通过高通量微流控压缩系统对多细胞生物体进行机械刺激

本方案介绍了如何制备和使用微流控技术，以利用其在样本通量、自动化操作以及精确施加机械应力的同时实现样本实时成像等方面的实验优势。该技术可最大限度减少对多细胞生物体（如胚胎和类器官）在固定、排列和活体成像过程中的手动操作，同时还可在力学生物学研究中对这些样本施加机械压缩。

使用传统微加工技术制造具有高深宽比结构的微流控芯片模具可能具有挑战性。本视频文章中介绍的技巧可克服这些挑战。首先，用丙酮清洗硅片，然后用异丙醇清洗。

将硅片置于250摄氏度的加热板上加热30分钟，进行脱水烘烤。在蒸汽涂覆仪中用六甲基二硅氧烷对硅片进行涂覆。

将一瓶 SU-8 2100 光刻胶放入 60°C 的烘箱中加热 15 分钟，以降低其黏度。在热板上每英寸硅片表面倒入一毫升加热后的光刻胶，直至光刻胶覆盖大部分表面。先以 100 RPM/秒的加速度进行预旋涂，转速为 250 转/分钟，持续 30 秒；随后同样以 100 RPM/秒的加速度将转速提高至 350 转/分钟，继续旋涂 30 秒。

接下来，先以每秒100转的加速度将样品旋转500转/分钟，持续15秒，然后再以每秒300转的加速度将样品旋转1,450转/分钟，持续30秒。使用洁净室棉签去除边缘胶珠，并用丙酮喷洒硅片以消除缺陷并促进均匀涂覆。通过光掩模将硅片暴露于350毫焦/平方厘米的紫外光下。

使用接触式掩模对准器，对硅片进行曝光后烘烤，并使其冷却至室温。将烧杯放入另一个较大的烧杯中，并向较大的烧杯中加入新鲜的显影液。在烧杯上放置一层金属网。

将硅片倒置在金属网上。开启搅拌器，使硅片在显影液中浸泡30分钟。将硅片转移至装有新鲜显影液的超声波清洗器中，在40千赫兹条件下超声处理1小时。

然后将晶圆从烧杯中取出，用新鲜的显影液冲洗。通过将PDMS基础剂与固化剂按10:1的比例混合，制备预固化PDMS溶液。将混合物置于离心机中，在室温下以500 ×g离心5分钟以脱气。

将预固化的PDMS倒在硅片上，再次脱气。最后，将未固化的PDMS放入60°C的烘箱中进行固化。使用手术刀切割固化后的PDMS区域边缘，使其与微流控芯片的几何形状相对应。

使用活检打孔器或钝头针在PDMS上打出入水口和出水口。将PDMS经等离子体处理后，使其带有微结构的一面朝向载玻片放置，以实现微通道通过共价键密封。让Oregon-R成年果蝇在苹果汁琼脂平板上产卵，并在产卵后按实验所需的时间点收集相应平板。

用胚胎卵洗液浸没琼脂，用画笔轻轻搅动胚胎，使其从琼脂上脱离。将胚胎转移至50%次氯酸钠溶液中处理90秒，期间偶尔搅拌。通过细胞筛过滤胚胎，并用水彻底冲洗去除次氯酸钠溶液。

将胚胎转移至一个90毫米的玻璃培养皿中，加入足量的胚胎卵液清洗液，以完全覆盖胚胎。在解剖显微镜下利用透射光观察胚胎，并挑选处于目标发育阶段的胚胎用于加载到微流控装置中。通过主胚胎进样口向所有七个胚胎微通道中注入0.4微米的过滤异丙醇，以完成各通道的预润湿。

用过滤的去离子水替换 IPA，体积为 0.4 微米。然后用胚胎卵洗液替换去离子水。使用玻璃移液管从玻璃培养皿中收集约 100 个预先挑选的胚胎。

接下来，用移液器将胚胎加入胚胎进样口，使用便携式真空泵对气体入口施加约3 PSI的负压，以打开胚胎微通道。然后将微流控芯片向下倾斜，使胚胎自动排列并沉降到胚胎微通道中。若多个胚胎同时进入导致胚胎微通道入口堵塞，可将微流控芯片先向上倾斜，再向下倾斜，以清除堵塞。

根据所需的通量，将多达300个胚胎引入胚胎微通道中。胚胎加载完成后，移除真空以固定胚胎。然后将微流控芯片恢复至水平位置。

将便携式正压源连接至带有压力计的气体入口，施加 3 PSI 的压缩压力。若需对机械刺激后的胚胎进行活体成像实验，将微流控芯片置于标准显微镜载物台的玻片夹持器上，并将气体入口连接至压力源。在荧光显微镜下观察微流控通道内的胚胎。

压缩实验完成后，可收集胚胎用于后续分析。首先，对气体入口施加真空，以释放胚胎。然后将微流控芯片向上倾斜，使胚胎向下移动至胚胎导入口。

使用玻璃移液管从微流控芯片中收集胚胎。通过将果蝇胚胎载入压缩通道并对气体通道施加正压，可实验性地确定微流控装置的功能。在真空或中性压力状态下，胚胎不会受到明显的压缩。

当施加正压时，胚胎会被压缩。在显微镜下测量胚胎宽度的减小程度，可展示如何利用气体压力达到目标压缩水平。以这种方式制造的微流控装置可实现对固定样品的化学刺激。

这种刺激方法能够实现高时空分辨率的成像。发育生物学中的一个基本问题是：机械力如何在发育过程中调控蛋白质和基因的表达？该技术使我们能够同时对大量胚胎施加机械刺激，从而获得足够量的蛋白质和RNA，用于进行比较蛋白质组学或转录组学实验。

这将使研究人员能够更深入地了解对机械力敏感的蛋白质和基因。