Name: 用于生物医学应用的荧光寿命宏观成像仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 了解用于生物医学应用的荧光寿命宏观成像技术。本方法采用时间相关单光子计数模式，可在活体动物组织中实现磷光寿命和氧浓度的二维高对比度成像，为研究癌症、中风及炎症等组织缺氧相关疾病提供创新工具。

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特此感谢爱尔兰科学基金会（SFI/12/RC/2276_P2、SFI/17/RC-PhD/3484 和 18/SP/3522）以及突破性癌症研究基金会（Precision Oncology Ireland）为本工作提供的资金支持。

所有涉及动物的操作均在爱尔兰健康产品监管局（HPRA）签发的许可下进行，符合欧洲共同体理事会指令（2010/63/EU）的要求，并经科克大学动物实验伦理委员会批准。
1. 样品制备
<ol>
	<li>活体组织样本的探针染色 离体&#8203;
	<ol>
		<li>对于 离体 应用时，使用从4周龄雌性Balb/c小鼠新鲜分离的组织样本。</li>
		<li>实验当天，通过断头法处死一只小鼠，迅速解剖取出结肠（大肠）片段，大小约10 mm。立即用PBS缓冲液清洗，放入添加了10 mM Hepes缓冲液（pH 7.2）的DMEM培养基中，并在37 °C下孵育36.</li>
		<li>将活体组织样本转移至微型培养皿中，加入2 mL含1 mg/mL NanO2-IR探针的完全DMEM，确保覆盖肠组织浆膜面，于37 °C孵育30分钟。 
		注意：死后组织中的细胞在培养条件下可保持活性数小时。NaNO2-IR 具有轻微细胞毒性，因此所有实验均在组织分离后 4 小时内完成。</li>
		<li>对于深层组织管腔内 离体 染色后，将肠段转移至干燥的培养皿中，并用滤纸吸去多余的DMEM。</li>
		<li>注射含1 mg/mL NanO2-IR的DMEM溶液1 µL35 使用 Hamilton 注射器将样品注入管腔，并将样品孵育 15 分钟或最长 4 小时。 
		注意：NaNO2-IR 具有轻微的长期细胞毒性作用；因此，所有实验应在组织分离后 4 小时内完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体动物中染色肿瘤组织的制备
	<ol>
		<li>对于 体内 应用：在含0.05 mg/mL NaNO2-IR探针的无血清培养基中，对CT26细胞预染色18小时。</li>
		<li>取一只小鼠，剃除其右侧 flank 部位的毛发，用注射器注射 200 µL 含 1 × 105 未染色细胞和 1 × 105 经NanO2-IR预染色的细胞</li>
		<li>让肿瘤在小鼠体内生长，定期使用游标卡尺监测肿瘤大小，并监测动物体重37移植肿瘤的动物在肿瘤生长第七天即可进行成像。 
		注意：肿瘤体积使用以下公式计算：(1): 
		V = (L × W2)/2&#160; &#160; &#160;(1) 
		&#8203;其中 L 是肿瘤的直径，且 W i垂直于直径的直径 L.</li>
		<li>成像前通过颈椎脱位法处死动物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PLIM 成像系统设置
<ol>
	<li>取 Cricket 适配器，卸下其背面的 C 接口适配器，以接触内部的像增强器外壳。将 MCP-125 像增强器插入该腔室，然后重新装回 C 接口适配器。</li>
	<li>移除 Cricket 设备前端的 C 接口适配器，插入 760 nm ± 50 nm 发射滤光片，然后重新装回 C 接口适配器以固定滤光片。</li>
	<li>将 Tpx3Cam 相机模块连接到 Cricket 模块的背面 通过 其C型接口适配器</li>
	<li>将镜头连接到 Cricket 模块的前端 通过 其C型接口适配器。</li>
	<li>将整个相机组件安装在光学黑箱顶部，镜头朝下，对准用于放置待成像样品的载物台（图1).</li>
	<li>将624 nm高亮度LED安装在连接至黑盒内面包板的支架上。</li>
	<li>将LED连接至电源和脉冲发生器。打开LED电源，并调节聚焦，以确保对成像样品进行有效且均匀的激发。</li>
	<li>将相机连接至另一个脉冲发生器，并同步发送至相机和LED的脉冲信号38.</li>
	<li>使用 Cricket 装置上的专用电缆和插口，将增压器连接至标准电源，并设置 增益 到 2.7 V.</li>
	<li>利用镜头和Cricket适配器的聚焦功能，将相机光学系统对焦于样品台，以获得对比度和亮度良好的清晰样品图像。</li>
	<li>对于使用Pt-卟啉染料的成像，将Cricket模块中的625 nm LED更换为390 nm LED用于激发，并将760 nm ± 50 nm滤光片更换为650 nm ± 50 nm滤光片。</li>
</ol>
3. 图像采集
<ol>
	<li>将样品置于相机镜头前方。 
	注意：使用可调节x-y-z轴的载物台作为样品 holder，以便调整样品位置以获得良好的聚焦。</li>
	<li>关闭房间内的所有灯光。</li>
	<li>打开 Sophy 软件以调节操作参数，例如聚焦和样品对准。 
	注意：Sophy 软件随相机一并提供，用于设置成像参数并记录数据。请通过检查相机代码确认软件已与相机连接。然而，我们使用了另一种程序进行数据采集。</li>
	<li>在 模块，选择 无限帧，并设置 像素操作模式 到 阈值以上时间.</li>
	<li>在 模块，前往 预览，并选择 活性模块。这打开了 Medpix/Timpix 帧 窗</li>
	<li>在此窗口中，更改 颜色标尺，以及 旋转 将图像调整至所需的方向。</li>
	<li>打开增压器，并开始记录。 
	注意：使用 Sophy 软件的记录界面，通过视觉确认样品的对齐和聚焦状态，并优化记录时的 LED 激发参数。</li>
	<li>停止录制，并关闭 Sophy 软件。</li>
	<li>前往 末端，并使用定制软件以二进制格式采集原始数据并进行后续处理（https://github.com/svihra/TimePix3）。
	<ol>
		<li>在 末端，运行以下命令以记录数据： 
		Cd 文档/SPIDR/主干/发布/ 
		&#160;ls 
		./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {文件名} - t {采集时间} 
		注意：输入时 &#34;ls,&#34; 检查当前目录中的文件列表；确认可见 Tpx3daq。</li>
		<li>等待所有帧记录完成。</li>
		<li>要处理数据，请运行以下命令： 末端 
		cd 文档/数据处理/Timepix3/Timepix3/ 
		根 
		.dataprocess.cpp++ 
		&#8203;.x DRGUI.C</li>
		<li>等待一个 RRGui 窗口将打开。选择左侧的所有变量 所有数据, 单文件，以及 质心 在右侧。</li>
		<li>选择要处理的文件并运行数据缩减程序。 
		&#8203;注意：所有处理后的文件将与原始文件位于同一文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用用C语言编写的专用程序分析后处理数据，该程序可将数据写入.ics图像文件（https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam）。</li>
	<li>使用免费提供的Time Resolved Imaging软件打开.ics图像文件（见材料表）。采用双指数函数拟合磷光衰减曲线。</li>
	<li>使用可用的图像分析软件打开拟合后的.ics图像文件（见材料表）。</li>
	<li>通过使用查找表，生成磷光寿命图像，并以伪彩色尺度进行编码（例如，短寿命用蓝色表示，长寿命用红色表示）。利用测量功能计算整个图像或特定感兴趣区域（ROIs）的平均寿命值。</li>
	<li>根据探针对O2校准拟合所得方程，将寿命值转换为氧气浓度36。 
	注意：本研究使用了方程（2）： 
	O2 [µM] = −86.16 + 770.35 × e−0.049 × LT&#160; &#160; &#160;（2）</li>
</ol>

<ol><li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li>
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<li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research%5BTitle%5D)+AND+%2217th+International+Meeting+on+Chemical+Sensors+-+IMCS%22%5BJournal%5D)">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li>
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<li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li>
<li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li>
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<li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li>
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<li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li>
<li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li>
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<li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems%3A+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800(2017).</li>
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<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li>
<li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459(2020).</li>
<li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

上述方案详细描述了新型成像仪的组装及其在微秒级荧光寿命成像（FLIM）/磷光寿命成像（PLIM）模式下的操作。基于时间相关单光子计数（TCSPC）技术的新一代Tpx3Cam相机，通过光学机械适配器Cricket与图像增强器、发射滤光片和远距镜头相连接，构成一个稳定、紧凑且灵活的光学模块，操作简便。该成像仪已在多种不同样品和分析任务中表现出良好的性能，包括磷光材料的表征和活体组织氧（O2）成像。成像实验中使用了基于近红外Pt(II)-苯并卟啉的可透过细胞膜的可溶性探针NanO2-IR，以及基于红色发射Pt(II)-卟啉的固态传感器。这些传感器因其大的斯托克斯位移、长发射寿命、高灵敏度、快速响应和良好的光化学稳定性，已成功用于基于荧光猝灭原理的氧气（O2）检测。
在宏观成像仪上测试这些不同的对 O2 敏感的探针和固态涂层时，所得结果与先前发表的数据一致40。这些材料在温度和氧合状态等环境条件变化时，表现出良好的均匀性、对比度以及寿命响应。将这些结果与共聚焦 TCSPC-PL...

O2 是生命系统的关键环境参数之一，了解 O2 的分布及其动态变化对许多生物学研究具有重要意义1,2,3。利用磷光探针4,5,6,7,8 和荧光寿命成像显微技术（PLIM）9,10,11,12,13 评估组织氧合状态在生物和医学研究中正日益受到关注3,9,14,15,16,17,18,19。这是因为 PLIM 与荧光或磷光强度测量不同，不受探针浓度、光漂白、激发光强度、光学对准、散射和自发荧光等外部因素的影响。
然而，现有的 O2 PLIM 平台受限于其灵敏度、图像采集速度、准确性和整体可用性。时间相关单光子计数（TCSPC）结合光栅扫描程序，常用于 PLIM 和荧光寿命成像显微技术（FLIM）设备中20,21,22。然而，由于 PLIM 需要较长的像素驻留时间（在毫秒量级），其图像采集时间远长于 FLIM 应用所需的时间20,22,23。其他技术，如门控 CCD/CMOS 相机，则缺乏单光子灵敏度且帧率较低20,24,25,26。此外，现有的 PLIM 系统大多以显微形式使用，而宏观系统则较为少见27。
基于TCSPC的PLIM宏观成像系统28被建立以克服上述诸多限制。该成像系统的构建得益于一种新型光机械适配器Cricket的使用，其具备以下特点：i）两个C接口适配器，可方便地将相机模块连接至后端，物镜连接至前端；ii）内部设有图像增强器的安装空间，并在外侧设有为其供电的电源插座；iii）前端C接口适配器后方留有内部空间，可容纳标准25 mm发射滤光片，置于增强器前方；iv）内置光束准直光学元件及环形调节装置，可实现物镜与相机之间的光学对准和聚焦，从而在相机芯片上获得清晰的图像。
在组装好的成像仪中，相机模块连接到Cricket适配器的背面，该适配器内部包含一个图像增强器，其结构依次为光电阴极、微通道板（MCP）、放大器以及快速闪烁体P47荧光粉。Cricket内部安装有760 nm ± 50 nm的发射滤光片，物镜NMV-50M11''则连接在前端的C型接口适配器上。最后，通过环形调节器对物镜和相机进行光学对准。
增强器的作用是探测入射光子，并将其转换为相机芯片上的快速光脉冲，这些光脉冲被记录下来并用于生成发射衰减曲线和寿命图像。该相机模块包含一个基于先进TCSPC技术的光学传感器阵列（256像素 × 256像素）以及新一代读出芯片29,30,31,32,33，能够在每个成像像素上同时记录光子脉冲的到达时间（TOA）和超过阈值的时间（TOT），时间分辨率为1.6 ns，读出速率达到80 Mpixel/s。
在此配置中，配备增强器的相机具有单光子灵敏度。该系统由数据驱动，并基于快速像素探测器读出（SPIDR）系统34。成像仪的空间分辨率此前已使用平面磷光氧（O2）传感器和分辨率板掩模进行表征。仪器响应函数（IRF）是在与其他所有测量相同的设置下，通过成像平面荧光传感器测得的。染料的寿命约为2.6 ns，足够短，可用于PLIM模式下的IRF测量。该成像仪可对最大尺寸为18 mm × 18 mm的物体进行成像，其空间分辨率和时间分辨率分别为39.4 µm和30.6 ns（半高全宽）28。
以下方案描述了宏成像仪的组装及其用于绘制O的后续使用2 生物样品中经先前表征的近红外O染色后的浓度2 探针，NanO2-IR35探针是一种明亮、光稳定且可穿透细胞的O2基于铂(II)苯并卟啉（PtBP）染料的传感探针。该探针在625 nm处可被激发，发射波长为760 nm，对O₂具有稳定的光学响应2 在生理范围内（0%–21% 或 0–210 µM O₂）2）。该成像仪还可用于表征基于Pt(II)-卟啉染料的不同传感材料。总体而言，该成像仪结构紧凑、灵活性高，类似于普通摄影相机。在当前配置下，该成像仪适用于多种宽场PLIM应用。若将LED替换为快速激光光源，可进一步提升成像仪性能，并有望实现纳秒级FLIM应用。

<table><tbody><tr><td>627 nm LED</td><td>Parts Express</td><td></td><td>可根据传感器的激发波长更换为其他LED。Pt-卟啉染料使用390 nm LED。</td></tr><tr><td>760 &amp;plusmn; 50 nm 发射滤光片</td><td>Edmund Optics</td><td>84-788</td><td>可根据传感器的发射波长更换为其他滤光片。Pt-卟啉染料使用650 &amp;plusmn; 50 nm 带通滤光片。</td></tr><tr><td>Balb/c小鼠</td><td>Envigo, 英国</td><td>Balb/c</td><td></td></tr><tr><td>黑色屏蔽箱</td><td>Thorlabs</td><td>XE25C9/M</td><td></td></tr><tr><td>Cricket适配器</td><td>Photonis</td><td>Cricket-2</td><td></td></tr><tr><td>CT26细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CT26.WT</td><td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0697</td><td>也可使用其他培养基</td></tr><tr><td>ImageJ软件</td><td>ImageJ</td><td></td><td>免费图像分析软件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>MCP-125带P47磷屏的图像增强器</td><td>Photonis</td><td>PP0360EF</td><td></td></tr><tr><td>小型培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.300</td><td>直径35 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>75微米厚Mylar塑料薄膜&amp;nbsp;</td><td>RS Ireland</td><td>785-0795</td><td>也可使用其他塑料基底</td></tr><tr><td>NanO2-IR</td><td>自制</td><td>n/a</td><td>探针可根据已发表的方法合成：“Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.”，或由本实验室提供。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NMV-50M11&amp;rdquo; 50 mm镜头</td><td>Navitar</td><td></td><td>可使用其他兼容C接口适配器的镜头</td></tr><tr><td>光学面包板</td><td>Thorlabs</td><td>MB1836</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td>直径92 mm</td></tr><tr><td>电源</td><td>Tenma</td><td>72-10495</td><td></td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>Tenma</td><td>TGP110</td><td></td></tr><tr><td>Sophy</td><td>Amsterdam Scientific Instruments</td><td>n/z</td><td>由ASI随Tpx3Cam一并提供</td></tr><tr><td>Tpx3Cam</td><td>Amsterdam Scientific Instruments</td><td>TPXCAM</td><td></td></tr><tr><td>Tri2软件</td><td>牛津大学</td><td>n/a</td><td>免费时间分辨成像软件，可从以下网址下载：https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td></tr><tr><td>XYZ平移台</td><td>Thorlabs</td><td>LT3</td><td></td></tr></tbody></table>

用于生物医学应用的荧光寿命宏成像仪

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

本文介绍了一种新型光致发光寿命成像仪，旨在绘制分子氧（O₂）在生物组织和材料中的空间分布图。该系统结合了高灵敏度时间相关单光子计数技术与快速扫描光学显微成像，能够以微米级空间分辨率和纳秒级时间分辨率实现非侵入性、实时的氧浓度动态监测。通过检测磷光探针的发光衰减特性，该成像仪可量化局部氧分压，并适用于活体组织、细胞培养及功能性材料的研究。文中详细描述了仪器的设计原理、校准方法及典型应用案例，包括肿瘤模型中缺氧区域的可视化和光催化材料表面反应活性的表征。该技术为生理学、病理学及材料科学领域提供了高精度的氧传感解决方案。 
关键词：光致发光寿命成像，分子氧，O₂，时间相关单光子计数，缺氧成像，磷光探针，氧传感，生物组织成像，功能材料分析2)浓度在不同磷光样品中的变化，涵盖固态、O2-对用可溶性O染色的活体动物组织样本的敏感涂层2-敏感探针。特别是使用了基于纳米颗粒的近红外探针NanO2-IR，该探针可由625 nm发光二极管（LED）激发，并在760 nm处发射信号。成像系统基于Timepix3相机（Tpx3Cam）和光学-机械适配器构建，后者还包含一个图像增强器。O2 磷光寿命成像显微技术（PLIM）在多种研究中常被需要，但现有平台在准确性、通用灵活性和易用性方面存在局限性。
本文介绍的系统是一种基于集成光学传感器与读出芯片模块Tpx3Cam的快速、高灵敏度成像仪。该系统可从表面染色的肠组织样本或结肠腔内染色片段中产生高强度的磷光信号和稳定的寿命值，实现对组织氧合状态的精细 mapping2 水平在约20秒或更短时间内完成。本文还展示了在无意识动物体内移植肿瘤的缺氧成像方面的初步实验结果。我们还描述了如何对成像仪进行重新配置以用于O2基于Pt-卟啉染料的对氧敏感材料，采用390 nm LED作为激发光源，650 nm带通滤光片用于发射光检测。总体而言，PLIM成像系统能够对所用探针的寿命值进行准确的定量测量，并生成相应的二维O₂分布图2 浓度。它也适用于代谢成像 离体 组织模型和活体动物。

对于 离体 成像应用中，通过在组织浆膜侧局部施加NanO2-IR探针对肠组织碎片进行染色。为实现更深的染色， 1 µL 探针被注入管腔内。在后一种情况下，0.2–0.25 mm 厚的肠壁将探针与相机隔开。这两种染色过程在下文展示。 图 2A.
所得的强度和PLIM图像如下所示 图 2B-G颜色明显反映了寿命值的差异，因而反映了组织浆膜侧与黏膜侧氧合状态的差异。 图2C 和 图 2D 参考经局部染色的相似组织样本（图 2C）以及管腔内（图 2D）。与预期一致，组织显示出相似的PLIM模式。然而，组织黏膜侧的管腔内...

本文介绍了一种新型快速光学成像仪在长衰减发射样品宏观光致发光寿命成像中的应用。文中描述了该成像仪的集成、图像采集与分析流程，以及用于成像的传感器材料的制备与表征，并展示了该成像仪在生物样品研究中的应用。

本文介绍了一种新型光致发光寿命成像仪，旨在对不同磷光样品中的分子氧（O2）浓度进行成像 mapping。

本方案通过专用探针和传感材料，对宏观物体（特别是活体动物组织和完整动物）中的磷光寿命和氧浓度进行详细的二维映射。该信息对多个研究领域具有重要意义。本方案采用集成化、紧凑型成像模块，以TCSPC模式运行，可对复杂生物样本（如活体组织）中的寿命和氧分布进行简便而准确的可视化。取下 Cricket 适配器并从不同侧面进行检查。拆下前端的 C 接口适配器，以显示 Cricket 内安装的 Photonis PP0360EF 增强器，然后重新装回 C 接口适配器。再次拆下 Cricket 前端的 C 接口适配器，并插入 650 ± 50 纳米的发射滤光片。通过重新安装C型接口来修复。然后，通过环形转接环将TPX三摄像头模块连接到Cricket模块的背面。再通过C型接口转接环将镜头连接到Cricket模块的正面。将LED连接至电源和脉冲发生器。现在，将390纳米超亮LED安装在固定于黑盒内面包板上的支架上。打开LED并进行聚焦，以确保对成像样品实现有效且均匀的激发。将相机组件安装在光学黑箱顶部，镜头朝下，对准用于成像样品的载物台。将相机和LED连接至两个脉冲发生器以及四通道示波器。通过调节示波器和脉冲发生器的设置，同步发送至相机和LED的脉冲信号。使用 Cricket 装置上的专用电缆和插座将增强器连接至标准电源，并将增益设置为 2.7 伏特。将样品置于相机镜头前方，然后打开相机及所有电子模块（增强器除外）。启动SOFI软件以调节操作参数，例如聚焦和样品对准。在模块中，将帧曝光时间设置为0.01秒。选择无限帧，并将像素操作模式设置为超阈值时间模式。然后，进入预览界面并选择活动模块，以打开 Medipix/Timepix 帧窗口。下一步，在开始记录后，调整颜色标尺并将图像旋转至所需方向。随后，关闭房间内的灯光并开启增强器。使用镜头和Cricket适配器的对焦功能，将相机光学系统对准样品台，以获得对比度和亮度良好的清晰样品图像。完成对焦后，关闭SOFI软件。然后进入终端，运行自行设计软件的命令，以二进制格式获取原始数据，随后关闭终端。打开一个新的终端以处理采集到的数据。加载数据文件并运行数据还原程序。使用用C语言编写的专用程序分析后处理数据，该程序将数据写入ICS图像文件中。随后，使用免费的Time Resolved Imaging软件打开ICS图像文件，并采用双指数函数拟合磷光衰减曲线。最后，使用可用的图像分析软件打开Fitted.ics图像文件。利用查找表生成磷光寿命图像，并以伪彩色标度进行编码。使用“测量”功能计算整个图像或感兴趣区域的平均寿命值。图中显示了铂八乙基卟啉染料传感器斑点在充氧和去氧状态下的磷光强度及磷光寿命成像显微图像。确保 Cricket 设备内安装了正确的发射滤光片，并使用了正确的 LED、电缆连接和脉冲设置。目前，该方案仅限于动物模型，但有望应用于诊断和治疗与组织缺氧相关的病理状态，例如癌症、中风和炎症。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用于生物医学应用的荧光寿命宏观成像仪

荧光寿命成像（FLIM）已成为一种关键技术，用于成像活细胞中特定蛋白质和染料的环境及其相互作用。利用荧光分子转子的FLIM可实现对活细胞内黏度的成像图谱绘制。...

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来源： Pigazzini, M. L., 等 衰老过程中淀粉样结构的表征 秀丽隐杆线虫 使用荧光寿命成像 J. Vis. Exp. (2020).本视频展示了如何利用荧光寿命成像显微技术（FLIM）评估秀丽隐杆线虫（C.

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表征 Riboglow 探针 体外 作为活体哺乳动物细胞及三维细胞模型中荧光寿命成像的基础

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生物微机电系统与细胞生物学：展望与应用

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