人小胶质细胞样细胞:使用人突触体从诱导多能干细胞和 体外 活细胞吞噬测定中分化

该协议描述了人诱导多能干细胞（iPSC）成小胶质细胞样细胞进行 体外 实验的分化过程。我们还包括从iPSC衍生的下运动神经元生成人突触体的详细程序，该神经元可用作使用活细胞成像系统进行 体外 吞噬测定的底物。

iPS衍生的小胶质细胞是用于体外实验的人类小胶质细胞的生物学相关来源，是研究健康和疾病中小胶质细胞生物学的重要工具。我们提出了一个简单的小胶质细胞分化方案，该方案需要最少的生长因子使用，并实现高纯度和产量。此外，我们还展示了一种完全人源化的吞噬测定。

iPSC衍生的小胶质细胞样细胞对培养基蒸发非常敏感。应避免使用细胞培养板角落的孔，并用水填充所有空孔以提高存活率。一旦诱导多能干细胞（iPSCs）达到80%汇合度，通过用一毫升DPBS洗涤并在37摄氏度下加入一毫升解离试剂两分钟来解离菌落。

使用细胞提升器通过多次刮擦以产生单细胞悬液来去除菌落。收集悬浮液，并将它们转移到含有9毫升DPBS的15毫升锥形管中。然后将细胞以500倍g离心一分钟，除去上清液，并重悬于一毫升Embryoid体或EB培养基中。

取10微升细胞，用台盼蓝稀释一到两个。在血细胞计数器上计数细胞，并根据细胞计数，将细胞原液稀释至每100微升10， 000个细胞的最终稀释度。对于电镀细胞，每孔将 100 微升稀释的细胞加入低粘附性圆底 96 孔板中。

将板以125倍g离心三分钟，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育四天。第二天，使用多通道移液器，用新鲜培养基替换旧的半EB培养基。要生成原始巨噬细胞前体或PMP，请通过添加一毫升冰冷的基质胶包衣溶液来涂覆六孔板的孔。

然后将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育两小时，或过夜。在EB分化的第四天，使用一毫升移液器吸头将EB转移到Matrigel包被的孔中。上下移液以将EB从井中取出。

然后保持板倾斜，使EB在井的边缘沉降。一旦所有EB都稳定下来，轻轻移液并更换旧培养基，同时用三毫升新鲜制备的PMP完全培养基将EB保持在孔的边缘。通过手动将板左右和从后到前洗牌，将细胞均匀分布在孔中。

然后将板孵育七天，以使EB附着在孔底。七天后，在四倍放大镜的光场显微镜下检查EB，以确保它们附着在孔的底部。进行半培养基更换，并在第21天，用三毫升PMP完全培养基替换完全培养基。

在第28天，在上清液中寻找称为PMP的圆形细胞。然后使用10毫升移液器和自动移液器收集含有PMP的培养基，而不会干扰EB。将培养基中的PMP转移到15毫升锥形管中。

将收集的PMP以200倍g离心四分钟并吸出上清液，然后将其重新悬浮在一至两毫升小胶质细胞样细胞或IMG基础培养基中。然后如前所述计数血细胞计数器上的细胞。离心其余细胞，并将PMP稀释至所需浓度。

然后使用新鲜制备的IMG完全培养基将细胞以每平方厘米10至5个细胞的密度接种在细胞培养处理的平板上。对于活细胞吞噬测定，将20至30乘以10至第四个PMP板放入96孔板和100微升IMG完全培养基中，并遵循分化过程10天。在测定当天，每孔除去40微升培养基，并加入10微升核染色溶液。

将板孵育两个小时。在冰上解冻标记的突触体，并使用水超声仪轻轻超声处理一分钟。同样，立即将突触体放在冰上。

在IMG完全培养基中以每50微升培养基一微升突触体稀释标记的突触体。对于阴性对照，在IMG完全培养基中制备60微摩尔的细胞松弛素D以抑制肌动蛋白聚合，从而抑制吞噬作用。然后向每个孔中加入10微升该溶液，终浓度为10微摩尔，并孵育30分钟。

从培养箱中取出板，并在 10 摄氏度下孵育 10 分钟。将板保持在冰上，并加入50微升含有突触体的培养基。将板以270倍g在10摄氏度下离心三分钟，并将板保持在冰上直到成像采集。

将板插入活细胞成像读数器，然后选择要分析的孔。然后选择20倍物镜。接下来，调整焦点、发光二极管或 LED、强度、积分时间以及明场和蓝色通道的增益。

突触体荧光在初始时间点应可忽略不计。选择每个孔要在蒙太奇中获取的单个瓷砖的数量。在井中心采集16块瓷砖，成像约5%的总井面积。

将温度设置为 37 摄氏度，并设置所需的成像时间间隔。接下来，打开分析软件。然后打开包含图像的实验，然后单击"数据缩减"图标。

在菜单中，选择"成像处理"下的"成像拼接"，使用文本手稿中描述的参数从蒙太奇中的四乘四个单独的拼贴创建完整的图像。使用这些图像的 DAPI 和 RFP 通道定义强度阈值。打开图像，然后单击"分析"。

在"分析"下，选择"蜂窝分析"，然后在"检测通道"下，在 DAPI 或 RFP 通道中选取拼接图像。接下来，转到"主掩码和计数"选项卡，并建立一个阈值和对象大小值，以正确选择 DAPI 通道中的细胞核或 RFP 通道中的突触体信号。要计算细胞核的数量，请转到"数据缩减"菜单，然后在"图像分析"下选择"细胞分析"。

再次转到"主掩码和计数"选项卡，在"通道"下，选择 DAPI 拼接图像，然后使用文本手稿中描述的参数。接下来，转到"计算指标"选项卡，然后选择"单元格计数"。然后，要获取突触体信号的区域，请转到"数据缩减"菜单，然后在"分析"下选择"细胞分析"。

再次，转到"主掩码和计数"选项卡，然后在"通道"下选择"RFP 拼接图像"，然后使用文本手稿中详述的参数。接下来，转到计算指标选项卡，然后选择对象总和面积。在"数据缩减"选项卡中，单击"确定"以允许软件分析所有采集的图像。

分析图像后，导出每个时间点的对象总和面积和单元格计数值。然后将对象总和面积除以单元格计数以计算每个时间点的归一化面积。如果比较多种治疗或基因型，请使用给定的方程计算吞噬指数。

未分化的iPSCs显示出紧凑的集落形态，边缘清晰。解离的iPSC形成称为EB的球形聚集体，并在分化的第四天之前逐渐增大。当EB被铺板以产生PMP时，它们附着在基质胶涂层的板上，并且一层细胞扩散并围绕球形聚集体。

在第28天，悬浮液中出现具有大细胞质与细胞核比的圆形细胞。强烈建议在层粘连蛋白521包被的平板中培养iPSC而不是基质胶，因为层粘连蛋白521包被的板中的PMP产量更高。在PMP暴露于IMG培养基后，细胞在细长过程的存在下获得具有小细胞质的小胶质细胞样形态。

此外，通过免疫荧光染色验证小胶质细胞的身份。通常，超过95%的细胞表达IB1，约90%的细胞表达P2RY12和TMEM119。蛋白质印迹分析证实，iPSC衍生了人突触体表达的突触标志物、突触素和突触后密度蛋白95的下运动神经元。

与初始时间点相比，到10小时时，红色荧光信号很强烈，因为大多数突触体已被吞噬，并定位于酸性细胞内区室。在细胞松弛素D处理的IMG中，红色信号的强烈减少持续0小时和10小时表明检测到的信号是由吞噬事件引起的。吞噬突触体的面积随着时间的推移而增加，直到16小时。

然而，来自细胞松弛素D处理细胞的红色信号面积不随时间增加。iPS衍生的小胶质细胞样细胞可用于各种应用，包括吞噬作用和神经发育和神经退行性疾病研究中的炎症反应。