调整麻醉鼻罩并安置小鼠，使小鼠的耳朵位于水滴上方。取另一块盖玻片，将盖玻片的边缘与小鼠身体平行放置，使其边缘接触小鼠耳根与头部连接处。通过铰链式动作，将盖玻片的自由边缘缓缓放下至显微镜载物台上。当盖玻片接触显微镜载物台时，会将小鼠耳朵压平。用胶带将顶部盖玻片牢固固定，施加适当压力以保持耳朵平整，同时避免胶带粘住小鼠的毛发或胡须。除非使用带有环境控制舱的显微镜，否则应用无菌铺巾松散覆盖小鼠身体，以维持其正常的体温环境。采用白光宽场成像，调节焦平面至耳部组织，并聚焦于血管中流动的红细胞。为了获得足够高的信噪比，从而能够确定视野中所有细胞的形态，可调整激光功率或成像速度。为避免组织损伤，应使用尽可能低的激光功率。选择一个在参照菌株中可见清晰丝状结构、且大多数生物体分布足够分散、其形态可被确定的视野。设置Z轴层叠图像的顶部和底部焦平面。无需覆盖感染区域的整个深度，但需注意，位于成像体积顶部或底部的生物体通常会被排除在分析之外。采集Z轴层叠图像，对每个通道进行伪彩着色以区分不同菌株，并将各通道叠加。保存图像。使用成像软件将Z轴层叠图像进行最大强度投影，生成二维图像。根据菌株类型和形态，对最大投影图像中观察到的每个生物体进行计数。该参考菌株在体外可快速形成菌丝，而EFG1缺失株则无法形成菌丝。EFG1缺失株在体内也表现出显著的菌丝形成缺陷。大约9%的EFG1缺失细胞在体内以菌丝形式生长。类似地，与参照菌株相比，CYR1缺失突变株在体外表现出菌丝形成缺陷。相比之下，53%的CYR1缺失突变细胞在体内以菌丝形式生长。CYR1 空白突变体形成的菌丝比参照菌株更短。接种时必须保持针头与皮肤平行。目的是将接种物置于皮肤外层下方不远处。该技术还可与表达荧光蛋白的小鼠品系联用，这些小鼠的特定宿主细胞表达荧光蛋白，从而允许我们在活体条件下研究宿主与病原体之间的相互作用。

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