Name: 体 外药物递送系统和细胞之间相互作用的实验定量:临床前纳米医学评估指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 了解使用流式细胞术定量分析药物载体与细胞相互作用的方法。本方案提供绝对定量工作流程，帮助研究人员优化纳米药物递送系统并获取可靠的定量数据。

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本工作由澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC；项目资助号 GNT1149990）、澳大利亚艾滋病和肝炎病毒学研究中心（ACH2）以及Réjane Louise Langlois 遗产捐赠资助。F.C. 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）高级首席研究员奖学金（GNT1135806）的支持。图1 和 图2 使用 BioRender.com 制作。

1. 选择合适的流
<ol>
	<li>按照 图1 中的决策树确定适用于所用实验设置的最佳工作流程（流程路径）（图2）。有关该流程路径选择的进一步说明，请参阅讨论部分。</li>
	<li>若采用流式细胞仪流程路径，请继续执行步骤 2.1.1–2.2.7；若采用群体分析流程路径，请继续执行步骤 3.1.1.1–3.1.5.7。</li>
</ol>
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64259/64259fig01.jpg" /> 
图1：工作流程决策树。 选择使用哪个流程主要取决于目标载体类型。体积较大或具有高散射特性的载体在流式细胞仪上更容易被单独检测，因此适用于通过流式细胞仪流程进行定量分析。其他所有类型的载体均适用于整体流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64259/64259fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64259/64259fig02.jpg" /> 
图2：工作流程概述。本实验方案分为两个不同的流程。流式细胞仪流程使用高灵敏度的流式细胞仪对悬浮液中的载体进行计数，测量单个载体的荧光强度，并进一步测定与载体共孵育后的细胞的荧光强度。整体分析流程则采用非流式细胞术的技术，例如纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis），对悬浮液中的载体进行计数，随后使用微孔板读数仪或荧光分光光度计定量单个载体的荧光强度。因此，流式细胞仪的使用仅限于测量与载体共孵育后细胞的最终荧光强度，该测量可在更广泛的流式细胞仪设备上完成，且不受所用载体类型的限制。缩写：MESF = 等效可溶性荧光染料分子数（Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome）；MFI = 中位荧光强度（median fluorescence intensity）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64259/64259fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 细胞流
<ol>
	<li>载体计数 
	注意：只要流速（&#181;L/s已知流速。如果流速未知且无法确定，则不要进行此步骤，而应直接进入步骤 3.1。对悬浮液中的载体进行计数，可实现对每次细胞实验中孵育的载体数量进行准确且可重复的测定。
	<ol>
		<li>设置流式细胞仪，通过光学散射通道（通常为侧向散射[SSC]）和荧光信号检测载体。务必调整阈值，以确保能够检测到载体。 
		注意：如果侧向散射（SSC）未能提供清晰信号（例如前向散射 [FSC]），可能需要尝试不同的光学散射通道。</li>
		<li>运行仅含稀释液的样本，以量化SSC和荧光通道中的背景事件计数。 
		注意：理想背景事件计数为 &#60;100 个事件/秒</li>
		<li>制备用于流式细胞术的载体。
		<ol>
			<li>通过涡旋振荡或超声处理使载体充分悬浮，具体方法取决于所用的载体系统。</li>
			<li>若可能，确保载体浓度在每1,000个载体/&#181;L 和 10,000 名携带者/&#181;L事件计数达到比背景高出一到两个数量级时较为理想。若载流子浓度的数量级未知，可先从原液制备1:1,000的稀释样本作为初步尝试。根据初始结果反馈，调整后续样本的稀释比例。 
			注意：浑浊的悬液通常浓度过高。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将第一个载体样品加载到流式细胞仪上并开始记录。</li>
		<li>比较SSC通道和荧光通道产生的事件数，两者应大致相等（&#60;10% 的差异）。如果不符合，则检查流式细胞仪的设置，例如荧光通道的光电倍增管（PMT）设置和激光强度。或者，可采用其他方法如共聚焦显微镜，以验证载体的荧光标记是否存在且分布均匀。</li>
		<li>重复步骤 2.1.3–2.1.5 两次或更多次，每次使用原液的不同稀释度。确保每个样本的事件计数至少比背景事件计数高一个数量级。</li>
		<li>验证三个或更多样本是否呈现线性趋势，即样本每稀释两倍，所测得的载体浓度应相应降低两倍。</li>
		<li>使用线性范围内的样本、相应的稀释倍数以及已知的流式细胞仪流速，根据公式（1): 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/64259/64259eq01.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160; &#160;(1) 
		其中 C 是载体的储存浓度，单位为载体/mL。建议使用基于光散射检测获得的事件计数，而非荧光检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载体细胞实验的流式细胞术检测结果，包括每例载体细胞荧光强度的测定 
	注意：理想情况下，每个载体的荧光强度应在尽可能接近载体-细胞实验的时间点进行测定。这是为了确保所获得的各载体的MFI值能够直接与载体相关细胞的MFI值进行比较。在实际操作中，若在连续几天内使用相同的PMT电压进行检测，流式细胞仪通常会产生相似的结果，但此一致性无法完全保证。
	<ol>
		<li>设计载体细胞实验。使用步骤2.1中确定的载体浓度来给予所需剂量的载体。</li>
		<li>为最终的载体细胞实验设置流式细胞仪，通过确定相关通道的最优PMT电压值来完成。设定阈值以允许检测载体细胞。</li>
		<li>运行悬浮液中的载体，以确定在当前PMT设置下每个载体的荧光强度。</li>
		<li>如有需要，调整流式细胞仪的阈值，以检测细胞而非载体。</li>
		<li>运行阴性对照样本——未与载体共同孵育的细胞——以确定细胞的背景荧光（自发荧光）。</li>
		<li>运行载体细胞样本以测定每个细胞的荧光强度。该荧光信号是细胞自发荧光与荧光载体存在的线性叠加。</li>
		<li>使用以下公式计算每个细胞的载体数量（2): 
		<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/64259/64259eq02.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160; &#160;(2) 
		其中 P关联 是每个细胞相关的载体数量， 荧光强度细胞 是与载体共同孵育的细胞的MFI， 荧光强度背景 未与载体共同孵育的细胞的MFI，以及 荧光强度载体 是悬浮液中载体的平均荧光强度（MFI）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 主流体流
<ol>
	<li>载体计数：纳米颗粒追踪分析 
	注意：在大量样本中，载体计数是量化每个载体绝对荧光强度的必要步骤（参见步骤 3.1.4）。此外，对悬浮液中的载体进行计数，可准确且可重复地确定每次细胞实验中孵育的载体数量。
	<ol>
		<li>准备
		<ol>
			<li>将流动池安装到激光模块上，并将整个激光模块锁定在仪器内部。</li>
			<li>以缓慢速度（不超过 0.1 mL/s）用约 1 mL 去离子水冲洗流路池。若流路池内产生气泡，应将悬液部分回抽，使气泡与气液界面合并后再继续操作。</li>
			<li>在冲洗过程进行到一半左右时启动相机；务必确认载体碎片已被冲洗干净。选择 捕获 以打开 捕获设置 标签并单击 启动相机.</li>
			<li>用1 mL空气干燥系统。若屏幕上可见任何静态载体，请根据制造商说明清洁流路池。</li>
			<li>为确保载体充分悬浮，对载体进行纳米颗粒追踪分析前的制备 通过 涡旋或超声处理，具体取决于所涉及的载体系统。如果母液浓度的数量级未知，可从母液制备1:100的稀释液，并以初步结果作为参考，指导后续样品的稀释。将载体溶解于水中，而非磷酸盐缓冲液（PBS），每种样品至少制备约0.6–1 mL，载体浓度介于1之间 &#215; 107 载体/mL 和 1 &#215; 109 carriers/mL 
			注意：浑浊的悬液通常浓度过高。缓冲液和盐类可能产生较高的背景噪音。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测量
		<ol>
			<li>取出激光模块并将其竖直放置。</li>
			<li>用1 mL注射器吸取第一份载体样品。将注射器连接至管路入口，小心地将样品注入流动池中。若流动池内形成气泡，可回抽部分悬液，使气泡与气-液界面合并后再继续操作。确保流动池完全充满液体后暂停。</li>
			<li>如有需要，调整相机焦距以观察单个载体。使用仪器右侧的旋转旋钮进行粗调焦，通过选择以下选项进行精细调节 硬件 标签 | 泵/阶段. 通过调节聚焦来改变焦点 聚焦 滑块</li>
			<li>调整相机水平，确保无过饱和现象。在 捕获 标签，选择最佳的 相机水平 通过调节滑块。</li>
			<li>如果仪器配备了此附件，将含有载样样本的注射器装入 注射泵 以确保测量过程中样品的连续流动。</li>
			<li>在……之下 标准操作程序 标签页，选择 标准测量 每次拍摄30秒，共拍摄五次。输入 基础文件名 并且，如有需要，可通过点击添加更多样本信息 高级 按钮（弹出一个包含多种选项的模态对话框）。 
			注意：如果输入了稀释因子，软件将自动调整最终的载体浓度测量值。不建议输入该因子。相反，建议手动进行调整，这有助于数据分析，并可评估每次稀释是否处于仪器的动态检测范围之内（步骤 3.1.3.4）。</li>
			<li>按压 创建 和 运行脚本 并等待弹出窗口出现，提示 请推进样品.</li>
			<li>如果使用 注射泵 选择 硬件 标签页 | 注射泵 标签 | 设置 输注速率 在 30-80 并按压 输注。如果未使用 注射泵手动推进样品。</li>
			<li>在弹出窗口中，选择 好的 开始采集。每次采集结束后，共进行五次采集，当 请推进样品 弹出窗口重新出现时，请检查样本是否仍在流式池中移动，可通过手动或 通过 的 注射泵然后，选择 好的 继续进行下一次捕获。 
			注意：完成五次捕获后，软件将自动打开“Process”选项卡，并弹出窗口提示调整处理设置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析
		<ol>
			<li>在 过程 标签，调节 检测阈值 滑块（介于 4 和 8）以正确识别屏幕上可见的不同载体。调整 屏幕增益 为便于可视化可适当调整；此操作不会影响后续分析。使用拍摄界面下方的滑块滚动浏览视频的多个帧，以辅助设定检测阈值。 
			注意：检测阈值应设定一次，此后不得在测量或样本之间进行更改。</li>
			<li>在弹出窗口（步骤 3.1.2.9 后的注释）中，按 好的 开始追踪分析。通过点击来监控分析的进度 分析 标签页 | 单次分析 表。</li>
			<li>分析完成后，查找一个 导出设置 提示出现，在其中 包含 PDF 并包括 实验概述 应默认选中。可根据需要选择其他导出格式。</li>
			<li>在 结果 部分的 PDF 数据导出，为确保测得的浓度可靠，需验证测得的载流子浓度在 1 之间 &#215; 107 个/mL 和 1 &#215; 109 个/mL——仪器的动态范围——并在浓度测量结果下方检查是否存在任何错误信息或警告提示。</li>
			<li>重复步骤 3.1.2.1-3.1.3.4 两次或更多次，使用原液的不同稀释度进行。确保每个样本的浓度落在仪器的线性范围内。</li>
			<li>选择三个或更多呈现线性趋势的样本，即样本两倍稀释应导致所测载体浓度相应降低两倍。利用选定的样本及其对应的稀释倍数计算载体原液浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每载体绝对荧光强度的测定 
		注意：由于无法直接表征该液流中单个载体的荧光信号，因此采用整体定量的方式测量荧光强度。该方法基于朗伯-比尔定律，即荧光强度与荧光染料浓度呈线性关系。当对已知载体浓度的悬浮液（见步骤3.1）进行悬浮状态下的整体定量时，可推算出每个载体的荧光强度。该步骤可在荧光酶标仪或荧光分光光度计上完成。通过与已知绝对荧光强度的标准样品曲线进行比较，荧光强度以MESF（分子当量荧光素）数量表示。
		<ol>
			<li>使用游离荧光染料溶液标记载体：将染料重悬于适当的缓冲液（如 DMSO）中，并用与载体稀释液相同的缓冲液进行后续稀释。或者，使用与荧光染料偶联的抗体溶液。根据浓度（mg/mL）、分子量（mg/mole）和阿伏伽德罗常数，利用公式（计算储备液的浓度（MESF/mL）。3进行系列稀释，使用载体稀释液制备标准曲线样品。 
			<img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/64259/64259eq03.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160; &#160;(3) 
			注意：仅当已知标记程度（即溶液中荧光染料与抗体的摩尔比）时，才可使用荧光染料偶联抗体。首先，由于载体样品的荧光强度尚不明确，应生成一个宽范围的标准曲线；随后，逐步缩小范围，以涵盖所需检测范围。</li>
			<li>制备载体样品。 
			注意：最佳做法是测试两种或以上浓度的载体稀释液，以验证测量结果呈线性且落在标准曲线的范围内。</li>
			<li>测量各样品等体积的荧光值，即载体和标准曲线均需测量。</li>
			<li>生成标准曲线，并计算所测载体样品的绝对荧光强度（MESF/mL）。</li>
			<li>通过将总体荧光强度（MESF/mL）除以载体浓度（carriers/mL），按照公式（计算每个载体的绝对荧光强度（MESF/carrier）4): 
			<img alt="方程 4" src="/files/ftp_upload/64259/64259eq04.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160; &#160;(4)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞实验（包括每载体等效荧光强度的测定） 
		注意：此步骤使用流式细胞术定量微球来生成 MESF 与 MFI 之间关系的标准曲线。这些定量微球包含多个具有已知每颗微球 MESF 数量的微球群体，各单独微球可被任意流式细胞仪检测。理想情况下，MESF 标准曲线应与载体细胞实验的检测同时进行，以确保针对各个载体计算出的 MFI 值可直接与与载体相关的细胞的 MFI 值进行比较。在实际操作中，若在连续几天内使用相同的光电倍增管（PMT）电压，流式细胞仪通常会产生相似的结果，但此一致性无法完全保证。
		<ol>
			<li>设计载体细胞实验。根据第3.1.3节确定的载体浓度，给予所需的载体剂量。</li>
			<li>为最终的载体细胞实验设置流式细胞仪，确定相关通道的最优光电倍增管（PMT）电压参数。</li>
			<li>运行阴性对照样本，即未与载体共同孵育的细胞，以确定背景荧光。</li>
			<li>制备并重悬流式细胞术定量微球。使用与细胞样本相同的缓冲液（如 PBS）。若微球群体为单独提供，需将其混合在一起。</li>
			<li>运行流式细胞术定量微球样本。</li>
			<li>运行载体细胞样本，以测定每个细胞的荧光强度。</li>
			<li>使用定量微球样本生成标准曲线，将绝对荧光强度（MESF）转换为MFI。利用该标准曲线及步骤3.1.4的结果，计算载体的理论MFI。使用公式（计算每细胞的载体数量5): 
			<img alt="公式 5" src="/files/ftp_upload/64259/64259eq05.jpg" style="margin: auto;" />&#160; &#160; &#160;(5) 
			何处 P关联 每个细胞相关的载体数量， 荧光强度细胞 是经载体孵育的细胞的平均荧光强度（MFI）， 荧光强度背景 未与载体共同孵育的细胞的 MFI 荧光强度载体&#160;是悬浮液中载体的计算MFI（步骤3.1.4）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Conde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+30+years+of+biofunctionalization+and+surface+chemistry+of+inorganic+nanoparticles+for+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine.</a> Frontiers in Chemistry. 2, 48(2014).</li>
<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ORgan+Targeting+%28SORT%29+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR%2FCas+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li>
<li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+mRNA+vaccines%3A+A+biotech+and+industrial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Vaccines%22%5BJournal%5D)">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li>
<li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22NPG+Asia+Materials%22%5BJournal%5D)">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444(2017).</li>
<li>Cevaal, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+T+cell-targeting+nanoparticle+drug+delivery+systems%3A+Considerations+for+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design.</a> ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).</li>
<li>Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-nano+science%3A+Better+metrics+would+accelerate+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress.</a> Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).</li>
<li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li>
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<li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISD3%3A+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation%2C+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6(2018).</li>
<li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221(2020).</li>
<li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li>
<li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

表征药物载体与细胞之间的相互作用在新型药物递送系统的开发中正变得日益重要。具体而言，为了能够合理地评估和比较各种载体结构，对载体与靶细胞及非靶细胞相互作用能力进行绝对定量至关重要。本实验方案描述了一种双流式方法，可使任何使用药物载体的研究人员将关于细胞-载体结合的相对性、半定量流式细胞术数据转化为绝对定量结果。所述方法适用于任何类型的载体——无论其尺寸大小、有机或无机——只要这些载体经过荧光标记即可。然而，不同载体在计算每细胞载体数量时需要采用不同的方法，这取决于进行必要表征测量所用仪器的各项技术限制。
因此，本实验方案分为两个流程：流式细胞仪流程和整体分析流程。其中，流式细胞仪流程更为直接，仅需使用流式细胞仪即可完成，但该流式细胞仪必须具备足够的灵敏度以检测所用的单个药物载体；换句话说，所关注的药物载体必须具有足够大的尺寸和密度，以便被检测到。整体分析流程则适用于任何类型的载体，因为它通过采用其他仪器避免了对单个载体的检测需求。然而，整体分析流程需要进行更多的表征实验。
为了帮助选择合适的流程（以及相应的技术），上述考虑因素...

针对不同细胞类型表现出特定设计行为的药物递送系统构建已引起广泛的研究关注。潜在的药物递送系统构建体或&#34;载体&#34;包括脂质制剂、纳米级无机材料、聚合物组装体、细胞外囊泡、功能化细菌细胞或修饰病毒。这些载体均可因物理特性、表面特性或通过工程化学修饰（如抗体连接）而表现出器官、组织或细胞特异性1,2。
几乎所有实验中普遍存在的步骤 体外 载体评价是将细胞与含有载药载体的悬浮液共同孵育。孵育结束后，测定载体的性能表现。 通过 药物载荷性能的功能性读数，例如转染效率或毒性。功能性读数很有用，因为它们能够反映载体有效性的下游效应。然而，对于更复杂的药物递送体系，仅依赖功能性读数已不足够，有必要进一步单独量化载体与目标细胞相互作用的程度。原因如下。
首先，人们日益关注发现（并不断改进） &#34;平台&#34; 载体技术能够携带多种货物。例如，设计用于包封RNA的脂质纳米颗粒（LNPs）可在仅有少量限制的情况下，将一种RNA序列替换为另一种3因此，为了迭代优化载体技术，关键在于独立于货物功能来量化载体的性能。其次，对于特定的货物，其功能读出可能并不直接，这会削弱快速迭代和评估载体配方的能力。虽然可以进行 体外 使用具有简单功能读出（例如荧光）的模型货物进行优化时，更换货物可能会改变载体所引发的生物学反应4 因此可能无法获得具有代表性的结果。第三，许多载体被设计为与特定细胞类型相互作用并被其摄取。此类 靶向能力 携带者应被且可以被区分开来 其治疗性载荷的效能&#160;靶向后阶段。以脂质纳米颗粒（LNP）为例，即使RNA载荷具有极强的活性，但如果LNP无法与细胞结合、被内化或释放RNA，下游的功能效应将无法被观察到。这一问题在靶向难转染细胞类型（如T细胞）的递送载体中尤为突出。5相反，脂质纳米颗粒（LNP）可能具有极高的靶向效率，但其所携带的RNA货物可能无法发挥功能。若仅通过下游检测来评估货物功能，则无法区分这两种情况，从而增加了载体药物递送系统开发与优化的复杂性。
本文讨论了如何对载体的结合进行绝对定量。结合是一个术语，指载体与细胞之间相互作用程度的实验测量值。结合无法区分膜表面结合与细胞内化——载体可能因其结合在细胞表面，或已被细胞内化而被视为“结合”。结合通常在细胞-载体孵育实验中进行测量。传统上，结合量的报告方式为任意荧光单位（通常为&#34;中位荧光强度&#34;或MFI），或以&#34;结合百分比&#34;表示，这些指标的局限性此前已有讨论6。简而言之，由于实验方案、流式细胞仪设置以及不同载体标记强度的差异，这些测量值在不同实验、实验室和药物载体之间不具备可比性。已有研究尝试通过校准细胞仪，将MFI的相对测量值转化为荧光的绝对定量值，以克服上述问题7。然而，该方法未考虑不同载体标记强度的变异性，因此仍无法实现对不同载体在特定靶细胞中性能的合理比较8。
此处介绍如何将相对的、任意的荧光单位实际转换为绝对定量指标 &#34;每细胞载流子数量&#34; 通过少量额外的表征实验即可证明。如果需要其他载流子浓度的度量方式（例如每细胞载流子质量或每细胞载流子体积），只要已完成载流子的表征，便可轻松地从每细胞载流子数进行换算。为简洁起见并避免使用术语，该词 &#34;载体&#34; 在本研究中，该术语用于指代多种多样的药物递送载体。这些定量技术无论应用于纳米工程金颗粒还是生物工程细菌，均同样适用。
一些基本事实使得能够将任意荧光单位转换为每个细胞所含的载体数量。首先，在荧光信号处于仪器检测限范围内且仪器设置相同的前提下，测得的荧光强度与荧光染料9（或荧光标记的载体）的浓度成正比。因此，如果已知载体的荧光强度和样品的荧光强度，并且所有测量均在相同设置和条件下进行，则可以确定该样品中所含载体的数量。然而，特别是对于较小的载体，可能无法在同一台仪器、相同设置下同时测量载体本身的荧光、细胞自发荧光以及与细胞结合的载体荧光。在这种情况下，需要第二个条件，才能实现不同仪器之间测得荧光值的相互转换。为此，可利用可溶性荧光染料分子当量（Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome, MESF）标准9，在两台仪器上分别建立荧光染料浓度的标准曲线，以校准荧光强度的测量。这样就可以在非流式细胞仪上对载体进行整体荧光测量，而这种测量适用于任何尺寸或特性的载体。当对已知浓度的载体悬液进行此类整体定量时，便可再次计算出样品中每个细胞所含的载体数量。
尽管本研究展示了通过测量荧光强度来评估载体结合的方法，但类似方案也可用于其他细胞-载体相互作用的检测指标（例如，区分内化载体与膜结合载体的实验方案）。此外，若通过非荧光检测方法（例如质谱流式细胞术）来测量结合情况，该方案的基本步骤也基本相同。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A20347</td><td>pH稳定的染料，用于标记150 nm、235 nm或633 nm的PMA&lt;sub&gt;SH&lt;/sub&gt;载体；适用于细胞-载体结合研究的优良染料示例</td></tr><tr><td>Apogee A50 Microflow</td><td>Apogee</td><td></td><td>灵敏的流式细胞仪，可检测用于计数的小型载体</td></tr><tr><td>CytoFLEX S 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>灵敏的流式细胞仪，可用于检测小型载体以进行计数，并用于最终细胞-屏障实验的数据读取</td></tr><tr><td>FCS Express</td><td>De Novo Software</td><td></td><td>用于分析流式细胞术数据的软件，例如进行设门并获取所选群体的中位荧光强度值。替代软件包括FlowJo、OMIQ、Python等</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO</td><td>Tecan Lifesciences</td><td></td><td>标准微孔板读板仪，用于溶液中载体的总体荧光测量</td></tr><tr><td>LSRFortessa 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>灵敏度较低但更广泛可用的流式细胞仪，可用于读取最终的细胞-载体实验结果</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>用于纳米颗粒追踪分析的仪器</td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td>用于绘制图表和计算标准曲线的软件。替代软件包括Microsoft Excel、Origin、Minitab、Python等</td></tr><tr><td>Quantum MESF试剂盒 Alexa Fluor 647</td><td>Bangs Laboratories</td><td>647</td><td>用于流式细胞术的绝对定量微球，可将微孔板读板仪上测得的总体荧光强度转换为基于MESF标准的流式细胞仪测得的荧光强度</td></tr></tbody></table>

药物递送系统与细胞相互作用的实验定量分析 体外：临床前纳米医学评价指南

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

设计药物递送系统的一个关键方面是如何增强或减弱与特定细胞类型的相互作用。例如，可将化疗药物与抗体结合，以增强其与癌细胞的结合能力（&#34;靶向&#34;），或与聚乙二醇结合，以帮助其逃避免疫细胞的识别（&#34;隐形&#34;）。即使在细胞层面，优化药物载体与细胞的结合及摄取效率也是一个复杂的生物学设计问题。因此，将新型载体与细胞相互作用的强度与其递送至细胞后所携带药物的功能性效果区分开来加以研究，具有重要意义。
以化疗为例， &#34;与癌细胞的结合能力如何&#34; 与……是两个不同的问题 &#34;它杀死癌细胞的效果如何&#34;定量 体外 然而，后者的检测方法已较为成熟，通常依赖于细胞活力的测定。但目前大多数关于细胞与载体相互作用的研究仍为定性或半定量性质。这些测量通常依赖于对载体进行荧光标记，因而所得结果以相对单位或任意单位表示与细胞的相互作用。然而，通过少量表征实验，此类研究可实现标准化并达到绝对定量。这种绝对定量具有重要价值，因为它有助于对各类药物递送系统——包括纳米颗粒、微粒、病毒、抗体-药物偶联物、工程化治疗性细胞或细胞外囊泡——进行合理且跨类别及同类内的比较。
此外，定量分析是后续进行荟萃分析的前提条件 计算机模拟 建模方法。本文中，视频指南以及决策树展示了如何实现 体外 针对载药递送系统的定量分析方法，本文提出了考虑载体尺寸和标记方式差异的评估策略。此外，还探讨了对先进药物递送系统进行定量评价的其他关键因素。本内容旨在为下一代药物的合理评估与设计提供有价值的参考。

如前所述，不同类型的药物载体需要采用不同的技术来绝对定量细胞与载体的结合。例如，633 nm二硫键稳定的聚甲基丙烯酸（PMASH）核壳颗粒体积较大且密度较高，可利用高灵敏度流式细胞仪进行检测。因此，这些颗粒经荧光标记后，通过侧向角光散射（SALS，类似于SSC）以及相应的荧光通道进行设门并计数（图3）。两个通道中事件计数的差异为1.98%，在可接受范围内。
相比之下，100 nm的超顺磁性氧化铁纳米颗粒过小，无法单独检测，因此采用体相流（Bulk Stream）进行分析。这些纳米颗粒通过纳米颗粒追踪分析进行计数和表征（图4）。136 nm的平均纳米颗粒尺寸反映了该纳米颗粒在水中的流体动力学直径。测得的纳米颗粒浓度——尚未校正稀释操作的影响——处于仪器的动态范围之内，表明纳米颗粒浓度的测定成功且准确。
在批量流中继续进行时，需将载体悬浮液的绝对荧光强度转换为用于最终细胞-载体孵育的流式细胞...

本文展示了一种利用流式细胞术对药物载体与细胞相互作用进行绝对定量的工作流程，以实现对新型药物递送系统更合理的评估。该工作流程适用于任何类型的药物载体。

设计药物递送系统的一个主要方面涉及如何增强或减弱与特定细胞类型的相互作用。例如，一种……

本方案提供了关于载体系统如何与细胞相互作用的定量数据。定量数据对于工程化设计与优化至关重要。它使我们能够从“是或否”类的生物学问题，转向“程度如何”类的问题。该技术有助于将药物载体在临床前的定性性能结果转化为定量结果。即使在与细胞表征系统不同的系统上对载体进行表征，该方法仍然适用。可能需要经过数次迭代，才能找到落在纳米检测线性或定量范围内的最佳载体稀释度。寻找合适条件时请耐心操作。首先，将流动池安装到激光模块上。用一毫升蒸馏水以每秒0.1毫升的流速缓慢冲洗流动池。如果流动池内形成气泡，应先将悬液部分回撤，使气泡与气液界面合并后再继续操作。然后将整个激光模块在仪器内固定锁紧。在冲洗过程进行到一半左右时启动相机。务必确认载片上的碎屑已被冲洗干净。选择“捕获”以打开捕获设置选项卡，然后单击启动相机。用一毫升空气驱动系统。 若屏幕上可见任何静态载体，请根据制造商的说明清洗流动池。通过超声处理或涡旋振荡（取决于所用的载体系统）使载体充分悬浮，以制备用于纳米颗粒追踪分析的样品。将载体用水稀释，每种样品至少准备 0.6 至 1 毫升，载体浓度为每毫升 1×10⁷ 至 1×10⁹ 个载体。取出激光模块并将其垂直放置。将第一份载体样品加入一个一毫升的注射器中，并将注射器连接到管路入口。然后小心地将样品注入流动池中。如果流动池内形成气泡，应先将悬液部分回撤，使气泡与气液界面合并后再继续操作。确保整个流动池充满液体，然后暂停上样。如有需要，调节相机焦距以观察单个载体。使用仪器右侧的旋转旋钮进行粗调焦。通过选择硬件选项卡，调节对焦滑块来进行更精细的调整。为确保无过饱和现象，通过调节采集选项卡中的滑块来选择最佳相机水平。如果仪器配备此附件，将含有载样样本的注射器装入注射泵中。在标准操作程序（SOP）选项卡下，选择标准测量，进行五次采集，每次30秒。输入基础文件名，如需要，可点击“高级”按钮，打开一个包含多种选项的模态对话框以添加额外的样品信息。点击“创建并运行脚本”，等待弹出提示框，要求推进样品。如果使用注射泵，请选择“硬件”标签，然后选择“注射泵”标签。设定所需的输注速率，然后按“输注”键。如果不使用注射泵，则手动推进样品。在弹出窗口中，选择“确定”以开始采集。每次完成五次捕获后，当“请进样”弹窗再次出现时，检查样本是否仍在流过流动池。然后选择“确定”以进行下一次捕获。在“过程”选项卡中，将检测阈值滑块调整至四到八之间，以准确识别屏幕上可见的独立载体。可调整屏幕增益以辅助观察，此操作不会影响后续分析。在弹出窗口中，点击“确定”以启动追踪分析。通过在单次分析选项卡中点击分析项目，可监控分析进度。分析完成后，等待导出设置提示出现。确认已选择包含 PDF 和实验摘要。根据需要选择其他导出格式。在PDF数据导出结果部分，为确保所测浓度可靠，需验证实测的载体浓度是否在每毫升1×10⁷至1×10⁹个载体之间，并检查浓度测量结果下方是否存在任何错误提示或警告信息。从原液中选择不同稀释倍数重复实验两次或以上，确保每个样品的浓度均落在仪器的线性范围内。按照文本稿件中的描述计算原液载体浓度。按照文稿中的描述配制游离或抗体偶联的荧光染料溶液。根据浓度、分子量和阿伏伽德罗常数，利用公式计算储备液的浓度。然后用载体稀释液对染料进行系列稀释，以制备标准曲线样品。然后将载体样品加入测量板中，使用酶标仪检测荧光。按照文本稿件中的描述生成标准曲线。通过将总体荧光强度除以载体浓度，计算每个载体的绝对荧光强度。通过确定相关通道中光电倍增管（PMT）的最佳电压设置，为最终的载体细胞实验配置流式细胞仪。运行阴性对照样本，即细胞未与载体共同孵育，以确定背景荧光水平。制备并重新悬浮流式细胞术定量微球。使用与细胞样品相同的缓冲液。如果微球种群是分开提供的，需将其混合在一起。运行流式细胞术定量微球和载体细胞样品，以确定每个细胞的荧光强度。运行流式细胞仪定量微球以生成标准曲线，将绝对荧光强度转换为平均荧光强度（MFI）。根据文本稿件中的描述，利用该标准曲线计算载体的理论 MFI。检测细胞载体样品，以确定每个样品每细胞的荧光强度。最后，通过从样品的测量荧光值中减去背景荧光，再除以每个颗粒的荧光强度，计算出每个样品每细胞的载体数量。对于633纳米的聚甲基丙烯酸核壳颗粒，可直接利用流式细胞仪的流束测定其浓度及每个载体的荧光强度。相比之下，100纳米的超顺磁性氧化铁纳米颗粒过小，无法单独检测，因此采用整体流束进行分析。在多个时间点使用标记的定量微球在流式细胞仪上生成标准曲线。检测到的MFI与定量微球的MESF值之间呈线性关系，且在不同检测日期之间结果总体相似。利用荧光标记的HeLa细胞进行时间进程实验，加入235纳米的聚甲基丙烯酸胶囊，时间为0至24小时，结果显示MFI随时间增加，表明胶囊与HeLa细胞发生了结合。根据相对定量还是绝对定量，细胞对载体的表观响应差异显著。绝对定量不受标记强度的影响，因此更具可比性。这些技术是深入分析和比较颗粒性能的基础。我们期待利用这些技术来确定数学模型的参数，从而能够在不依赖任何特定实验的情况下表征颗粒的性能。

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