接触性超敏反应作为过敏性接触性皮炎的小鼠模型

本文介绍了一种客观的实验室方法，可用于研究小鼠的接触性超敏反应，该反应模拟了人类的变应性接触性皮炎。接触性超敏反应不仅可通过耳部水肿进行测量，还可通过多种实验室检测手段来研究参与该反应的细胞机制。这一更为贴近实际的接触性超敏模型可用于测试各种环境因素和新物质，以判断待测因素是否能够调节T细胞依赖性免疫反应，从而为开发新的治疗方法提供依据。

首先用剃刀剃除小鼠皮肤的毛发，并标记足部。在诱导接触性超敏反应（CHS）前6小时，用水和灰色肥皂清洗，并剃除小鼠胸部和腹部一个2平方厘米的区域。同一天，通过在先前剃除的区域涂抹150微升 freshly prepared 5%半抗原对小鼠进行致敏。

在对照小鼠中，仅使用溶剂处理。将动物放回笼中前，使半抗原斑点干燥30秒。第4天，由不了解实验分组的观察者在0小时使用千分尺测量麻醉小鼠的耳厚度。

然后，在试验组和对照组小鼠双耳两侧各涂抹 10 微升 freshly prepared 0.4% hapten，并使其干燥 30 秒。第 5 天，在上次涂抹 0.4% hapten 24 小时后，重复测量耳厚度以获取 24 小时时间点的数据。耳厚度测量后 24 小时，在小鼠仍处于深度麻醉状态下，使用剪刀尽可能贴近颅骨将耳朵剪下。

在耳部远端，使用皮肤活检打孔器制作一个直径六毫米的穿孔。用分析天平称量每份耳部活检组织的重量，并以毫克表示。进行髓过氧化物酶（MPO）检测时，将耳部活检组织放入含有不锈钢珠的2毫升微量离心管中，并加入500微升预配制的缓冲液。

将活检组织在匀浆器中匀浆10分钟，然后在4摄氏度下冷却样品15分钟，再进行第二次10分钟的匀浆。活检组织匀浆完成后取出珠子。将匀浆液在-20摄氏度下冷冻30分钟。

解冻样品并涡旋混匀，重复匀浆和冻融步骤三次。完成后，在4摄氏度条件下以3,000 G离心30分钟。用移液器收集上清液，用于测定MPO活性，并以每毫克蛋白的活性单位表示结果。

进行血管通透性检测时，在第0天对小鼠进行致敏，并在第4天按照前述方法将半抗原直接涂抹于小鼠耳部进行激发。23小时后，经静脉注射8.3 µL/g体重的1%伊文思蓝染料（溶于Dulbecco's磷酸盐缓冲液，即DPBS）至已麻醉的小鼠体内。1小时后，再次麻醉小鼠，并按前述方法采集耳部组织活检样本。

为了从组织中提取染料，将活检样本置于含有1毫升甲酰胺的离心管中，在37摄氏度、5%二氧化碳气氛条件下孵育18小时。采集耳部活检后，当小鼠仍处于深度麻醉状态时，用镊子摘除眼球。轻轻按压小鼠，并从眶后窦采集血液至用于血清收集的离心管中。

将试管倒置六次，静置30分钟使血液凝固。然后在室温下以1,300至2,000 ×g离心10分钟。在第0天使用前述方法用TNCB半抗原致敏供体小鼠。第4天，在消毒皮肤后，用镊子从麻醉小鼠中分离腋窝和腹股沟淋巴结（ALNs），随后分离脾脏。

将组织置于两片载玻片的磨砂端之间研磨，使细胞悬液通过孔径为70微米的细胞筛。随后，用添加了1%胎牛血清的DPBS洗涤细胞，并在4摄氏度下以300 G离心10分钟。弃去上清液，将剩余的细胞沉淀重悬于1至5毫升的DPBS中。

将ALN和脾脏制备成1:1的混合物，使细胞浓度达到每200微升DBPS中7.0 × 10⁷个细胞，然后将该混合物经静脉注射至麻醉小鼠体内，以输入CHS效应细胞。在激发后0小时和24小时分别测量耳部厚度。实验数据显示，经TNCB致敏并在四天后于耳部进行激发的小鼠，其耳部肿胀程度显著增加，与假致敏后同样激发的对照组小鼠相比具有明显差异。

实验组耳部水肿的增加导致耳重增加，髓过氧化物酶（MPO）活性升高，耳组织提取物中干扰素γ浓度上升，组织学检查显示真皮层出现水肿性改变，以及耳部血管通透性增加。与对照组动物相比，实验组小鼠血清中针对TNP的特异性IgG1抗体水平升高。接受先前经TNCB致敏供体的接触性超敏反应（CHS）效应细胞的动物，其耳部肿胀程度显著高于未接受细胞的动物。最关键的环节是诱发接触性超敏反应。

半抗原溶液具有高度挥发性和光敏感性，因此必须迅速涂抹于动物皮肤上。可对分离的效应细胞进行额外检测，例如建立细胞培养，以评估其在抗原存在下增殖的能力。