Name: 评估半胱天冬酶活化以评估先天免疫细胞死亡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 了解评估半胱天冬酶活化的简化技术，用于研究先天免疫细胞死亡机制。该方法通过检测多种半胱天冬酶激活，揭示感染、炎症疾病和癌症中的细胞死亡通路，为疾病机制研究和治疗策略开发提供关键见解。

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感谢Kanneganti实验室成员的评论和建议，并感谢J. Gullett博士提供的科学编辑支持。本实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为AI101935、AI124346、AI160179、AR056296和CA253095（授予T.-D.K.），以及由美籍黎巴嫩裔和叙利亚裔慈善协会（American Lebanese Syrian Associated Charities）资助（授予T.-D.K.）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

T.-D.K. 是辉瑞公司的顾问。

监测caspase的切割与活化是了解天然免疫程序性细胞死亡（PCD）激活过程的最全面方法之一，该过程是天然免疫反应的重要组成部分。本文所述方案展示了一种策略，可用于监测流感病毒（IAV）、单纯疱疹病毒1型（HSV1）和F. novicida感染以及非感染性刺激物LPS联合ATP所诱导的caspase活化。然而，已有大量研究证明，多种其他刺激物也可诱导PCD，并适用于本方法44,48,49,50,51,52,53,54,56...

先天免疫系统在感染过程中以及对无菌性刺激（如组织损伤和稳态失衡）的反应中，充当第一道防御屏障。细胞表面和细胞质中的先天免疫感受器可识别病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs），从而触发炎症信号通路和细胞反应。先天免疫反应的关键过程之一是诱导细胞死亡，以清除受感染或受损的细胞，并进一步驱动先天性和适应性免疫反应。程序性细胞死亡（PCD）在不同物种间高度保守，凸显了其作为先天免疫机制在进化上的重要性。
所有细胞类型中均可激活多种天然免疫程序性细胞死亡（PCD）通路。Caspase 是一类高度保守的细胞内半胱氨酸依赖性蛋白酶家族，在多种 PCD 通路中发挥关键作用，包括传统上非炎症性的凋亡通路，以及焦亡、坏死性凋亡和 PANoptosis 等炎症性 PCD 通路1,2,3,4,5。目前已明确存在 11 种人类 caspase 和 10 种小鼠 caspase，此外还可能存在功能性的伪 caspase；大多数 caspase 以无活性的单体或二聚体前体形式组成性表达，需经切割才能激活6,7。Caspase 还含有对招募和形成多蛋白复合物至关重要的结构域，包括 caspase 激活和招募结构域（CARD），存在于 caspase-1、caspase-2、caspase-4、caspase-5、caspase-9 和 caspase-11 中；以及死亡效应结构域（DED），存在于 caspase-8 和 caspase-10 中。通过其蛋白水解活性以及形成多蛋白复合物的能力，caspase 在天然免疫 PCD 中发挥着关键驱动作用。
半胱天冬酶（caspases）在先天免疫程序性细胞死亡（PCD）中的作用最初是在细胞凋亡中被发现的，其中起始型半胱天冬酶（initiator caspases），包括caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10，可激活效应型半胱天冬酶（executioner caspases），即caspase-3、caspase-6和caspase-7，从而驱动细胞死亡8,9,10,11,12。起始型半胱天冬酶可通过多种信号级联途径被激活；外源性途径通过细胞外配体诱导的死亡受体信号激活caspase-8，而内源性途径则通过线粒体完整性破坏激活caspase-913。活化的起始型半胱天冬酶会切割效应型半胱天冬酶中连接其大亚基和小亚基的连接区，从而生成具有活性的形式。随后，效应型半胱天冬酶切割其底物，导致细胞解体，引发DNA降解、细胞膜出泡、细胞核碎裂以及凋亡小体的释放14,15。当与胞葬作用（efferocytosis）介导的濒死细胞及时清除相结合时，该过程通常以非裂解性和非炎症性的细胞死亡形式结束16。然而，若胞葬作用存在缺陷或缺乏吞噬细胞，则可导致凋亡细胞的积累，进而发生裂解性和炎症性细胞死亡17,18。
炎症性caspase，包括caspase-1（人和小鼠）、caspase-4和caspase-5（人）以及caspase-11（小鼠），已被发现可在一种称为细胞焦亡的炎症性固有免疫程序性细胞死亡（III-PCD）过程中被激活。caspase-1的激活与炎性小体的形成相关，炎性小体是由胞质固有免疫感受器、衔接蛋白分子（含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白[ASC]）和caspase-1组成的多蛋白复合物。该复合物的形成使caspase-1发生邻近诱导的自剪切，释放其活性形式，进而切割包括促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18以及成孔分子gasdermin D（GSDMD）在内的靶底物。19,20,21,22,23Caspase-11、caspase-4 和 caspase-5 也可在感知病原体相关分子模式（如脂多糖，LPS）后，不依赖炎性小体的上游形成而直接激活 GSDMD19,20这些caspase在结合胞质LPS后发生二聚化，随后寡聚化并自我切割而被激活，从而引发非经典炎症小体的活化24,25,26&#160;以细胞内在方式激活caspase-1，诱导IL-1β和IL-18成熟20这些促炎性细胞因子的成熟与释放使这些胱天蛋白酶具有如下特征 &#34;此外，已发现凋亡相关的caspase-8定位于炎性小体，从而为凋亡与细胞焦亡过程之间提供了联系。&#160;研究发现，凋亡相关的caspase-8在调控另一种程序性细胞死亡（PCD）形式中也具有关键作用&#160;称为坏死性凋亡。caspase-8的缺失可导致受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶3（RIPK3）介导的混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）自发激活，从而驱动III型程序性细胞死亡（III-PCD）通路&#160;坏死性凋亡27,28,29,30,31,32,33,34,35.&#160;
虽然半胱天冬酶（caspases）传统上被归类为 &#34;凋亡的&#34; 或 &#34;炎症的&#34; 根据它们所启动的细胞死亡类型，越来越多的证据表明，通过caspase介导的先天免疫程序性细胞死亡通路之间存在广泛的交互作用3,4例如，炎性小体中的炎性半胱天冬酶-1在其经典的激活位点切割凋亡相关的半胱天冬酶-734Caspase-1的激活还可能导致凋亡底物（如聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1））的切割36在缺乏GSDMD的细胞中，caspase-1也可切割caspase-337,38此外，经典的凋亡性半胱天冬酶-3（caspase-3）可切割细胞焦亡相关蛋白GSDME，从而诱导程序性细胞死亡（PCD）17,18&#160;并将GSDMD切割成非活性形式40此外，已观察到caspase-8被招募至炎症小体复合物39,40,41,42,43,44,45，而caspase-8是经典和非经典炎性小体激活的关键调节因子39在许多炎症条件下，caspase-8 与 caspase-1 也存在功能上的重叠与冗余，且在多种疾病谱中均可观察到一种以焦亡、凋亡和坏死性凋亡组分激活为特征的先天免疫程序性细胞死亡。39,46,47,48,49,50.
基于炎症性caspase与凋亡性caspase之间的这种串扰，先天免疫与程序性细胞死亡（PCD）机制理解中的一个关键空白被识别出来，从而促成了PANoptosis的发现。PANoptosis是一种独特的III型程序性细胞死亡（III-PCD）形式，可由病原体、病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）以及稳态失衡所激活，并由PANoptosome调控——PANoptosome是一类多功能的大分子复合物，能够整合其他细胞死亡通路的组分44,50,51,52,53,54,55。PANoptosis所产生的全部生物学效应无法单独由焦亡、凋亡或坏死性凋亡各自解释3,4,35,36,39,46,47,48，因为PANoptosis的特征是多种caspase的共同激活，包括caspase-1、caspase-11、caspase-8、caspase-9、caspase-3和/或caspase-7，具体激活的caspase种类取决于不同的生物学情境44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62。越来越多的研究表明，PANoptosis在感染性疾病和炎症性疾病中发挥重要作用，同时也与癌症及其治疗密切相关3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53,54,56 
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66。
鉴于半胱天冬酶（caspases）在包括凋亡、细胞焦亡等多种细胞死亡通路中的关键作用，&#160;坏死性凋亡（necroptosis）和PAN凋亡（PANoptosis），开发用于表征其活化并理解程序性细胞死亡（PCD）通路完整复杂性的技术至关重要。本方案详细描述了一种刺激细胞并检测随后半胱天冬酶（caspases）活化的方法。图1）。该方法利用半胱天冬酶（caspase）的蛋白水解切割过程（通常为其活化所必需）来对其进行研究。通过蛋白质印迹（western blotting），可确定蛋白质的大小，从而清晰地显示并区分无活性的前体caspase及其活化后被切割的形式。
该方案的主要优势在于：1）能够从单一内源性细胞群体中平行检测多种caspase的活化状态，从而更准确地确定程序性细胞死亡（PCD）的激活情况；2）采用了相对简单的实验技术，无需 extensive training 或昂贵仪器。以往的方案通常采用蛋白质印迹法（western blotting）、荧光报告系统或抗体染色来监测培养上清液、细胞和组织裂解物以及完整细胞中的caspase活化情况。 通过 显微镜技术，以及 体内67,68,69,70,71，但这些技术通常只能在样品中监测一种或两种半胱天冬酶。此外，尽管已有利用含有半胱天冬酶切割位点的合成肽底物——在被切割后可产生荧光——用于监测细胞或组织裂解液中的半胱天冬酶活化69，这些底物通常可被多种caspase切割，因此很难确定该系统中单个caspase的特异性激活。此外，使用Western印迹法而非荧光报告分子或其他基于标签的方法，可使研究人员直接利用内源性细胞，而无需构建携带报告基因的特定细胞系。使用内源性细胞具有多重优势，其中包括许多永生化细胞系缺乏关键的细胞死亡分子。72,73这可能会影响实验结果。此外，使用内源性细胞可评估多种细胞类型（如巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞），而非单一细胞谱系。Western blotting 也是一种相对简单且成本较低的技术，可在全球范围内的实验室中开展，无需大型昂贵设备或复杂的实验装置。
该方案在生物学领域具有广泛适用性，可用于研究半胱天冬酶（caspases）的细胞死亡依赖性和非依赖性功能，包括其支架作用以及其他炎症信号通路中的功能74。应用此方法可为研究不同疾病和状态下先天免疫程序性细胞死亡通路及炎症信号传导提供统一的策略，并可用于鉴定关键的调控过程和机制联系，从而为未来治疗策略的开发提供依据。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>12% 聚丙烯酰胺凝胶（10 孔）&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞滤网&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>182 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>白色附件透析托盘</td><td>Cytiva</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;胱天蛋白酶-1 抗体</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;胱天蛋白酶-11 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;胱天蛋白酶-3 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;胱天蛋白酶-7 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;胱天蛋白酶-8 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;胱天蛋白酶-9 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;活化胱天蛋白酶-3 抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;活化胱天蛋白酶-7 抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;活化胱天蛋白酶-8 抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP 标记二抗&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 HRP 标记二抗&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠 HRP 标记二抗&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;&amp;beta;-肌动蛋白抗体 (C4) HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL 胰蛋白酶大豆肉汤</td><td>BD Biosciences</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>珠浴器</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229315</td><td></td></tr><tr><td>化学发光成像仪（Amersham 600）&amp;nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;培养箱</td><td>VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>电泳装置&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>新凶手弗朗西斯菌（U112 菌株）</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>凝胶释放器&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>单纯疱疹病毒 1 型（HF 菌株）</td><td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>高糖 DMEM&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>人抗&amp;ndash;胱天蛋白酶-1 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>人抗&amp;ndash;胱天蛋白酶-8 抗体</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>加湿培养箱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>甲型流感病毒（A/Puerto Rico/8/34，H1N1 [PR8]）&amp;nbsp;</td><td>根据 Hoffmann 等人方法构建</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L929 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>用于制备 L929 条件培养基的细胞系</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP376-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP 底物</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td>标准灵敏度 HRP 底物</td></tr><tr><td>MDCK 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>用于测定 IAV 病毒滴度的细胞系</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40 溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>电源&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>方形培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>洗脱缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Super Signal Femto HRP 底物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34580</td><td>高灵敏度 HRP 底物</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot 半干转印系统&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 0111:B4 超纯脂多糖（LPS）</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>Vero 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>用于测定 HSV1 病毒滴度的细胞系</td></tr></tbody></table>

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

先天免疫在应对病原体和无菌性损伤时提供关键的第一道防御屏障。这一反应的关键机制之一是启动先天免疫相关的程序性细胞死亡（PCD），以清除受感染或受损的细胞并促进免疫反应的传播。然而，过度的PCD与炎症和病理变化相关。因此，理解PCD的激活与调控机制，是阐明先天免疫反应特征以及在多种疾病谱中发现新的治疗靶点的核心环节。
本方案提供了通过监测半胱天冬酶（caspase）来表征天然免疫程序性细胞死亡（PCD）活化的方法。半胱天冬酶是一类依赖半胱氨酸的蛋白酶，通常与多种程序性细胞死亡通路相关，包括&#160;凋亡&#160;、焦亡、坏死性凋亡和PANoptosis。早期研究将caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10归类为凋亡中的起始caspase，而将caspase-3、caspase-6和caspase-7归类为效应caspase；后续研究发现，炎症性caspase（包括caspase-1、caspase-4、caspase-5和caspase-11）可驱动焦亡。目前研究已知，caspase与其他天然免疫及&#160;细胞死亡分子在既往定义的PCD通路之间存在广泛的交叉对话，这揭示了在天然免疫与PCD机制理解方面的一个关键知识空白，&#160;并推动了PANoptosis的提出与界定。PANoptosis是一种独特的由PANoptosome复合物调控的天然免疫炎症性程序性细胞死亡通路，该复合物整合了来自其他细胞死亡通路的组分，包括caspase&#160;等。
本文提供了评估细胞在不同刺激下caspase激活状态的方法。这些方法可用于表征体外（in vitro）和体内（in vivo）的程序性细胞死亡（PCD）通路，因为活化的caspase会发生蛋白水解性剪切，可通过使用合适的抗体和印迹条件进行Western印迹检测并加以可视化。我们已建立了一种实验方案和Western印迹工作流程，能够从同一细胞群体中同时评估多种caspase的激活情况，从而对PCD过程进行全面表征。该方法可广泛应用于发育、稳态、感染、炎症和癌症等研究领域，以评价健康和疾病状态下细胞生命活动中的PCD通路。

PAN凋亡已被发现可响应多种细菌、病毒和真菌感染以及其他炎性刺激，同时也存在于癌细胞中44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61<...

本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内 （在小鼠中）通过感染、无菌性损伤和癌症模型，确定细胞死亡通路（如焦亡、凋亡、坏死性凋亡和PANoptosis）的启动机制。

先天免疫在应对病原体和无菌性损伤时提供关键的第一道防御防线。这一反应的关键机制组成部分是……

本方案提供了对细胞死亡过程激活的多维度理解，有助于深入揭示疾病机制，并为治疗策略的制定提供依据。本方案依赖于一种较为简便的技术，通过内源性细胞的单一群体即可检测多种关键胱天蛋白酶（caspase）的激活，从而更准确地确定其激活状态。先天免疫细胞死亡已被证实与多种疾病相关，涵盖感染性疾病、炎症性疾病以及癌症。通过caspase激活来理解细胞死亡的分子机制，可以为疾病过程提供关键见解。来自某实验室的博士后研究员Julieann博士将演示该实验步骤。在分离骨髓并诱导BMDMs分化后，用甲型流感病毒感染细胞。计算感染复数为20个空斑形成单位时所需的病毒体积。移除BMDM中的培养基，并用500微升PBS洗涤细胞一次。向每孔加入450微升流感A病毒（溶于高糖DMEM，不含热灭活FBS），在37°C、湿润培养箱中孵育1小时，以使病毒吸附。在1小时孵育结束后，加入50微升热灭活的FBS，并将培养板放回37摄氏度培养箱中继续孵育，总孵育时间达到12小时。12小时孵育后，从培养箱中取出培养板。吸除150微升上清液，并弃去或保存用于上清液分析。不要移除残留的上清液。现在，通过将每孔50微升caspase裂解缓冲液与100微升4×SDS缓冲液混合，制备蛋白质收集溶液。然后，向每孔加入150微升该混合液。每个孔中，用移液器吸取混合液以收集裂解的细胞和上清液。移液时，用移液器吸头轻轻刮擦孔底，以充分破坏细胞。刮擦并移液后，将蛋白裂解液收集至预先标记的 1.5 毫升离心管中。使用金属浴，将所有离心管在100摄氏度加热12分钟。从金属浴中取出离心管，在室温下以14,500 G离心30秒，使不溶性组分沉淀。准备电泳装置，使用含有10个加样孔的12%聚丙烯酰胺凝胶。将电泳装置中加入电泳缓冲液，并取出凝胶梳子。然后，将样品在100°C加热5分钟。上样前，在室温下以14,500 ×g离心30秒。然后，缓慢将30微升样品加入每个孔中。检测caspase 1、3、7和8时，使用合并的上清液与蛋白裂解液以及caspase裂解缓冲液，或使用组织匀浆液；检测caspase 11和9时，使用本方案中所述的蛋白裂解液DN RIPA缓冲液或组织匀浆液。若需同时检测全部六种caspase，请采用相同步骤，将相同样品分别加入六块凝胶中。将电泳装置连接至电源，设定电压为80伏，持续20分钟，以开始电泳。初始20分钟后，将电压调整为100伏，继续电泳45至60分钟。观察染料前沿的迁移情况。当染料前沿到达凝胶底部时，关闭电源。在电泳进行的同时，按照文中的描述配制转移缓冲液。每次均需新鲜配制该溶液。使用凝胶释放器从电泳装置中取出凝胶。为搭建凝胶转膜体系，将PVDF膜浸入甲醇中浸泡1分钟以活化。用转移缓冲液预湿两张滤纸、凝胶和PVDF膜，持续5分钟。在此5分钟孵育期间，将PVDF膜和凝胶分别置于不同的容器中。开始在半干转系统上

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

评估半胱天冬酶活化以评估先天免疫细胞死亡

本视频展示了利用双分子荧光互补报告蛋白在人巨噬细胞中激活半胱天冬酶（caspase）蛋白的过程。将caspase-1的前结构域与非荧光性的Venus蛋白片段融合，这些片段可被招募至炎性小体复合物。炎性小体之间的空间接近性促使Venus片段重新折叠并产生荧光，从而证实巨噬细胞中caspase的激活。...

人源单核细胞衍生巨噬细胞中Caspase激活的可视化

本视频展示了通过流感病毒感染刺激骨髓来源的巨噬细胞，以评估多种caspase的激活情况。在巨噬细胞裂解、裂解物热灭活及离心后，收集细胞内caspase用于后续免疫学分析。...

巨噬细胞中多种Caspase激活的评估

多重检测可为细胞基本机制提供有益信息 并减少试剂浪费和不必要的重复实验。本文介绍一种多重caspase-3/7活性检测方法，采用基于荧光和发光的技术，用于测定细胞活力 体外...

利用Caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

为了在整体动物中检测含有低水平半胱天冬酶（caspase）活性的健康细胞，研究人员为黑腹果蝇（Drosophila）开发了高灵敏度的生物传感器，命名为CaspaseTracker。在无死亡刺激条件下、经优化培养的成年动物体内各内脏器官的长寿健康细胞中，均可检测到依赖半胱天冬酶的生物传感器活性。...

体内 生物传感器追踪非凋亡性半胱天冬酶活性 果蝇

我们描述了在细胞水平上通过荧光显微镜检测NLRP3炎性小体活化的方法，该方法利用针对活化型caspase-1和接头蛋白ASC的染色技术。同时提供了一种乳酸脱氢酶释放实验，用于在群体水平上检测细胞焦亡性裂解。这些技术可被调整用于研究炎性小体生物学的多个方面。...

小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测

本文介绍了一种实验流程，可直接在死亡诱导信号复合物（DISC）处检测caspase-8的加工过程，并确定该复合物的组成。该方法具有广泛的应用，从揭示细胞死亡通路的分子机制到凋亡网络的动态建模均可适用。...

测量CD95死亡诱导信号复合物的组成及其复合物中前体caspase-8的加工过程

本方案描述了从人血液样本中获取单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）的工作流程，一种在不损害细胞活力和行为的前提下，将炎症性半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）报告系统高效导入人MDM的简便方法，以及一种基于成像的技术，用于在活细胞中检测炎症性半胱天冬酶的激活。...

人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化

甲型流感病毒（IAV）感染会激活半胱天冬酶（caspases），从而切割宿主和病毒蛋白，这些切割产物具有促病毒和抗病毒功能。通过使用抑制剂、RNA干扰、定点突变以及蛋白质印迹和逆转录定量PCR技术，研究人员鉴定了在感染的哺乳动物细胞中切割宿主蛋白cortactin和组蛋白去乙酰化酶的半胱天冬酶。...

鉴定在甲型流感病毒感染过程中切割蛋白质的半胱天冬酶及其基序

本实验方案描述了两种通过荧光底物结合流式细胞术或荧光分光光度计来检测caspase活性的方法。...

使用荧光定量法或流式细胞术检测Caspase活性

细胞介导的淋巴细胞毒性（CML）实验可用于检测自身反应性应答，并在体外研究细胞死亡机制。然而，结合活细胞共聚焦显微镜成像技术与荧光染料，可更详细地研究细胞死亡的类型、动力学特征以及所涉及的信号通路。...

评估细胞毒性T淋巴细胞介导的β细胞死亡的方法

了解评估半胱天冬酶活化的简化技术，用于研究先天免疫细胞死亡机制。该方法通过检测多种半胱天冬酶激活，揭示感染、炎症疾病和癌症中的细胞死亡通路，为疾病机制研究和治疗策略开发提供关键见解。

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

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