人源小胶质样细胞：由诱导性多能干细胞分化而来及 体外 使用人突触体的活细胞吞噬作用检测

由iPS细胞衍生的小胶质细胞为体外实验提供了具有生物学相关性的人源小胶质细胞来源，是研究健康与疾病状态下小胶质细胞生物学的重要工具。本文介绍了一种简便的小胶质细胞分化方案，该方案对生长因子的需求极少，且可实现高纯度和高产量。此外，我们还展示了一种完全人源化的吞噬功能检测方法。

iPSC 分化而来的类似小胶质细胞对培养基蒸发非常敏感。应避免使用细胞培养板角落的孔，并在所有空孔中加入水以提高细胞存活率。当诱导多能干细胞（iPSCs）达到 80% 汇合度时，用一毫升 DPBS 洗涤，然后加入一毫升解离试剂，在 37 摄氏度下作用两分钟，使细胞集落解离。

使用细胞刮刀反复刮取，使细胞团块脱落，形成单细胞悬液。收集该悬液并转移至含有9毫升DPBS的15毫升锥形离心管中。随后以500 × g离心1分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1毫升拟胚体（EB）培养基中。

取 10 微升细胞，用台盼蓝按 1:2 比例稀释。在血细胞计数板上计数细胞，并根据细胞浓度将细胞储备液稀释至最终浓度为每 100 微升含 10,000 个细胞。接种细胞时，将 100 微升稀释后的细胞悬液加入低吸附圆底 96 孔板的每个孔中。

将培养板在125 × g条件下离心3分钟，并在37°C和5%二氧化碳环境中孵育4天。第2天，使用多通道移液器将旧的半量EB培养基更换为新鲜培养基。为生成原始巨噬细胞前体（PMPs），在六孔板的各孔中加入1毫升冰冻的Matrigel包被溶液，进行包被处理。

然后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育两小时，或过夜孵育。在拟胚体（EB）分化的第四天，使用1毫升移液器吸头将EB转移至基质胶（Matrigel）包被的孔中。反复吹打以使EB从孔壁脱离。

然后将培养板倾斜放置，使拟胚体（EBs）沉降到孔的边缘。待所有拟胚体沉降后，轻柔地用移液器吸除旧培养基，并加入3毫升 freshly prepared PMP完全培养基，替换时保持拟胚体位于孔的边缘。通过手动左右及前后轻轻晃动培养板，使孔内的细胞均匀分布。

然后将培养板孵育七天，以使胚胎小体（EBs）贴附到孔底部。七天后，在4倍放大倍数的明场显微镜下检查EBs，确认其已贴附至孔底。进行半量换液，并在第21天将完全培养基更换为3毫升PMP完全培养基。

第28天，在上清液中观察呈圆形的细胞，即所谓的PMPs。然后使用10毫升移液器和自动移液器收集含有PMPs的培养基，注意不要扰动拟胚体（EBs）。将含有PMPs的培养基转移至15毫升锥形管中。

将收集的PMPs在200 × g离心4分钟，吸除上清液，然后用一至二毫升小胶质细胞样细胞或IMG基础培养基重悬。随后按照之前所述方法在血细胞计数板上进行细胞计数。将剩余细胞离心，将PMPs稀释至所需浓度。

然后，使用新配制的IMG完全培养基，将细胞以每平方厘米10的5次方个细胞的密度接种于经细胞培养处理的培养板中。进行活细胞吞噬实验时，将20至30乘以10的4次方个PMPs接种至96孔板中，每孔加入100微升IMG完全培养基，并按照上述方法进行为期10天的分化。实验当天，每孔移除40微升培养基，然后加入10微升细胞核染色液。

将培养板孵育两小时。将标记的突触体置于冰上解冻，并使用水浴超声仪轻轻超声处理一分钟。再次立即将突触体放回冰上。

将标记的突触体以每50微升完全IMG培养基加入1微升突触体的比例稀释。作为阴性对照，用完全IMG培养基配制60微摩尔的细胞松弛素D，以抑制肌动蛋白聚合，从而抑制吞噬作用。然后每孔加入10微升该溶液，使终浓度为10微摩尔，并孵育30分钟。

将培养板从培养箱中取出，在 10 摄氏度下孵育 10 分钟。将培养板保持在冰上，加入含有突触体的 50 微升培养基。在 10 摄氏度下以 270 × g 离心 3 分钟，之后将培养板保持在冰上直至进行成像采集。

将培养板放入活细胞成像仪中，并选择需要分析的孔。然后选择20倍物镜。接下来，调节明场和蓝色通道的焦距、发光二极管（LED）强度、积分时间以及增益。

在初始时间点，突触体荧光信号应可忽略不计。选择每孔采集的单个图块数量以进行拼接成像。在孔的中心区域采集 16 个图块，成像面积约占孔总面积的 5%。

将温度设置为 37 摄氏度，并设定所需的成像时间间隔。接下来，打开分析软件。然后打开包含图像的实验，点击数据缩减图标。

在菜单中，选择“图像处理”下的“图像拼接”，根据文本稿件中描述的参数，将拼接图中四乘四的各个独立图像块合并成一幅完整图像。使用这些图像的 DAPI 和 RFP 通道定义强度阈值。打开图像后，点击“分析”。

在“分析”中选择“细胞分析”，在“检测通道”中选择 DAPI 或 RFP 通道中的拼接图像。接下来，进入“主掩膜和计数”选项卡，设置合适的阈值和对象大小值，以准确选取 DAPI 通道中的细胞核或 RFP 通道中的突触体信号。要统计细胞核数量，请进入“数据缩减”菜单，在“图像分析”下选择“细胞分析”。

再次进入“Primary Mask and Count”选项卡，在“Channel”下选择DAPI拼接图像，并使用文本稿件中描述的参数。接着，转到“Calculated Metrics”选项卡，选择“Cell Count”。然后，为获得突触体信号的面积，进入“Data Reduction”菜单，在“Analysis”下选择“Cellular Analysis”。

再次转到“主掩膜和计数”选项卡，在“通道”下选择RFP拼接图像，并使用文本稿件中详述的参数。接着，进入“计算指标”选项卡，选择“对象总面积”。在“数据约简”选项卡中，点击“确定”，以允许软件分析所有获取的图像。

图像分析完成后，导出每个时间点的“物体总面积”（Object Sum Area）和“细胞计数”（Cell Count）值。然后将物体总面积除以细胞计数，计算每个时间点的归一化面积。若需比较多种处理条件或不同基因型，请使用给定公式计算吞噬指数。

未分化的iPSCs呈现紧凑的集落形态，边缘清晰。解离后的iPSCs形成称为拟胚体（EBs）的球形聚集体，并在分化至第4天时逐渐增大。当将EBs接种用于PMP生成时，它们会附着于Matrigel包被的培养板上，一层细胞随之铺展并包围球形聚集体。

第28天，悬浮液中出现细胞质与细胞核比例较大的圆形细胞。强烈建议将iPSCs培养在Laminin 521包被的培养板上，而非Matrigel上，因为Laminin 521包被的培养板可获得更高的PMP产量。PMP暴露于IMG培养基后，细胞呈现出类似小胶质细胞的形态，胞质较小，并伴有细长的突起。

此外，通过免疫荧光染色验证了小胶质细胞的身份。通常，超过95%的细胞表达IB1，约90%的细胞表达P2RY12和TMEM119。Western blot分析证实，来源于人诱导性多能干细胞的下运动神经元用于制备人突触体时表达了突触标志物突触素（synaptophysin）和突触后密度蛋白95（postsynaptic density protein 95）。

与初始时间点相比，在对照组中，10小时时红色荧光信号显著增强，因为大多数突触体已被吞噬，并定位于酸性细胞内区室。在细胞松弛素D处理的IMGs中，0小时和10小时的红色信号均明显减弱，表明所检测到的信号来源于吞噬事件。被吞噬的突触体面积随时间延长而增加，直至16小时。

然而，经细胞松弛素D处理的细胞的红色信号区域并未随时间增加。由iPS细胞诱导的类似小胶质细胞可用于多种应用，包括吞噬作用以及神经发育和神经退行性疾病研究中的炎症反应。