Name: 人小胶质细胞样细胞:使用人突触体从诱导多能干细胞和 体外 活细胞吞噬测定中分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习从诱导多能干细胞分化人小胶质细胞样细胞的方法，并使用人突触体进行体外活细胞吞噬测定。该方案为研究神经炎症和神经退行性疾病提供了可靠的人源细胞模型。

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作者感谢 Michael Ward 提供用于运动神经元分化的 WTC11 hNIL 诱导多能干细胞系，以及 Jackson 实验室提供用于小胶质细胞分化的 KOLF2.1J WT 克隆 B03 诱导多能干细胞系。我们还感谢 Dorothy Schafer 在方案实施过程中给予的支持，Anthony Giampetruzzi 和 John Landers 在活细胞成像系统方面提供的帮助，Hayden Gadd 在修订期间的技术贡献，以及 Jonathan Jung 在本研究中的合作。本工作由马萨诸塞大学陈医学院的 Dan 和 Diane Riccio 神经科学基金以及 Angel 基金会资助。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述的分化方案可在约6至8周内高效地获得高纯度、足够产量的诱导多能干细胞来源的类小胶质细胞，适用于进行免疫荧光实验及其他需要较大量细胞的检测。该方案在1周内最多可获得1 × 106个iMGs，足以进行蛋白质和RNA提取以及相应的下游分析（如RNA测序、定量逆转录PCR、蛋白质印迹、质谱分析）。然而，该方案的一个局限性在于iMGs的产量可能限制某些应用。可通过额外改进方法，收集不同周数的PMPs，并在悬浮培养中维持均一细胞群体，直至积累足够数量的前体细胞后一次性进行后续分化过程18。或者，也可通过使用更大表面积的细胞培养板扩大类胚体（EBs）的培养规模，以增加PMPs的产量。
建议使用在层粘连蛋白521包被的培养板中培养的iPSCs来启动分化过程。其他包被试剂可能会减少后续过程中PMPs的产量18。同样，在PMP生成期间对培养板进行包被以促进EB黏附，可增强EB的贴附能力，从而延长培养物的存活时间。EB培养最长可维持达4个月，此时多个EB会脱落并死亡。然而，其他研...

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在CNS发育过程中发挥着关键作用。在成年大脑中，小胶质细胞对于维持内环境稳定以及积极应对创伤和疾病过程也至关重要。累积的证据表明，小胶质细胞在多种神经发育性和神经退行性疾病的发生机制中起着核心作用1,2。尽管目前关于小胶质细胞生物学的知识主要来源于小鼠模型，但最近的研究揭示了小鼠与人类小胶质细胞之间存在重要差异，凸显了开发新技术以研究人类小胶质细胞遗传学和生物学功能的必要性3,4。从小块原代组织中分离小胶质细胞可能会显著改变其特性5，从而可能干扰使用此类细胞所获得的实验结果。本方法的总体目标是将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为诱导性小胶质样细胞（iMGs），从而建立一种细胞培养系统，用于在基础条件下研究人类小胶质细胞。此外，本文还包含一种基于完全人源化模型系统的吞噬功能检测方法，可用于评估iMGs的功能性，既作为质量控制手段，也可用于研究疾病背景下iMGs的功能障碍。
近年来，文献中出现了多种从诱导多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞的实验方案6,7,8,9,10。部分方案可能存在的缺点包括分化周期较长、需要添加多种生长因子和/或实验步骤复杂6,9,10。本文展示了一种“用户友好型”分化方法，该方法通过将iPSCs分化为称为原始巨噬细胞前体细胞（PMPs）的前体细胞，模拟了小胶质细胞发育过程中的某些特征7,11。PMPs的生成方法基于先前报道的方案，并进行了部分优化12。PMPs模拟了不依赖MYB的卵黄囊来源巨噬细胞，这类巨噬细胞在胚胎发育过程中于血脑屏障闭合前侵入大脑，进而发育为小胶质细胞13。为了将PMPs终末分化为诱导小胶质细胞（iMGs），我们采用了一种快速且简化的单细胞培养方法，该方法基于Haenseler等和Brownjohn等的方案，并进行了若干改进，从而建立了一种高效的小胶质细胞分化方法，使iMGs能够稳定表达小胶质细胞富集标志物7,8。该分化方法可在具备iPSC培养经验、并致力于利用人类模型系统研究小胶质细胞生物学的实验室中重复实现。
由诱导多能干细胞分化而来的小胶质细胞是研究人类小胶质细胞的一种具有生物学相关性的来源 体外 实验是研究小胶质细胞经典功能（包括吞噬作用）的重要工具。小胶质细胞是大脑和中枢神经系统中的专职吞噬细胞，负责清除细胞碎片、聚集的蛋白质以及降解的髓鞘14小胶质细胞还通过吞噬突触参与突触重塑，并通过吞噬病原体在抵御外来感染中发挥防御作用。15,16在此方案中，使用人源突触体作为iMG吞噬的材料，以评估iMG的吞噬功能。为此，本文描述了从人源i3LMNs 的描述如下。i3由LMN提取的人类突触体经pH敏感性染料标记，可用于定量分析在吞噬体加工与降解过程中定位于酸性区室的突触体 体外采用活细胞显微镜进行吞噬作用检测，以实时监测小胶质细胞吞噬过程的动态变化。该功能检测方法为在完整的人源系统中研究健康与疾病状态下小胶质细胞吞噬功能可能存在的缺陷奠定了基础。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;免疫荧光分析用抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗IBA1抗体</td><td>和光纯药美国公司</td><td>NC9288364</td><td>1:350 稀释度</td></tr><tr><td>兔抗P2RY12抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA014518</td><td>1:50 稀释度</td></tr><tr><td>兔抗TMEM119抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td><td>1:100 稀释度</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于蛋白质印迹分析的抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-微管蛋白兔抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td>1:500 稀释度</td></tr><tr><td>抗突触素（SYP）兔抗体</td><td>Abclonal</td><td>A6344</td><td>1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>抗PSD95小鼠抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB1596</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;硼酸盐缓冲液组分&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼酸（100 mM）</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;生物Xtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（75 mM）</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;S7653</td><td></td></tr><tr><td>四硼酸钠（25 mM）</td><td>Sigma</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞滤筛</td><td>&amp;nbsp;Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 20 mm 组织培养处理皿</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀，双头，平刃 &amp;& 窄刃，无菌</td><td>CELLTREAT</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>低吸附圆底96孔板</td><td>康宁</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 24孔平底表面修饰多孔细胞培养板</td><td>康宁</td><td>353847,</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 6孔细胞培养板，平底，表面修饰</td><td>康宁</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 96孔透明平底微孔板</td><td>康宁</td><td>353872</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞解离试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>&amp;nbsp;康宁</td><td>25058CI</td><td>用于下运动神经元分化的解离试剂</td></tr><tr><td>TrypLE 试剂</td><td>Life Technologies</td><td>12-605-010</td><td>用于小胶质细胞分化的解离试剂</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养用包被试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR 基底膜基质</td><td>康宁&amp;trade;</td><td>354230</td><td>称为细胞外基质包被试剂</td></tr><tr><td>CellAdhere 层粘连蛋白-521</td><td>STEMCELL 技术</td><td>77004</td><td>称为层粘连蛋白521</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P7405</td><td>用硼酸盐缓冲液重悬至 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;P3655</td><td>用硼酸盐缓冲液重悬至 1 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组成部分 &lt;em&gt;iPSC 培养基&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;mTeSR Plus 试剂盒</td><td>STEMCELL 技术</td><td>100-0276</td><td>准备 &lt;em&gt;iPSC 培养基 &lt;/em&gt;将各组分混合至1x</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组成部分 &lt;em&gt;EB培养基&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td>PHC9534</td><td>终浓度 50 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;iPSC 培养基&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>终浓度 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>终浓度 20 ng/mL</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>PeproTech</td><td>100-20A</td><td>终浓度 50 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组成部分 &lt;em&gt;PMP 基础培养基&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>终浓度 100 U/mL</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>12001-988</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组成部分 &lt;em&gt;PMP 完全培养基&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>终浓度 55 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>终浓度 25 ng/mL</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>终浓度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;PMP 基础培养基&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组成部分 &lt;em&gt;iMG 基础培养基&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>N2 补充剂，100 倍</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>终浓度 100 U/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组成部分 &lt;em&gt;iMG 完全培养基&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>终浓度 55 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech 或 Biologend</td><td>200-34 或 577904</td><td>终浓度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;iMG 基础培养基&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>终浓度 5 ng/mL</td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>终浓度 50 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;诱导基础培养基的组分&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 HEPES 的 DMEM/F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>N2 补充剂，100 倍</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA），100倍</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;完全诱导培养基的组分&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>化合物 E</td><td>Calbiochem</td><td>565790</td><td>终浓度 0.2 &amp;mu;M，并用1:1的乙醇和DMSO将储备试剂重悬至2 mM</td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>终浓度 2 &amp;mu;g/mL，并用DPBS将储备试剂重悬至2 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;诱导基础培养基&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>终浓度 10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;神经元培养基的成分&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus 神经元培养系统</td><td>Gibco</td><td>A3653401</td><td>培养基和添加剂的终浓度为1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>N2 补充剂，100 倍</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA），100 倍</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;本研究中使用的人诱导多能干细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLF2.1J：野生型克隆 B03</td><td>杰克逊实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WTC11 hNIL</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;突触体分离试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Syn-PER 突触蛋白提取试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>87793</td><td>用于分离突触体的细胞裂解试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;吞噬作用检测染料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Ready 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;R37605</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo 红色，琥珀酰亚胺酯</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;P36600</td><td>被称为pH敏感性染料</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他细胞培养试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>AMRESCO 公司</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td>用无菌水重悬至 40 mM</td></tr><tr><td>细胞松弛素D</td><td>Sigma</td><td></td><td>终浓度 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>含钙和镁的DPBS</td><td>康宁</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的DPBS</td><td>康宁</td><td>21-031-CV</td><td>称为 DPBS</td></tr><tr><td>KnockOut&amp;nbsp; DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>DMEM-F12，适用于人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞生长的优化培养基</td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白，天然</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td>称为层粘连蛋白</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件与设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 活细胞成像仪</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 微孔板读板仪与成像软件</td><td>Biotek</td><td>版本 3.03</td><td></td></tr><tr><td>多温加热振荡</td><td>基准测试</td><td></td><td>参照为试管振荡器</td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>埃尔玛</td><td>Mode Transsonic 310</td><td></td></tr></tbody></table>

人源小胶质样细胞：由诱导性多能干细胞分化而来及 体外 使用人突触体的活细胞吞噬作用检测

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

小胶质细胞是起源于髓系的常驻免疫细胞，负责维持脑内微环境的稳态，并在多种神经系统疾病中发挥关键作用。研究健康和疾病状态下的人类小胶质细胞面临巨大挑战，主要由于人类细胞来源极为有限。来源于个体的诱导性多能干细胞（iPSCs）可被用于突破这一限制。本文展示了如何将人类iPSCs分化为类小胶质细胞（iMGs），以用于 体外 实验。这些诱导型小胶质细胞（iMGs）表现出小胶质细胞预期的生理特性，包括典型的小胶质细胞样形态、特异性标志物的表达以及活跃的吞噬作用。此外，还提供了从人诱导多能干细胞（iPSC）来源的下运动神经元衍生的突触体底物的分离与标记的操作说明。3提供了一种运动神经元（LMNs）的培养方法。采用活细胞纵向成像检测技术，通过监测被pH敏感性染料标记的人源突触体的吞噬过程，以研究小胶质细胞（iMG）的吞噬能力。本文所述方案可广泛应用于研究人源小胶质细胞生物学及其在疾病中作用的多个领域。

采用本方案生成诱导性小胶质细胞（iMGs）时，必须从具有紧凑集落形态且边界清晰的未分化iPSCs开始（图2A）。如拟胚体（EB）形成部分所述方式维持的解离后iPSCs将形成球形聚集体，即拟胚体（EBs），其体积将持续增大至分化第4天（图2B）。一旦收集EBs并接种于生成原髓系前体细胞（PMP）的适当条件下，它们将贴附于基质胶（Matrigel）包被的培养板上，并有一层细胞延展并包裹球形聚集体（图2C）。不健康的EBs会从培养板上脱落，应予以清除。在PMP生成的第14至21天期间，可能出现多种潜在的不同细胞类型，它们将悬浮于培养基中；这些细胞应在换液过程中丢弃12。至第28天，将出现悬浮的圆形细胞，其胞质与细胞核比例较大（图2D），称为PMPs。这些细胞可持续产生，并可在换液时每周收集一次，持续长达3个月。每周收获的PMP数量因iPSC细胞系及培养时间而异...

本方案描述了将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞样细胞的过程 体外 实验。我们还包含了一种详细的制备方法，用于从诱导多能干细胞衍生的下运动神经元中生成人突触体，该突触体可作为底物用于 体外 使用活细胞成像系统的吞噬作用检测

小胶质细胞是起源于髓系的常驻免疫细胞，可维持脑内微环境的稳态，并已成为多种……中的关键参与者

由iPS细胞衍生的小胶质细胞为体外实验提供了具有生物学相关性的人源小胶质细胞来源，是研究健康与疾病状态下小胶质细胞生物学的重要工具。本文介绍了一种简便的小胶质细胞分化方案，该方案对生长因子的需求极少，且可实现高纯度和高产量。此外，我们还展示了一种完全人源化的吞噬功能检测方法。iPSC 分化而来的类似小胶质细胞对培养基蒸发非常敏感。应避免使用细胞培养板角落的孔，并在所有空孔中加入水以提高细胞存活率。当诱导多能干细胞（iPSCs）达到 80% 汇合度时，用一毫升 DPBS 洗涤，然后加入一毫升解离试剂，在 37 摄氏度下作用两分钟，使细胞集落解离。使用细胞刮刀反复刮取，使细胞团块脱落，形成单细胞悬液。收集该悬液并转移至含有9毫升DPBS的15毫升锥形离心管中。随后以500 × g离心1分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1毫升拟胚体（EB）培养基中。取 10 微升细胞，用台盼蓝按 1:2 比例稀释。在血细胞计数板上计数细胞，并根据细胞浓度将细胞储备液稀释至最终浓度为每 100 微升含 10,000 个细胞。接种细胞时，将 100 微升稀释后的细胞悬液加入低吸附圆底 96 孔板的每个孔中。将培养板在125 × g条件下离心3分钟，并在37°C和5%二氧化碳环境中孵育4天。第2天，使用多通道移液器将旧的半量EB培养基更换为新鲜培养基。为生成原始巨噬细胞前体（PMPs），在六孔板的各孔中加入1毫升冰冻的Matrigel包被溶液，进行包被处理。然后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育两小时，或过夜孵育。在拟胚体（EB）分化的第四天，使用1毫升移液器吸头将EB转移至基质胶（Matrigel）包被的孔中。反复吹打以使EB从孔壁脱离。然后将培养板倾斜放置，使拟胚体（EBs）沉降到孔的边缘。待所有拟胚体沉降后，轻柔地用移液器吸除旧培养基，并加入3毫升 freshly prepared PMP完全培养基，替换时保持拟胚体位于孔的边缘。通过手动左右及前后轻轻晃动培养板，使孔内的细胞均匀分布。然后将培养板孵育七天，以使胚胎小体（EBs）贴附到孔底部。七天后，在4倍放大倍数的明场显微镜下检查EBs，确认其已贴附至孔底。进行半量换液，并在第21天将完全培养基更换为3毫升PMP完全培养基。第28天，在上清液中观察呈圆形的细胞，即所谓的PMPs。然后使用10毫升移液器和自动移液器收集含有PMPs的培养基，注意不要扰动拟胚体（EBs）。将含有PMPs的培养基转移至15毫升锥形管中。将收集的PMPs在200 × g离心4分钟，吸除上清液，然后用一至二毫升小胶质细胞样细胞或IMG基础培养基重悬。随后按照之前所述方法在血细胞计数板上进行细胞计数。将剩余细胞离心，将PMPs稀释至所需浓度。然后，使用新配制的IMG完全培养基，将细胞以每平方厘米10的5次方个细胞的密度接种于经细胞培养处理的培养板中。进行活细胞吞噬实验时，将20至30乘以10的4次方个PMPs接种至96孔板中，每孔加入100微升IMG完全培养基，并按照上述方法进行为期10天的分化。实验当天，每孔移除40微升培养基，然后加入10微升细胞核染色液。将培养板孵育两小时。将标记的突触体置于冰上解冻，并使用水浴超声仪轻轻超声处理一分钟。再次立即将突触体放回冰上。将标记的突触体以每50微升完全IMG培养基加入1微升突触体的比例稀释。作为阴性对照，用完全IMG培养基配制60微摩尔的细胞松弛素D，以抑制肌动蛋白聚合，从而抑制吞噬作用。然后每孔加入10微升该溶液，使终浓度为10微摩尔，并孵育30分钟。将培养板从培养箱中取出，在 10 摄氏度下孵育 10 分钟。将培养板保持在冰上，加入含有突触体的 50 微升培养基。在 10 摄氏度下以 270 × g 离心 3 分钟，之后将培养板保持在冰上直至进行成像采集。将培养板放入活细胞成像仪中，并选择需要分析的孔。然后选择20倍物镜。接下来，调节明场和蓝色通道的焦距、发光二极管（LED）强度、积分时间以及增益。在初始时间点，突触体荧光信号应可忽略不计。选择每孔采集的单个图块数量以进行拼接成像。在孔的中心区域采集 16 个图块，成像面积约占孔总面积的 5%。将温度设置为 37 摄氏度，并设定所需的成像时间间隔。接下来，打开分析软件。然后打开包含图像的实验，点击数据缩减图标。在菜单中，选择“图像处理”下的“图像拼接”，根据文本稿件中描述的参数，将拼接图中四乘四的各个独立图像块合并成一幅完整图像。使用这些图像的 DAPI 和 RFP 通道定义强度阈值。打开图像后，点击“分析”。在“分析”中选择“细胞分析”，在“检测通道”中选择 DAPI 或 RFP 通道中的拼接图像。接下来，进入“主掩膜和计数”选项卡，设置合适的阈值和对象大小值，以准确选取 DAPI 通道中的细胞核或 RFP 通道中的突触体信号。要统计细胞核数量，请进入“数据缩减”菜单，在“图像分析”下选择“细胞分析”。再次进入“Primary Mask and Count”选项卡，在“Channel”下选择DAPI拼接图像，并使用文本稿件中描述的参数。接着，转到“Calculated Metrics”选项卡，选择“Cell Count”。然后，为获得突触体信号的面积，进入“Data Reduction”菜单，在“Analysis”下选择“Cellular Analysis”。再次转到“主掩膜和计数”选项卡，在“通道”下选择RFP拼接图像，并使用文本稿件中详述的参数。接着，进入“计算指标”选项卡，选择“对象总面积”。在“数据约简”选项卡中，点击“确定”，以允许软件分析所有获取的图像。图像分析完成后，导出每个时间点的“物体总面积”（Object Sum Area）和“细胞计数”（Cell Count）值。然后将物体总面积除以细胞计数，计算每个时间点的归一化面积。若需比较多种处理条件或不同基因型，请使用给定公式计算吞噬指数。未分化的iPSCs呈现紧凑的集落形态，边缘清晰。解离后的iPSCs形成称为拟胚体（EBs）的球形聚集体，并在分化至第4天时逐渐增大。当将EBs接种用于PMP生成时，它们会附着于Matrigel包被的培养板上，一层细胞随之铺展并包围球形聚集体。第28天，悬浮液中出现细胞质与细胞核比例较大的圆形细胞。强烈建议将iPSCs培养在Laminin 521包被的培养板上，而非Matrigel上，因为Laminin 521包被的培养板可获得更高的PMP产量。PMP暴露于IMG培养基后，细胞呈现出类似小胶质细胞的形态，胞质较小，并伴有细长的突起。此外，通过免疫荧光染色验证了小胶质细胞的身份。通常，超过95%的细胞表达IB1，约90%的细胞表达P2RY12和TMEM119。Western blot分析证实，来源于人诱导性多能干细胞的下运动神经元用于制备人突触体时表达了突触标志物突触素（synaptophysin）和突触后密度蛋白95（postsynaptic density protein 95）。与初始时间点相比，在对照组中，10小时时红色荧光信号显著增强，因为大多数突触体已被吞噬，并定位于酸性细胞内区室。在细胞松弛素D处理的IMGs中，0小时和10小时的红色信号均明显减弱，表明所检测到的信号来源于吞噬事件。被吞噬的突触体面积随时间延长而增加，直至16小时。然而，经细胞松弛素D处理的细胞的红色信号区域并未随时间增加。由iPS细胞诱导的类似小胶质细胞可用于多种应用，包括吞噬作用以及神经发育和神经退行性疾病研究中的炎症反应。

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将人诱导性多能干细胞分化为类似小胶质细胞

来源：Funes, S., 等.，人类小胶质样细胞：由诱导性多能干细胞分化及利用人突触体的体外活细胞吞噬实验。视频实验杂志...

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衍生含小胶质细胞发育的人脑类器官

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