Name: 通过高通量微流体压缩系统对多细胞生物进行机械刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解利用高通量微流体压缩系统对多细胞生物进行机械刺激的方法。该技术可实现果蝇胚胎的固定、排列与活体成像，为发育生物学中的机械生物学研究提供高效平台。

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本研究工作得到了美国国家科学基金会（CMMI-1946456）、美国空军科学研究办公室（FA9550-18-1-0262）以及美国国立卫生研究院（R01AG06100501A1；R21AR08105201A1）的支持。

1. 硅片模具的制备
<ol>
	<li>首先用丙酮，然后用异丙醇（IPA）清洗硅片（参见材料表）。</li>
	<li>将硅片置于250 °C的加热板上，进行30分钟的脱水烘烤（图3A）。</li>
	<li>在蒸气引物炉（见材料表）中用六甲基二硅氮烷（HDMS）对硅片进行处理（工艺温度：150 °C，工艺压力：2 Torr，工艺时间：5 min，HDMS体积：5 µL）（图3B）。</li>
	<li>将一瓶SU-8 2100光刻胶（见材料表）放入60 °C烘箱中加热15分钟，以降低其黏度。 
	注意：在烘箱中加热后，光刻胶的黏度会降低。黏度降低后的光刻胶更易于操作，并能更精确地涂覆在硅片表面。</li>
	<li>将硅片置于60 °C加热板上，每英寸硅片倒入1 mL加热后的光刻胶，直至光刻胶覆盖大部分表面（图3C）。</li>
	<li>将涂有光刻胶的硅片转移至旋涂仪（见材料表）。</li>
	<li>先以250 rpm转速预旋30秒，再以350 rpm转速继续旋转30秒，加速度均为100 rpm/s（图3D）。</li>
	<li>使用洁净室棉签去除硅片边缘多余的光刻胶。</li>
	<li>先以100 rpm/s的加速度在500 rpm下旋转15秒，再以300 rpm/s的加速度在1450 rpm下旋转30秒（图3E）。</li>
	<li>使用洁净室棉签去除边缘胶珠。</li>
	<li>将硅片置于50 °C加热板上，向硅片表面喷洒丙酮以去除缺陷并促进涂层均匀（图3F）。</li>
	<li>以2°C/min的速率缓慢将加热板温度升至95 °C。</li>
	<li>在95 °C下对硅片进行50分钟的软烘（图3G）。</li>
	<li>以2°C/min的速率缓慢将加热板冷却至室温。</li>
	<li>将硅片放置在掩模对准器（见材料表）上，并将光掩模置于其上（光掩模几何结构请参见补充图1）。</li>
	<li>使用接触式掩模对准器，通过光掩模对硅片进行350 mJ/cm2的紫外光曝光（35 mW/cm2，持续10秒）（图3H）。</li>
	<li>将硅片依次在加热板上进行曝光后烘烤：先在50 °C下烘烤5分钟，再在65 °C下烘烤5分钟，最后在80 °C下烘烤20分钟（图3I）。</li>
	<li>以2 °C/min的速率将硅片缓慢冷却至室温。</li>
	<li>在烧杯中放置一个直径略小于硅片的磁力搅拌子。将硅片倒置，放置在烧杯上方。</li>
	<li>将该烧杯放入另一个较大的烧杯中，并向大烧杯中加入新鲜显影液（见材料表）。开启搅拌，使硅片在显影液中浸泡30分钟（图3J）。</li>
	<li>将硅片转移至装有新鲜显影液的超声波清洗仪中，在40 kHz条件下超声处理1小时（图3K）。</li>
	<li>用异丙醇（IPA）溶液彻底清洗硅片，得到最终的硅片模具（图3L）。</li>
</ol>
2. 微流控芯片的制备
<ol>
	<li>将硅晶片模具与10滴（约500 µL）三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷（PFOCTS，参见 材料表在附近的小称量舟中。</li>
	<li>将干燥器连接至真空泵，在约200 Torr压力下抽真空30分钟。</li>
	<li>关闭干燥器阀门，并断开真空泵，静置过夜以完成PFOCTS涂层。</li>
	<li>将PDMS基础剂与固化剂混合，制备预固化聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液（参见 材料表以10:1的比例。</li>
	<li>通过将混合物放入离心机（500 × g）脱气 g 室温下孵育5分钟。 
	注意：此离心步骤可使气泡迁移至顶部表面，从而在短时间内被去除。</li>
	<li>将脱气后的PDMS溶液倒入硅晶片模具中。</li>
	<li>再次脱气以去除模具表面 trapped 的气泡。</li>
	<li>在60 °C的烘箱中固化PDMS 1小时50分钟（图3M).</li>
	<li>使用手术刀沿固化PDMS区域的微流控芯片几何形状边界进行切割（图3N).</li>
	<li>剥离PDMS部分，并将其倒置放置在切割垫上。</li>
	<li>使用剃刀将PDMS部件切割成最终形状（图3O).</li>
	<li>使用活检打孔器在PDMS上打出入口和出口孔（参见 材料表）或带有钝头的针（图3P).
	<ol>
		<li>对于胚胎入口孔，使用直径为4 mm的打孔器。</li>
		<li>对于胚胎出口孔，使用直径为1.3 mm的打孔器。</li>
		<li>对于气体入口孔，使用2 mm打孔器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用一片透明胶带去除PDMS图案化表面可能残留的任何颗粒。</li>
	<li>先用丙酮、再用异丙醇清洁一块24 mm × 60 mm的矩形玻璃载片。</li>
	<li>使用连接至过滤空气源的气枪吹干玻璃表面。</li>
	<li>将玻片置于250 °C的加热板上烘烤2小时，进行脱水处理（图 3Q).</li>
	<li>用烧杯盖住载玻片，以防止表面污染。</li>
	<li>将PDMS的图案面向上放置，并与已脱水的载玻片一同放入等离子清洗仪中（参见 材料表).</li>
	<li>将PDMS和载玻片在18 W功率下用氧气等离子体处理30秒。</li>
	<li>将PDMS放置在载玻片上，使其图案面朝向载玻片，以密封微通道 通过 共价键合图 3R).</li>
	<li>使用镊子轻轻将PDMS部件推向玻片，以确保完全贴合接触。</li>
	<li>将制备好的微流控芯片在室温下存放过夜，以使键合达到最终强度。</li>
</ol>
3. 果蝇胚胎的制备
<ol>
	<li>让 Oregon-R 成年果蝇在苹果汁琼脂平板（1.5% 琼脂，25% 苹果汁，2.5% 蔗糖）上产卵，并在产卵后根据实验所需的时间点收集平板。 
	注意：在本实验中，于140分钟收集培养板，以制备和分选处于合胞体囊胚期（细胞化阶段）的胚胎17.</li>
	<li>用胚胎卵洗液（0.12 M NaCl，0.04% Triton-X 100）浸没琼脂，用画笔轻轻搅动胚胎，使其从琼脂上脱离。</li>
	<li>将胚胎转移至50%的次氯酸钠溶液中处理90秒，期间偶尔搅拌。用细胞筛过滤胚胎，并用水彻底冲洗去除漂白液。</li>
	<li>将胚胎转移至一个90 mm玻璃培养皿中，加入足量的胚胎洗卵液，以完全覆盖胚胎。</li>
	<li>在体视显微镜下利用透射光观察胚胎，并挑选发育阶段符合要求的胚胎用于加载至微流控装置中。 
	&#8203;注意：本实验中选取了处于细胞化阶段的胚胎。有关如何准确选择发育阶段的详细说明，可参见实验室手册 果蝇17.</li>
</ol>
4. 使用微流控芯片对果蝇胚胎施加机械刺激
<ol>
	<li>通过主胚胎入口端口注入经0.4 µm滤膜过滤的异丙醇（IPA），对全部七个胚胎微通道进行预润湿。</li>
	<li>用经0.4 µm滤膜过滤的去离子水（DI水）替换异丙醇。</li>
	<li>用胚胎卵清洗液替换去离子水。</li>
	<li>使用玻璃移液管从玻璃培养皿中收集约100个预先筛选的胚胎。</li>
	<li>将胚胎通过移液方式加入胚胎入口端口（图4A）。</li>
	<li>使用便携式真空泵对气体入口施加约3 PSI的负压（即真空），以打开胚胎微通道。</li>
	<li>将微流控芯片向下倾斜，使胚胎自动排列并沉降至胚胎微通道中（图4B）。</li>
	<li>若多个胚胎同时进入导致胚胎微通道入口堵塞，可将微流控芯片先向上再向下倾斜，以清除堵塞。</li>
	<li>根据所需的通量，最多可将300个胚胎引入胚胎微通道中。</li>
	<li>胚胎加载完成后，移除真空以固定胚胎。</li>
	<li>将微流控芯片恢复至水平位置（图4C）。</li>
	<li>将带有压力表的便携式正压源（见材料表）连接至气体入口，施加3 PSI的压缩压力（图4D）。</li>
	<li>持续观察压力表，确保施加的压力水平保持恒定。</li>
	<li>若需对机械刺激后的胚胎进行活体成像实验，可将微流控芯片置于标准显微镜载物台的玻片夹持器上，并保持气体入口与压力源连接。</li>
	<li>压缩实验完成后，可收集胚胎用于后续分析。为此，首先对气体入口施加真空以释放胚胎。</li>
	<li>然后将微流控芯片向上倾斜，使胚胎向胚胎引入端口移动（图4E）。</li>
	<li>使用玻璃移液管从微流控芯片中收集胚胎。 
	注意：收集后，可通过将果蝇培养至成虫阶段，研究压缩处理对胚胎发育及存活率的影响。该微流控装置的高通量处理能力还使得胚胎可用于需要大量样本的下游组学相关检测（图2）。</li>
</ol>

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<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fabrication+process+for+uniform+SU-8+thick+photoresist+structures+by+simultaneously+removing+edge+bead+and+air+bubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006(2011).</li>
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<li>Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycarbonate+heat+molding+for+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polycarbonate heat molding for soft lithography.</a> Small. 16 (16), 2000241(2020).</li>
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</ol>

作者对本文所述产品无任何经济利益，亦无其他事项需要披露。

本文描述了一种微流控装置的开发，该装置可自动排列、固定并精确地对数百个完整的黑腹果蝇（Drosophila）胚胎施加机械刺激。通过将微流控系统与一层薄玻璃盖玻片集成，可在刺激过程中利用高分辨率共聚焦显微镜对胚胎进行成像。该微流控装置还能够在刺激结束后立即收集胚胎，用于后续生物学检测。文中详细介绍了该装置的设计考量、 fabrication 方法及其性能表征。硅晶圆模具的 fabrication 方案实现了光刻胶的均匀厚层涂覆，并可形成高深宽比的沟槽结构。
要使这种制备方法成功，降低烘烤步骤的温度，并在硅片涂覆光刻胶后尽量减小其升温和降温速率至关重要。如果操作不当，光刻胶涂层容易发生脱层，从而改变模具的几何形貌。一旦硅片模具成功制备，可将其复制到更耐用的材料中，以防止在后续多次进行PDMS复制成型过程中损坏原始模具，因为这些过程同样包含加热和冷却循环21。通过复制成型制备PDMS微流控器件的关键在于能否成功从模具上剥离高深宽比的侧壁结构。为确保该制备步骤的可靠性，必须使用硅烷化试剂对硅片表面进行适当处理，以促进剥离过程...

生命系统在其整个生命周期中不断经历并响应各种机械刺激1机械转导已通过直接受或间接受机械环境影响的信号通路，与多种疾病相关，包括发育障碍、肌肉和骨质流失以及神经病理学疾病。2然而，由机械刺激所调控的基因和蛋白质3 在机械敏感性信号通路中4 在很大程度上仍不清楚5，阻碍了对力学调控机制的阐明以及与病理性机械转导相关疾病的分子靶点的鉴定6,7将力学生物学研究结果推演至相关生理过程的一个限制因素是，使用传统培养皿中的单个细胞，而非完整的多细胞生物体。模式生物，例如 黑腹果蝇 （果蝇）, 极大地促进了对动物发育过程中相关基因、信号通路和蛋白质的理解8,9,10然而，使用 果蝇 在机械生物学研究中，由于实验工具方面的挑战，其他多细胞模式生物的应用受到阻碍。传统的样本制备、分选、成像或施加各种刺激的技术主要依赖人工操作，这些方法耗时较长，需要专业技术，易引入变异，并限制了实验设计和样本量。11近年来，微技术的进步为开展具有高通量和高度可控实验参数的新型生物学检测提供了重要支持12,13,14.
本文介绍了一种改进的微流控装置的开发，该装置可对数百个完整的Drosophila胚胎进行排列、固定，并施加单轴压缩形式的精确机械刺激15&#160;（图1）。将微流控系统与玻璃盖玻片集成，可在刺激过程中对样品进行高分辨率共聚焦成像。该微流控装置还可在刺激后快速收集胚胎，用于进行-组学分析（图2）。本文阐述了该装置的设计考量、采用软光刻技术的制备方法以及实验表征。由于制作此类装置的硅晶片模具需要在大面积上均匀涂覆厚的光刻胶（厚度 &#62;200 µm），并形成高深宽比（AR）的沟槽（AR &#62;5），因此该方法对传统的光刻模具制备工艺进行了显著改进。该方法从而促进了光刻胶的处理、粘附、涂覆、图形化及显影过程。此外，本文还讨论了可能遇到的问题及其解决方案。最后，通过其他多细胞系统（如Drosophila卵室和脑类器官）的应用，验证了该设计与制备策略的通用性16。

<table><tbody><tr><td>100 mL 三角形带孔塑料烧杯，配60 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>14-955-111B</td><td>需打孔通气</td></tr><tr><td>100 mm P B &amp;lt;100&gt; 0-100 500um SSP 测试级硅片</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Ted Pella</td><td>15110</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液（漂白剂）</td><td></td><td></td><td>无品牌要求</td></tr><tr><td>钝头针头套装</td><td>CML Supply</td><td>901</td><td></td></tr><tr><td>接触式掩模对准仪</td><td>Quintel</td><td>Q4000 MA</td><td></td></tr><tr><td>切割垫板</td><td>Dahle</td><td>Vantage 10670</td><td>尺寸：24&quot; × 36&quot;</td></tr><tr><td>显影液</td><td>Kayaku Advance Materials</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>直写光刻机</td><td>Heidelberg</td><td>MLA100</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td>任何市售带透射光的体视显微镜</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>玻璃载片</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0710&amp;nbsp; (CS-24/60)</td><td></td></tr><tr><td>HMDS 气相涂底膜烘箱</td><td>Yes Engineering</td><td>YES-3TA</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td></td><td></td><td>无品牌要求</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Labnet</td><td>I5110A</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td>无品牌要求</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>光刻胶</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>便携式压力源</td><td>hygger Quietest</td><td>HGD946</td><td></td></tr><tr><td>压力表</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-68950-25</td><td></td></tr><tr><td>匀胶机</td><td>Laurell</td><td>WS-650-8B</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷（PFOCTS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100（Triton-X 100）</td><td>Fisher</td><td>AAA16046AP</td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td>Saint-Gobain</td><td>02-587-1A</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08895-05</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07164-87</td><td></td></tr></tbody></table>

通过高通量微流控压缩系统对多细胞生物体进行机械刺激

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

在胚胎发育过程中，协调的细胞运动产生机械力，进而调控基因表达和细胞活动。为研究这一过程，已有研究采用吸吮法或盖玻片压缩法对整个胚胎进行机械刺激。然而，这些方法存在实验设计局限性，因其精度较低、依赖人工操作，且每次只能处理少数几个胚胎。微流控系统在实现此类实验操作自动化方面具有巨大潜力，可同时提高通量和精确度。本文介绍了一种用于精确压缩完整胚胎的微流控系统 黑腹果蝇 （果蝇）胚胎。该系统具有带气动驱动可变形侧壁的微通道，可实现胚胎的排列、固定、压缩以及刺激后的收集。通过将这些微通道并行排列为七条通道，可对数百个胚胎施加稳定或动态的压缩模式。 黑腹果蝇 同时对胚胎进行操作。该系统制作在玻璃盖玻片上，便于利用高分辨率显微镜对样本进行同步的机械刺激与成像。此外，由于采用生物相容性材料（如PDMS）并具备流体通路功能，该装置适用于依赖培养基的样本进行长期实验。该方法还消除了手动装载样本的需要，避免了由此带来的机械应力。同时，可快速从微通道中收集样本，便于开展刺激后的分析，包括需要大量样本的组学检测，而传统机械刺激方法难以获得如此数量的样本。该系统的几何结构易于适配不同的生物体系，使多个研究领域均可受益于其所具备的功能特性，包括高通量样本处理、机械刺激或固定，以及自动化对位。

微流控系统被分为两个子区域，由可变形的PDMS侧壁隔开。第一个区域是液体系统，其中 果蝇 胚胎被引入后，自动进行排列、对齐并依次压缩。第二个部分为气体系统，可分别控制压缩通道两侧的气体压力 通过 死端微通道可精确控制压缩通道的有效宽度。该微流控装置底部用载玻片密封，便于对样品进行高分辨率的活体成像。补充图2微流控装置相关尺寸。
选择处于理想胚胎发育阶段的多细胞生物，例如 Drosophila 胚胎。对于 Drosophila 胚胎而言，所有发育阶段均适用于该方法，因为胚胎在孵化前大小保持不变。使用玻璃微量移液器将选定的样品通过较大的入口（即直径为 4 mm）引入微流控装置。随后将装置向下倾斜，使胚胎流入并行排列的七条压缩通道。连接胚胎入口与压缩通道的渐窄型心房结构可确保胚胎在进入压缩通道入口前自动对齐。对气体入口施加真空，使可变形侧壁向外偏转，从而增加微通道的有效宽度，使胚胎依次进入压缩通道。这七条压缩通道每条长 22 mm，在一次运行中并行最多可容纳 300 个 Dr...

本方案描述了一种微流控系统的设计、制备和表征方法，该系统能够自动排列、固定并精确压缩数百个黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎，且所需人工干预极少。该系统支持高分辨率成像，并可在刺激后回收样本用于后续分析，还可扩展应用于其他多细胞生物系统。

在胚胎发生过程中，协调的细胞运动产生机械力，从而调控基因表达与活性。为研究这一过程，需要使用工具……

本方案介绍了如何制备和使用微流控技术，以利用其在样本通量、自动化操作以及精确施加机械应力的同时实现样本实时成像等方面的实验优势。该技术可最大限度减少对多细胞生物体（如胚胎和类器官）在固定、排列和活体成像过程中的手动操作，同时还可在力学生物学研究中对这些样本施加机械压缩。使用传统微加工技术制造具有高深宽比结构的微流控芯片模具可能具有挑战性。本视频文章中介绍的技巧可克服这些挑战。首先，用丙酮清洗硅片，然后用异丙醇清洗。将硅片置于250摄氏度的加热板上加热30分钟，进行脱水烘烤。在蒸汽涂覆仪中用六甲基二硅氧烷对硅片进行涂覆。将一瓶 SU-8 2100 光刻胶放入 60°C 的烘箱中加热 15 分钟，以降低其黏度。在热板上每英寸硅片表面倒入一毫升加热后的光刻胶，直至光刻胶覆盖大部分表面。先以 100 RPM/秒的加速度进行预旋涂，转速为 250 转/分钟，持续 30 秒；随后同样以 100 RPM/秒的加速度将转速提高至 350 转/分钟，继续旋涂 30 秒。接下来，先以每秒100转的加速度将样品旋转500转/分钟，持续15秒，然后再以每秒300转的加速度将样品旋转1,450转/分钟，持续30秒。使用洁净室棉签去除边缘胶珠，并用丙酮喷洒硅片以消除缺陷并促进均匀涂覆。通过光掩模将硅片暴露于350毫焦/平方厘米的紫外光下。使用接触式掩模对准器，对硅片进行曝光后烘烤，并使其冷却至室温。将烧杯放入另一个较大的烧杯中，并向较大的烧杯中加入新鲜的显影液。在烧杯上放置一层金属网。将硅片倒置在金属网上。开启搅拌器，使硅片在显影液中浸泡30分钟。将硅片转移至装有新鲜显影液的超声波清洗器中，在40千赫兹条件下超声处理1小时。然后将晶圆从烧杯中取出，用新鲜的显影液冲洗。通过将PDMS基础剂与固化剂按10:1的比例混合，制备预固化PDMS溶液。将混合物置于离心机中，在室温下以500 ×g离心5分钟以脱气。将预固化的PDMS倒在硅片上，再次脱气。最后，将未固化的PDMS放入60°C的烘箱中进行固化。使用手术刀切割固化后的PDMS区域边缘，使其与微流控芯片的几何形状相对应。使用活检打孔器或钝头针在PDMS上打出入水口和出水口。将PDMS经等离子体处理后，使其带有微结构的一面朝向载玻片放置，以实现微通道通过共价键密封。让Oregon-R成年果蝇在苹果汁琼脂平板上产卵，并在产卵后按实验所需的时间点收集相应平板。用胚胎卵洗液浸没琼脂，用画笔轻轻搅动胚胎，使其从琼脂上脱离。将胚胎转移至50%次氯酸钠溶液中处理90秒，期间偶尔搅拌。通过细胞筛过滤胚胎，并用水彻底冲洗去除次氯酸钠溶液。将胚胎转移至一个90毫米的玻璃培养皿中，加入足量的胚胎卵液清洗液，以完全覆盖胚胎。在解剖显微镜下利用透射光观察胚胎，并挑选处于目标发育阶段的胚胎用于加载到微流控装置中。通过主胚胎进样口向所有七个胚胎微通道中注入0.4微米的过滤异丙醇，以完成各通道的预润湿。用过滤的去离子水替换 IPA，体积为 0.4 微米。然后用胚胎卵洗液替换去离子水。使用玻璃移液管从玻璃培养皿中收集约 100 个预先挑选的胚胎。接下来，用移液器将胚胎加入胚胎进样口，使用便携式真空泵对气体入口施加约3 PSI的负压，以打开胚胎微通道。然后将微流控芯片向下倾斜，使胚胎自动排列并沉降到胚胎微通道中。若多个胚胎同时进入导致胚胎微通道入口堵塞，可将微流控芯片先向上倾斜，再向下倾斜，以清除堵塞。根据所需的通量，将多达300个胚胎引入胚胎微通道中。胚胎加载完成后，移除真空以固定胚胎。然后将微流控芯片恢复至水平位置。将便携式正压源连接至带有压力计的气体入口，施加 3 PSI 的压缩压力。若需对机械刺激后的胚胎进行活体成像实验，将微流控芯片置于标准显微镜载物台的玻片夹持器上，并将气体入口连接至压力源。在荧光显微镜下观察微流控通道内的胚胎。压缩实验完成后，可收集胚胎用于后续分析。首先，对气体入口施加真空，以释放胚胎。然后将微流控芯片向上倾斜，使胚胎向下移动至胚胎导入口。使用玻璃移液管从微流控芯片中收集胚胎。通过将果蝇胚胎载入压缩通道并对气体通道施加正压，可实验性地确定微流控装置的功能。在真空或中性压力状态下，胚胎不会受到明显的压缩。当施加正压时，胚胎会被压缩。在显微镜下测量胚胎宽度的减小程度，可展示如何利用气体压力达到目标压缩水平。以这种方式制造的微流控装置可实现对固定样品的化学刺激。这种刺激方法能够实现高时空分辨率的成像。发育生物学中的一个基本问题是：机械力如何在发育过程中调控蛋白质和基因的表达？该技术使我们能够同时对大量胚胎施加机械刺激，从而获得足够量的蛋白质和RNA，用于进行比较蛋白质组学或转录组学实验。这将使研究人员能够更深入地了解对机械力敏感的蛋白质和基因。

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