Name: 制备用于心肌梗死后成年小鼠心脏单细胞RNA测序的非心肌细胞悬液 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学习从心肌梗死后小鼠心脏分离高活性非心肌细胞单细胞悬液的方法，用于单细胞测序和流式细胞术分析。该方案成本低、设备要求简单，可揭示心脏病理生理学中的细胞异质性。

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本工作得到浙江省自然科学基金（LQ22H020010）的资助。

所有实验均按照浙江大学实验动物护理和使用指南进行，并经浙江大学动物咨询委员会批准。
1. 左前降支冠状动脉结扎术（LAD 结扎术）
注意：采用八周龄雄性 C57BL/6J 小鼠作为模型。心肌梗死（MI）后两周收集心脏。左前降支冠状动脉结扎手术按照先前所述并展示的方法进行11。
<ol>
	<li>手术前用70%乙醇对手术器械进行消毒。</li>
	<li>称量小鼠体重，然后通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）对小鼠进行麻醉。观察趾夹反射，并测量呼吸频率以评估手术过程中麻醉的深度。</li>
	<li>将小鼠置于带有37 °C加热垫的手术台上。使用眼用软膏以防止眼睛脱水。</li>
	<li>用脱毛膏去除其左侧心前区胸部和颈部的毛发，并用棉签清除毛发。先用碘伏对皮肤进行消毒，再用70%酒精清洁该区域三次。</li>
	<li>在显微镜下做颈部正中切口（0.8–1.0 cm）。分离皮肤、肌肉及气管周围组织，然后将20 G套管插入气管。 
	注意：在显微镜下观察将套管插入气管的过程，确保导管未插入食管。</li>
	<li>将小鼠连接至呼吸机，设置潮气量为0.2 mL，呼吸频率为每分钟150次。</li>
	<li>沿锁骨中线用无菌剪刀斜向切开小鼠胸腔。分离皮下组织以暴露肋骨。</li>
	<li>使用无菌剪刀沿左侧锁骨中线以斜角剪开皮肤（0.8–1.0 cm）。行左侧开胸术，分离第三和第四肋骨以暴露心脏。使用肋骨牵开器以获得清晰视野。</li>
	<li>用弯头镊子打开心包膜，随后使用7-0丝线结扎左前降支动脉（位于左心耳下方）。左心室前壁出现苍白区域表明心肌灌注已成功阻断。</li>
	<li>松开肋骨牵开器，用5-0丝线逐层缝合胸腔切口，同时排出胸腔内空气。用5-0丝线缝合颈部切口。</li>
	<li>小鼠自主呼吸恢复后，移除气管插管。腹腔注射0.5 mL预热的无菌生理盐水。每12小时皮下注射一次布托啡诺（0.1 mg/kg），以减轻疼痛。</li>
	<li>最后，将小鼠置于加热垫上等待复苏。密切监测小鼠，确保其未出现严重呼吸困难或出血情况。 通过 目视观察。</li>
	<li>小鼠苏醒后放回笼中。术后第一周内，每天观察小鼠的活动能力、理毛行为和进食情况，确保其状态正常。根据实验需求，在心肌梗死（MI）后的不同时间点处死小鼠并取心脏组织。 
	&#8203;注意：在本方案中，单细胞悬液是在心肌梗死（MI）后2周用心脏组织制备的。</li>
</ol>
2. 心脏单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>溶液和培养基的制备
	<ol>
		<li>心脏组织解离缓冲液：将 10 mg 胶原酶 IV（600 U/mL）、5 mg 分散酶 II（0.5 U/mL）和 50 µL DNase I（100 µg/mL）溶于 5 mL RPMI 1640 培养基中。使用前在 37 °C 水浴中预热该溶液。</li>
		<li>细胞洗涤缓冲液：用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配制 1% BSA 或 10% FBS，置于 4 °C 或冰上保存。</li>
		<li>灌注液：将 PBS（pH 7.4）预冷作为灌注液。</li>
		<li>红细胞（RBC）裂解缓冲液：按照生产商说明使用红细胞裂解缓冲液。 
		注：有关本研究中所用试剂和设备的列表，请参见材料表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）处死小鼠。</li>
	<li>心脏解剖
	<ol>
		<li>用胶带固定小鼠后肢，使其仰卧。</li>
		<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠体表，然后垂直切开腹部皮肤和肌肉，注意避免刺穿肝脏。小心打开胸腔，避免穿刺心脏。</li>
		<li>用预冷的 PBS（pH 7.4）灌注左心室，直至流出液变为无色（约需 15 mL PBS [pH 7.4]）。</li>
		<li>用镊子轻轻将心脏从胸腔中取出，用眼科剪刀剪除附着在心脏外表面的多余组织。将心脏放入含有 1 mL 预冷 PBS（pH 7.4）的 1.5 mL 微离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心脏组织的酶解解离
	<ol>
		<li>将小鼠心脏转移至 24 孔板的一个孔中，孔内预先加入 150 µL 冰上放置的心脏组织解离缓冲液，并用剪刀将心脏剪成小块（约 1 mm）。</li>
		<li>将剪碎的心脏组织转移至含有 5 mL 组织解离缓冲液的 15 mL 离心管中。 
		注：推荐的心脏组织解离缓冲液体积为每心脏 5 mL。</li>
		<li>将离心管置于电动恒温往复摇床中，在 37 °C、125 rpm 条件下振荡 1 小时。每隔 20 分钟用移液器将组织悬液上下吹打 10 次。</li>
		<li>将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤，以去除未消化的组织和细胞团块。加入 25 mL 细胞洗涤缓冲液冲洗原离心管，然后将冲洗液转移至细胞筛进行冲洗。接着将细胞悬液通过 40 µm 细胞筛进一步去除细胞团块。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟，收集过滤后的细胞悬液。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1× 红细胞裂解缓冲液中，在室温（RT）下孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入四倍体积的细胞洗涤缓冲液，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞重悬于 10 mL 细胞洗涤缓冲液中，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 细胞洗涤缓冲液中。</li>
		<li>取 18 µL 细胞悬液与 2 µL 吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）染色液（9:1）混合，取 10 µL 混合液加入细胞计数板。使用自动细胞计数仪评估细胞数量和活力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727(2021).</li>
<li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+in+myocardial+injury%2C+repair%2C+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li>
<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+Inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
<li>Tzahor, E., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coalition+to+heal-the+impact+of+the+cardiac+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment.</a> Science. 377 (6610), 4443(2022).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167(2018).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752(2022).</li>
<li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681(2021).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li>
<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li>
<li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li>
<li>Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

本文旨在描述一种从心肌梗死（MI）后小鼠心脏中分离单个非心肌细胞的实验方案。该方案可用于高质量地分离心肌梗死后微环境中多种类型的细胞，包括免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。获得适用于单细胞测序的高质量细胞悬液有三个关键因素。第一个因素是酶消化条件的设置。控制消化时间以及消化酶的体积和浓度至关重要，以确保细胞活力与分离效率之间的平衡。在本方案中，我们适当提高了酶的浓度并延长了消化时间。建议消化时间为45分钟至1小时。时间过短虽可能提高细胞活力，但会导致心脏组织消化不充分，并增加细胞团块的形成。此外，我们使用DNase I以防止细胞聚集，因为裂解的细胞会释放游离DNA，包裹周围细胞从而形成细胞团块13。&#160;第二个关键因素是使用含有BSA或FBS的细胞洗涤液。BSA或FBS不仅能保护消化酶的活性，还能提高细胞的存活率。最后一个关键因素是通过流式细胞分选（FACS）去除细胞碎片和死亡细胞。细胞碎片会导致细胞计数和活力评估不准确。上述各因素共同作用，可显著提高细胞悬液的活力和纯度，使其更适用于单细胞测序。
本方案首先描述了用于单细胞测序的...

心肌梗死（MI）是最常见的心血管疾病之一，其全球死亡率持续上升1。MI 是由于流向周围心肌的血液供应不足所致，通常由动脉粥样硬化斑块破裂引起的冠状动脉阻塞所导致。尽管经皮冠状动脉介入治疗（PCI）已显著降低了急性 MI 患者的死亡率，但 MI 后心力衰竭的高发病率仍然是一个严峻问题2。MI 后心力衰竭的关键病理生理机制是机体对心脏损伤产生的代偿性反应，该过程会以无收缩功能的纤维化瘢痕替代坏死的心肌组织。这些适应性反应在很大程度上依赖于多种细胞类型与心脏组织细胞相互作用所介导的局部炎症反应，目前这种炎症过程被视为潜在的治疗靶点，旨在减少纤维化瘢痕的形成，从而预防 MI 后心力衰竭3,4。有趣的是，梗死部位的微环境在 MI 不同阶段会随时间推移发生浸润细胞类型及其功能的动态转变1,5。大量研究表明，非心肌细胞（如免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞）在 MI 后的炎症反应及组织修复过程中发挥核心作用5,6。近年来，单细胞测序技术已被广泛用作解析非心肌细胞在 MI 后微环境中参与机制与功能的强大工具7,8。 这些研究为深入理解 MI 后损伤与修复的病理生理过程，以及开发针对 MI 后心力衰竭的潜在治疗策略提供了重要见解。
高通量RNA测序（RNA-Seq）是一种利用下一代测序技术（NGS）对整个转录组进行精细研究的技术7,8,9。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-Seq）的发展彻底改变了生物医学研究领域。与传统的群体测序相比，scRNA-Seq能够在单细胞水平上分析基因表达谱和转录异质性7,8。该技术通过鉴定心肌梗死（MI）后微环境中的不同循环细胞类型，并揭示心肌细胞与非心肌细胞之间的相互作用，显著推动了MI细胞病理生理学的研究9,10。这些发现进一步有助于揭示MI后心力衰竭的新型治疗靶点。通常，基于scRNA-Seq的MI后研究实验包括三个主要部分：（1）建立MI后动物模型；（2）制备单细胞悬液；（3）样本测序与数据分析。值得注意的是，单细胞悬液的制备是scRNA-Seq实验准备过程中最关键的一步，因为细胞悬液的质量直接决定了实验结果的准确性。
本方案旨在从心肌梗死后的心脏组织中提取非心肌细胞的单细胞悬液；尤其重要的是，方案中包含了维持细胞活力和细胞解离效果的具体细节。同时，本方案所使用的设备，如小鼠手术器械、啮齿类动物呼吸机和离心机等，在大多数动物实验中心和生物医学实验室中均可获得，因此该实验的成本相对较低。此外，若将梗死的时间点和部位作为变量考虑，本方案可应用于模拟多种临床场景，尤其适用于研究心肌梗死后并发症。

<table><tbody><tr><td>吖啶橙/碘化丙啶染色</td><td>Logos生物系统</td><td>F23001</td><td></td></tr><tr><td>自动化&amp;nbsp;细胞&amp;nbsp;计数器</td><td>Logos生物系统</td><td>L20001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Servicebio</td><td>G5001</td><td>细胞保护作用</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Logos生物系统</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td>消化酶</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td>消化酶</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>罗氏</td><td>11284932001</td><td>防止细胞聚团</td></tr><tr><td>Falcon&amp;nbsp;40&amp;mu;m细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>去除细胞团块</td></tr><tr><td>Falcon&amp;nbsp;70&amp;mu;m细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>去除未消化的组织和团块</td></tr><tr><td>流式细胞分选仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>碘伏</td><td>欧庆思</td><td>10054963976859</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>FST</td><td>12061-01</td><td></td></tr><tr><td>眼科镊</td><td>真实世界数据</td><td>F14012-10</td><td></td></tr><tr><td>眼科剪</td><td>真实世界数据</td><td>S11036-08</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Beyotime</td><td>C3702-120ml</td><td>去除红细胞</td></tr><tr><td>肋骨牵开器</td><td>FST</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物呼吸机</td><td>哈佛大学</td><td>730043</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>溶剂&amp;nbsp;酶溶液</td></tr><tr><td>无菌剪刀</td><td>真实世界数据</td><td>S14014-10</td><td></td></tr></tbody></table>

制备心肌梗死后成年小鼠心脏的非心肌细胞悬液用于单细胞rna测序

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

心肌梗死（MI）是最常见的心血管疾病之一，其全球死亡率呈上升趋势。非心肌细胞占心脏细胞总数的一半以上，在心肌损伤后参与适应性代偿过程，包括炎症反应、组织修复和瘢痕形成。为了研究心肌梗死后心脏的微环境，单细胞RNA测序（scRNA-seq）被广泛用于鉴定不同类型的心脏细胞及细胞间的相互作用。在scRNA-seq样本制备的各个步骤中，细胞悬液的制备是最关键的步骤之一，因为细胞活力会直接影响scRNA-seq结果的质量。因此，我们设计了一种从心肌梗死后小鼠心脏中制备非心肌细胞悬液的实验方案，特别关注通过选用温和的消化酶、控制消化时间以及应用荧光激活细胞分选（FACS）来提高细胞活力。最后，我们从通过该方案获得的非心肌细胞悬液中分离出CD45+细胞，并进行了单细胞RNA测序。

通过实施本方案的第2节，获得了高活力的单细胞悬液。然而，仍可观察到细胞碎片（图1A）；因此，采用荧光激活细胞分选（FACS）进一步提高细胞悬液质量16。FACS分选后，细胞平均大小从9.6 µm减小至9.1 µm （表1），表明FACS可有效降低细胞悬液中细胞碎片的比例 （图1B）。FACS所用的设门策略见图1C。
除了图1中的图像外，还通过细胞计数仪测量了细胞浓度、平均细胞大小和细胞活力（Table 1）。细胞浓度的差异源于细胞悬液体积的不同。值得注意的是，FACS 分选后平均细胞大小减小（Table 1），表明 FACS 能有效减少细胞聚集体并去除细胞碎片。</...

本文介绍了一种从心肌梗死（MI）后小鼠心脏中分离出足量且高活性的非心肌细胞的实验方案。该方法可用于后续的单细胞测序、流式细胞术分析以及原代细胞培养。

制备心肌梗死后成年小鼠心脏的非心肌细胞悬液用于单细胞RNA测序

心肌梗死（MI）是最常见的心血管疾病之一，其全球死亡率呈上升趋势。非心肌细胞占……

本方案以相对较低的成本确保了单细胞悬液的细胞活力和分离效率。该技术的主要优势在于成本较低，且对实验室设备的要求不高。单细胞测序揭示了心脏病理生理过程中非心肌细胞的异质性，同时也为心脏病的基础与临床研究提供了新的思路。该方案可用于心肌梗死（MI）后心血管环境的相关研究，例如免疫细胞的参与情况。对于初次操作，建议特别注意样本的胃蛋白酶用量和消化时间。一旦按照文中的描述配制好缓冲液和溶液，即将一只两周前发生心肌梗死的安乐死小鼠仰卧位放置于手术台上。使用胶带固定其后肢。为摘除心脏，用70%乙醇喷洒尸体。沿腹部皮肤和肌肉做垂直切口，注意避开肝脏。在不刺破心脏的情况下，小心打开胸腔，并用预冷的PBS溶液灌注左心室，直至灌注液变为无色。用镊子轻轻提起心脏，用眼科剪刀剪去其表面附着的多余组织。将心脏置于1.5毫升微量离心管中，加入1毫升预冷的PBS溶液。将心脏转移至置于冰上的24孔板的一个孔中。用移液器向孔中加入150微升心肌组织解离缓冲液，并用剪刀将心脏剪成约1毫米大小的组织块。将剪碎的心脏组织转移至含有5毫升组织解离缓冲液的15毫升离心管中。将试管置于恒温振荡摇床中。每隔20分钟，用移液器将悬液上下吹打10次。为去除团块和未消化的组织，使用25毫升细胞洗涤缓冲液，通过70微米细胞滤网过滤细胞悬液。冲洗离心管和细胞滤网。接着，将细胞悬液通过40 µm细胞滤网过滤，以去除更多的细胞团块。在4 °C条件下，以300 × g离心力离心过滤后的细胞悬液5分钟。将细胞样品用五倍体积的红细胞裂解缓冲液重悬，在室温下孵育五分钟。随后，在细胞悬液中加入四倍体积的细胞洗涤缓冲液，并按之前所示方法进行离心。弃去上清液后，用10毫升细胞洗涤缓冲液重悬细胞，再次离心。离心结束后，弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升细胞洗涤缓冲液中。取18微升该悬液至另一离心管中，加入2微升吖啶橙-碘化丙啶染色液。取10微升上述染色后的溶液加入细胞计数板中。使用自动细胞计数仪评估细胞数量和存活率。在单细胞心脏悬液中观察到细胞碎片。荧光激活细胞分选有效降低了细胞碎片和细胞聚集的比例，从而减少了平均细胞大小。RNA测序结果显示，通过无监督聚类和降维t分布随机邻域嵌入分析，七种免疫细胞呈现出明显的分离。每种免疫细胞均表现出经典标志物的高表达。心脏组织需切割至足够小，以避免消化不完全，否则会导致细胞悬液中出现大量细胞团块。通过本方案获得的单细胞悬液可进一步用于原代细胞培养的流式分析。本方案有助于心肌感染微环境的研究，可帮助研究人员超越心肌组织本身，将心肌感染视为一种系统性问题。

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科研

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医学

制备用于心肌梗死后成年小鼠心脏单细胞RNA测序的非心肌细胞悬液

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。...

成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱分析

本文介绍了使用兰格多夫灌流系统分离成年小鼠心肌细胞的方法。所获得的细胞具有钙耐受性，电生理静息，并可进行培养，以及利用腺病毒或慢病毒感染来调控基因表达。此外，还可利用MMSYS系统和膜片钳技术分析其功能特性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

我们描述了一种分离成年小鼠心肌细胞的可靠方法。该方案可稳定地从多种基因修饰小鼠中培养出具有功能的成年心肌细胞。...

成年小鼠心肌细胞的分离与培养用于细胞信号转导研究 体外 心脏肥大

本方案描述了一种可重复地分离成年小鼠心肌细胞并进行长期培养的逐步操作方法，具有较高的得率、纯度和细胞活性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin...

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

本文介绍了一种通过酶消化制备单细胞悬液，从人和小鼠心肌组织中分离巨噬细胞及其他非免疫细胞不同亚群的实验方案。同时提供了基于流式细胞术对分离得到的巨噬细胞进行鉴定与表征的设门策略。...

从人和小鼠心肌标本中分离巨噬细胞亚群和基质细胞

本文介绍了一种用于成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养的实验方案。...

成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

本文介绍了一种两步细胞消化方案，用于制备小鼠颈动脉的单细胞悬液。...

小鼠颈动脉单细胞悬液制备用于单细胞测序

学习从心肌梗死后小鼠心脏分离高活性非心肌细胞单细胞悬液的方法，用于单细胞测序和流式细胞术分析。该方案成本低、设备要求简单，可揭示心脏病理生理学中的细胞异质性。

制备心肌梗死后成年小鼠心脏的非心肌细胞悬液用于单细胞RNA测序

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