Name: 一种研究动脉粥样硬化斑块纤维组织局部胶原结构与力学性能相关性的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:50:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 了解动脉粥样硬化斑块纤维组织中胶原结构与力学性能相关性的研究方法。该方案通过多光子显微镜和单轴拉伸测试，在同一组织样本上整合结构与力学评估，揭示纤维斑块组织破裂行为的机制联系。

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本工作由荷兰科学研究组织（NWO）Vidi 项目基金（18360）资助。

作者声明无利益冲突。

本研究致力于开发一种力学成像分析流程，用于研究纤维状动脉粥样硬化斑块组织中局部胶原取向与分散性、局部力学特性以及破裂行为之间的相关性。本文所述方案在多个方面具有创新性。首先，这是首次将数字图像相关技术应用于测量机械载荷下纤维斑块组织的局部形变。其次，该方案提供了必要的信息，可用于分析纤维斑块组织的局部形变模式与其局部胶原结构之间的关联。结果部分展示的应变数据和胶原数据均突显了组织的异质性，从而强调了进行局部评估的重要性。因此，建议在今后对纤维斑块特性的研究中采用此类能够实现局部评估的技术，例如本方案中所使用的技术。
测试样品的制备是本实验方案中的关键步骤之一。颈动脉斑块主要由胶原组织构成，但可能含有钙化成分，而钙化被认为会影响斑块整体的力学行为36,37。由于本研究聚焦于斑块的纤维组织成分，因此通过使用µCT成像技术避开钙化区域，以避免其对测试样品的影响38。如果无法获得µCT设备，也可考虑采用其他成像技术（如MRI或OCT39）来识别斑块中的钙化区域。对于严重钙化或钙化呈弥散分布的斑块，获取不含钙化且尺寸足够大、可用于力学测试的纤维组织样品可能具有挑战性。本方案中的另一项难点是为数字图像相关法（DIC）生成理想的散斑图案。理想的DIC分析要求黑白比例为50:5028，且散斑尺寸为三到五个像素29，以确保足够的分析质量。若未能满足这些条件，可能导致局部应变测量结果不准确。最后，若组织的天然解剖标志不清晰，则将破裂位置准确映射到二次谐波成像（SHG）图像上也可能存在困难。对于此类样品，在成像前于组织上施加多个基准标记将有助于定位。
本方案中采用的多光子显微-二次谐波成像（MPM-SHG）技术优于许多其他胶原成像技术，因其具有高分辨率、非破坏性，并且穿透深度相对较大。然而，MPM-SHG的穿透深度（&#60;400 µm）仍存在局限性，无法对厚度在0.5至2 mm之间的测试样本进行全层成像。在最近一项基于扩散张量磁共振成像（DT-MRI）的研究中，我们已证实斑块组织深层区域的主要纤维取向可能与较表层、管腔侧区域的纤维取向不同14。因此，有必要进一步研究厚纤维斑块组织深层区域的局部胶原结构及其与局部组织力学特性的关系。为此，可采用偏振空间频率域成像（pSFDI）技术。这一新近发展的光学成像技术已被报道可在二尖瓣瓣叶中测量深达0.8 mm的纤维取向12。此外，pSFDI具有快速成像的优势，有望实现对整个样本区域的可视化，而不仅限于当前方案中所选取的部分图像区域。当前方案的另一局限性在于仅能识别表面变形。在今后的研究中，可将镜面辅助多视角数字图像相关法（mirror-assisted multi-view DIC）40或数字体相关法（DVC）41纳入本方案，以获取有关三维体积内亚表面应变的额外信息。
当前实验方案可通过多种方式进一步拓展或修改，以获取有关斑块破裂力学特性及其与底层微结构关系的更多信息。首先，本方案包含周向的单轴拉伸试验。选择此类力学测试的原因在于，斑块在周向主要承受拉伸应变 体内对于更全面的力学表征，本方案可进一步扩展，以纳入膨胀测试、双轴拉伸测试或纵向单轴拉伸测试。其次，当前方案仅聚焦于通过数字图像相关法（DIC）获取局部应变。然而，若在方案中同时引入局部应力分析，可更完整地揭示斑块的力学行为，但这需要对局部刚度进行表征。尽管目前仍具挑战性，该目标可通过计算技术实现，例如逆向有限元法。42,43 以及虚拟场方法44除了实验调整外，当前方案还可增加一些额外的后处理步骤。首先，不仅可以确定破裂位置，还可以识别裂纹扩展路径。 通过 所获得的高速相机图像。该传播路径可与局部的结构和力学参数相关联。其次，在所述方案中通过视觉识别裂纹起始位置。先前一项关于非生物组织的研究利用数字图像相关（DIC）应变测量中的不连续性来检测断裂45对斑块组织应用此类自动破裂检测技术有望提高破裂检测的准确性。最后，与其他胶原成像技术相比，MPM-SHG 的一个显著优势在于其能够对单个胶原纤维进行可视化。因此，所获得的数据 通过 该方案还可用于研究其他局部胶原蛋白特征，例如胶原蛋白含量。
该方案可用于更深入地理解纤维斑块组织的局部特性，纤维斑块是斑块破裂中发生机械性失效的组分 体内这些信息对于建立能够预测患者斑块破裂的新型结构与功能成像标志物至关重要。由于既往提出的危险生物标志物已被证明对预测未来临床事件的效能欠佳，因此亟需这类新的标志物。5,6未来，OCT 和偏振敏感 OCT 有可能识别并量化动脉系统中的纤维组织46,47,48此外，应变被视作局部斑块成分的替代标志物49因此， 体内 应变测量49 可能有助于识别患者的斑块稳定性。然而，在将获得的结果直接转化应用于临床时应谨慎对待 体内 斑块破裂。首先，纤维斑块组织承受更复杂的载荷 体内 比本方案中使用的单向拉伸载荷更为复杂。其次，动脉粥样硬化斑块是多组分结构； 体内 纤维斑块组织中的应力和应变分布可能受到其他斑块成分（如钙化灶）的存在及其位置的影响37.
该力学成像流程也可用于研究其他胶原组织。目前，整体力学测试与胶原结构成像已广泛应用于生物组织研究。然而，对纤维异质组织在断裂前及断裂时的局部力学性能以及胶原结构的评估，对于准确表征其力学特性至关重要。我们预期，本新方案的结构设计将有助于进一步揭示多种生物组织中微结构与力学性能之间的相互关系。

缺血性卒中常由颈动脉粥样硬化斑块破裂引发，是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一1。然而，目前用于预防颈动脉粥样硬化相关卒中的外科治疗规划策略并未包含对斑块破裂风险的评估2。这主要是因为先前提出的生物标志物（如斑块纤维帽厚度3和脂质核心大小4）已被证明对未来临床事件的预测价值有限5,6。深入理解斑块的力学特性及破裂机制，对于优化斑块破裂风险评估并识别新的动脉粥样硬化斑块风险标志物至关重要。
斑块破裂是一种局部力学事件，即高度纤维化的斑块组织无法承受血压施加的机械负荷，从而失去结构完整性7。尽管如此，斑块破裂事件的力学机制及其与基础微观结构之间的关联仍不明确8。少数对斑块组织失效特征进行表征的实验研究9,10,11,12,13仅报告了整体性的机械破裂特性（即极限拉伸断裂应变和强度），这些参数的获取基于组织结构均质性的假设。然而，纤维性斑块组织在结构上具有异质性，这可能主要归因于胶原纤维架构的局部差异14。此外，斑块组织的力学失效特性与胶原结构之间的关联仅在Johnston等人最近的一项研究中得到探讨。该研究显示不同斑块间主要纤维取向存在差异，并报告了纤维帽样本中以周向为主导纤维取向的斑块具有更高的极限应力和更低的极限应变15。然而，该研究同样局限于整体性的力学和结构性质。
为了揭示纤维斑块组织中胶原蛋白局部结构及局部力学特性的关键信息，本研究建立了一种力学-成像联合分析流程。该ex vivo流程可定量分析胶原纤维的局部取向方向与分散程度，以及局部断裂应变。该流程包括利用基于二次谐波产生（SHG）的多光子显微成像（MPM）对斑块组织中的胶原纤维进行成像，以及结合数字图像相关法（DIC）与单轴拉伸试验来定量评估组织的破裂特性。
多光子显微镜-二次谐波生成（MPM-SHG）已成为研究生物组织中胶原蛋白的一种常用技术16与组织学等其他胶原成像技术相比，该技术具有多种优势17，弥散张量成像（DTI）14，以及小角光散射（SALS）15首先，MPM-SHG成像具有非破坏性，因此非常适合与力学测试相结合18其次，SHG信号对胶原具有特异性，因此无需对组织进行染色。由于激发波长较长（近红外），其穿透深度大于其他显微技术。16高分辨率（&#181;SHG成像所达到的m级分辨率还可实现对单根纤维的可视化，从而为胶原纤维数量、胶原纤维取向及分布的局部定量分析提供了多种可能19.
数字图像相关法（DIC）结合力学测试是一种广泛使用的方法，用于获取生物组织的局部力学特性20。在DIC中，通过比较力学测试过程中高速相机采集的图像，追踪施加在组织表面的散斑位移20。该图像后处理方法可用于估算试样表面的全场应变分布20，也可用于研究组织的断裂行为21。

<table><tbody><tr><td>10 mm 延长环</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>CML10</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>20倍 APO 水浸物镜</td><td>Leica</td><td>507701</td><td></td></tr><tr><td>3D Slicer 软件</td><td>N/A</td><td>版本 4.11</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>喷笔枪 AB 430 - 喷嘴直径 0.3 mm</td><td>Conrad</td><td>4.01614E+12</td><td></td></tr><tr><td>遮光尼龙织物，带聚氨酯涂层</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黑色组织染料</td><td>Polysciences inc</td><td>24113-2</td><td></td></tr><tr><td>相机镜头，焦距 50 mm</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>MVL50M1</td><td></td></tr><tr><td>相机支架</td><td>VWR</td><td>241-0093, 241-7311</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra 多光子激光器</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>空气压缩机 + 气管</td><td>JUN-AIR, Conrad</td><td>B07GB9HC62, 4016138577198</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>版本 2208</td><td></td></tr><tr><td>双面泡沫胶带，1.9 x 150 cm</td><td>Pattex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热浴</td><td>N/A</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>高速相机 + 成像软件</td><td>Pixelink-Navitar Inc.</td><td>PL-D725</td><td></td></tr><tr><td>人颈动脉粥样硬化斑块（来自颈动脉内膜切除术）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LAS-AF</td><td>Leica</td><td>版本 2.3</td><td>多光子显微镜成像软件</td></tr><tr><td>LEICA TCS SP5 II</td><td>Leica</td><td></td><td>用于 SHG 成像的显微镜</td></tr><tr><td>照明系统</td><td>AMZ instruments</td><td>LED-60TB</td><td>用于高速相机获取清晰图像</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>版本 R2021A</td><td></td></tr><tr><td>基于 MATLAB 的 FibLab 软件</td><td>埃因霍温理工大学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>基于 MATLAB 的 FOA（纤维取向分析）工具</td><td>埃因霍温理工大学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>基于 MATLAB 的 Ncorr 软件</td><td>佐治亚理工学院</td><td>版本 1.2</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Emerald</td><td>BDAM302986</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（直径 10 cm）</td><td>VWR</td><td>BRND452000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>VWR</td><td>ELKA127-P511-000</td><td></td></tr><tr><td>Quantum GX2 微型计算机断层扫描（&amp;mu;CT）扫描仪 + 0.06 mm Cu 和 0.5 mm Al X 射线滤光片</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS149276</td><td></td></tr><tr><td>直尺</td><td>精细科学工具公司</td><td>1800030</td><td></td></tr><tr><td>砂纸（P180）</td><td>Conrad</td><td>4.00932E+12</td><td></td></tr><tr><td>斜口钳</td><td>Conrad</td><td>4.25084E+12</td><td></td></tr><tr><td>硅弹性体基料和固化剂（Sylgard 184）</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td></td></tr><tr><td>拉伸试验机 + 软件 + 夹具</td><td>N/A</td><td></td><td>自制，使用圆柱形直线执行器（EACM2E10AZAK，Oriental Motor Ltd.）和 10 N 负载传感器（LCMFD-10N，Omega Engineering Inc.）</td></tr><tr><td>扭矩螺丝刀</td><td>Garant, Hoffman group</td><td>659906</td><td></td></tr></tbody></table>

研究局部胶原结构与动脉粥样硬化斑块纤维组织力学特性相关性的方法

A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue

冠状动脉和颈动脉中动脉粥样硬化斑块的破裂是致命性心血管事件的主要原因。然而，这种结构异质、富含胶原的斑块组织的破裂力学特性，以及该特性如何与其纤维结构相关，目前尚不清楚。现有的研究斑块力学特性的方法仅限于获取斑块组织的整体力学特征，其前提是假设组织结构具有均一性。然而，纤维性斑块组织在结构上本质上是异质的，这可能主要归因于胶原纤维架构在局部区域的差异。
本文所述的力学成像流程旨在研究斑块异质性的结构与力学特性。该流程采用多光子显微镜（MPM）结合二次谐波生成（SHG）技术，对组织局部的胶原结构进行表征；同时利用数字图像相关（DIC）分析方法，在单轴拉伸测试条件下表征组织的断裂行为。该实验流程可实现纤维斑块组织中局部胶原纤维优势取向角与取向分散度、破裂行为以及应变特征图谱之间的关联分析。所获得的知识对于更深入理解、预测和预防动脉粥样硬化斑块破裂事件具有重要意义。

组织采集与测试样本制备 
组织采集可获得斑块纤维组织样本，可进一步分离为独立的测试样本，用于结构成像和单轴拉伸试验。理想情况下，采集的纤维组织样本应包含极少或没有撕裂区域（图5A）和大范围钙化（图5B）。若存在过多的撕裂和钙化（图5C），可能导致斑块样本无法满足前述 WL 1 的样本尺寸要求。
多光子显微成像 
二次谐波成像及图像后期处理可从每张成像图块中生成最大强度投影图（MIP）（图6A、B）。进一步通过纤维检测进行后期处理（图6C），可得到纤维取向直方图（图6D），并从中提取胶原结构参数（图6E）。此外，还可获得显示整个斑块样本中局部胶原结构参数的空间分布彩色图谱，用于可视化分析（图6F、G）。对于图6中的代表性测试样本，发现其胶原结构参数在样本内部存在较大变异（若以周向定义为0°，则µp = -34° ± 32°；σp = 21° ± 4°；Pani = 0.49 ± 0.14）。这种样本内部的异质性凸显了获取局部结构参数的重要性，而非假设其结构均一。
力学测试 
破裂行为 
高速相机可提供斑块样本在力学测试过程中变形和破裂行为的图像（图7）。通过这些图像可识别破裂起始位置及破裂扩展路径。若相机图像中存在气泡或反射现象，或破裂扩展过快而无法被所选帧率捕捉，则破裂识别结果将不理想。
局部应变模式 
对单轴拉伸测试过程中采集的相机记录进行数字图像相关分析，可得到局部组织变形图，例如图8所示的格林-拉格朗日应变图。这些图展示了在裂纹萌生前某一帧的三个应变分量（εxx、εxy 和 εyy）。通过这些应变图，可提取感兴趣区域的平均应变以及特定位置（如裂纹发生位置）的局部应变。
对于图8中的代表性样本，局部应变数据显示出较大的样本内变异。在图8所示的代表性测试样本中，局部应变存在显著的样本内变异（观测到的应变范围如下：εxx = -0.30–0.17；εxy = -0.13–0.20；εyy = 0–0.40）。这凸显了获取局部数据的重要性，而非基于组织均质性假设所得的整体平均值。
关联组织的力学与结构信息 
上述结果可将组织的局部变形与断裂行为与其胶原结构相关联。一旦在相机记录中确定了断裂位置（图9A），便可将其回溯映射至参考相机图像（图9B）以及显微镜平铺扫描图像（图9C）。由此可确定发生断裂的多光子显微成像-二次谐波成像（MPM-SHG）平铺区域，并获取该区域内的结构参数（图9D）。在代表性样本中，断裂发生区域的结构参数如图9所示，分别为 µp = 28°, σp = 19°, 和 Pani = 0.6。相同方法也可应用于未发生断裂的组织区域。需要注意的是，若散斑图案质量较差或天然解剖标志不清晰，则从断裂帧将断裂位置映射至参考图像可能具有挑战性。此外，若组织的天然解剖标志不够清晰，平铺扫描图像叠加图与高速相机图像之间的共定位可能较为困难。
<img alt="组织处理工作流程图：μCT、SHG成像、单轴拉伸测试、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：本实验方案的工作流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于结构分析的SHG成像示意图，显示针区、平铺扫描及显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：从平铺扫描中选择用于SHG成像的图像区域。 （A）固定在硅胶中的测试样品。（B）通过明场显微镜获得的测试样品平铺扫描图像。用于SHG成像的选定区域以蓝色方框标出。（C）多光子显微镜（MPM）中SHG信号的最大强度投影。比例尺 = 140 µm（C）。缩写：SHG = 二次谐波产生；MPM = 多光子显微术。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于光学激发研究的显微成像装置，包含培养皿和激光器；实验室研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：动脉粥样硬化斑块样本置于多光子显微镜物镜下。 斑块样本的位置由盛有磷酸盐缓冲液的培养皿固定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用测力传感器、PVC夹具和LED照明进行样品测试的静力学平衡实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：定制的单轴拉伸测试仪，标示出其各个组成部分。（A）系统的整体示意图。请注意，夹具中的砂纸垫片仅在底部夹具安装时可见。（B）拉伸测试仪夹具的放大图像，测试试样已准备就绪待测。缩写：PVC = 聚氯乙烯；LED = 发光二极管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="最佳组织分割对比；包含三维可视化和实际标本的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：代表性样本的组织采集与样本制备结果。（A）从接受颈动脉内膜剥脱术的知情同意患者中获取的新鲜且完整的斑块样本。（B）来自µCT扫描的三维重建图像。钙化组织显示为浅蓝色，非钙化组织显示为红色。在两条蓝线之间的区域可获得不含钙化组织的最佳样本。（C）µCT扫描的三维重建图像，显示一个钙化组织过多的次优斑块。比例尺 = 3 mm。缩写：µCT = 微计算机断层扫描。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="胶原纤维取向分析：拼图扫描、最大强度投影图像、纤维检测、直方图、高斯拟合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：代表性样本的多光子显微镜-二次谐波生成（MPM-SHG）结果。（A）拼图扫描概览；成像所选区域以蓝色标示。（B）来自不同拼图区域的最大强度投影（MIP）图像。（C）使用纤维取向分析（FOA）工具对选定区域（#1）进行的纤维检测。（D）来自选定区域的纤维取向直方图。（E）纤维取向直方图及其高斯拟合，由此可从选定区域提取胶原结构参数。（F）在整个斑块样本上显示的µp（取向黑线）和σp（背景颜色）分布。（G）在整个斑块样本上显示的µp（取向黑线）和Pani（背景颜色）分布。比例尺 = 140 µm（B,C）。缩略语：MPM-SHG = 多光子显微镜-二次谐波生成；MIPs = 最大强度投影；FOA = 纤维取向分析；µp = 主导纤维角度；Pani = 各向异性组分；σp = 纤维角度分布的标准差；Piso = 各向同性组分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="组织破裂过程、显微镜图像；阶段：完整、起始、扩展、完全破裂。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 7"> 
图 7：拉伸试验过程中斑块组织样本的破裂起始与扩展。1）预拉伸状态，组织完整。2）破裂起始——首次观察到破裂的帧图像，破裂起始位置用红色方框标记。3）和4）破裂扩展过程。5）斑块样本的完全破裂。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="材料中的纵向、剪切、拉伸应变图；颜色编码的变形分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 8"> 
图 8：通过数字图像相关（DIC）分析获得的代表性样本在破裂前帧的格林-拉格朗日应变分布（εxx、εxy 和 εyy）。整个斑块的平均值和标准差，以及破裂位置处的应变值均予以提供。缩写：DIC = 数字图像相关；εxx = 纵向应变；εxy = 剪切应变；εyy = 拉伸应变。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胶原蛋白断裂分析，显微图像；结构参数示意图；拼图扫描方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图9"> 
图9在图像上叠加破裂位置（红色方框）的示意图。 (A高速摄像图像，其中已识别出破裂位置（破裂帧）。B高速摄像图像，仅施加预拉伸（参考帧）。C) 获得的拼图扫描图像 通过 显微镜技术。D) 一幅彩色编码图，显示不同区域的局部胶原结构参数。 µp （方向黑线）和 Pani （背景颜色）在整个斑块样本中的分布情况如图所示。缩写： µp = 主导纤维角度；Pani 各向异性分数 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们开发了一种力学成像分析流程，用于研究动脉粥样硬化斑块在结构和力学特性上的异质性。该分析流程能够关联纤维斑块组织中胶原纤维取向的局部主导角度与分散程度、破裂行为以及应变特征图谱。

冠状动脉和颈动脉中动脉粥样硬化斑块的破裂是致命性心血管事件的主要原因。然而，斑块破裂……

该方案可实现对纤维斑块组织中胶原结构及力学失效特性的局部评估。由于结构与力学评估均在同一组织样本上进行，该技术有助于揭示组织结构特性与力学特性之间的功能关联。通过本方案获得的关于纤维斑块组织结构与失效特性的知识，对于预防和预测由动脉粥样硬化斑块破裂引发的临床致命事件至关重要。首先，使用手术剪刀和镊子沿动脉的长轴方向将斑块切开。从斑块标本中切割出矩形测试样品，确保样品尽可能大，同时避开含有撕裂或钙化区域的组织。接下来，取一块斑块测试样品，通过将针插入组织，将其两端固定在硅胶上。将针插入样品中将在机械测试期间被拉伸测试设备夹具夹住的区域。戴上护目镜。使用侧切钳将针剪短，使其在样品表面以上突出部分小于几毫米，以防止其损坏显微镜物镜。用 PBS 填充培养皿，直至样品完全浸没。接着，打开显微镜系统，开启多光子激光开关，并启动显微镜的操作软件。将含有待测样品的培养皿置于物镜下方，并降低显微镜物镜。打开实时扫描模式。使用智能面板上的旋钮将物镜移至样品的一个角落，然后点击Tile Scan面板中的标记位置符号。如果操作正确，用于成像的所有选定区域将显示为橙色网格。接下来，点击屏幕右下角的“开始”按钮，对整个样品表面创建图块扫描，以获得样品形貌的概览。完成图块扫描后，在自动显示的“图块扫描”面板中观察左上角图块的左上角对应的 X 和 Y 坐标。将这些坐标记录在电子表格中。在“Tile Scan”面板中，观察名为“ScanField”的框内X和Y方向上的图块数量。在电子表格中记录图块扫描的尺寸。通过加上或减去图块的尺寸，计算其他图块的坐标。从平铺扫描中选择将使用二次谐波生成（SHG）成像的区域。在选择时，应避开夹具所在区域，并在所选区域之间沿纵向和周向均间隔一个区域。接下来，利用此电子表格中计算出的坐标，确定待成像区域的位置。在指定的输入框中填写坐标，然后点击“Enter”，使物镜移动到正确的区域。开启实时扫描模式。通过使用上方面板中的滑块和光路设置，增加多光子（MP）激光功率，以获得尽可能高的激光功率，同时避免明显的漂白现象。然后，通过智能面板上的旋钮或点击探测器名称、光束路径设置及附加通道，调节探测器增益，以获得无饱和像素的明亮图像。探测器增益的典型值介于500至800伏之间。使用智能面板上的Z轴位置旋钮调节焦平面。然后，移动到样品的顶部，通过点击采集选项卡下第三个面板中Z-stack面板内的箭头来设定Z-stack顶部的位置。接着，聚焦样品，直到无法检测到SHG信号为止。再次点击Z-stack面板中的箭头，以设定此位置。完成后，关闭实时扫描模式。在第二个面板的“采集”选项卡下，将扫描速度保持在 400 赫兹，使用下拉列表将线平均值设置为 2，分辨率为每幅图像 512 × 512 像素。启用双向 X 轴扫描按钮。在Z-stack面板中点击z步进大小，然后在框中输入3微米的z步进大小。点击屏幕右下角的“开始”以创建Z-stack。完成后，将该图像块的坐标保存在文件名中，或为每个图像块编号。成像后，将样本进行力学测试。为生成斑驳图案，手持装有组织染料的喷笔，距离测试样本约30厘米，将染料喷涂于样本的管腔表面。接着，进行单轴拉伸测试时，将样本置于拉伸试验机的夹具中，使样本的周向与拉伸方向对齐，并使样本的管腔面朝上。确保设定初始标距，使条状试样的宽长比小于1。使用扭矩螺丝刀施加20厘牛·米的扭矩，拧紧夹具的螺丝。向加热浴槽中加入磷酸盐缓冲液（PBS），直至样品完全浸没。撕裂负荷传感器，并开始记录来自拉伸试验机的负荷传感器和执行器的全局力和位移测量值。施加0.05牛顿的预拉伸以消除试样中的松弛，使试样伸直。在施加预拉伸后，根据执行器测得的标距长度，进行10次预循环，最大应变至10%。启动单轴拉伸试验，直至样品完全断裂，同时使用高速相机记录样品变形过程的视频。断裂后，停止记录整体的力和位移测量数据。在 Image J 中打开多光子显微镜（MPM）结合二次谐波成像（SHG）获得的 Z 层扫描图像，并对每个 Z 层扫描图像生成最大强度投影（MIP）。使用基于开源 MATLAB 的纤维取向分析工具分析每张最大强度投影图像（MIP），以测量图块中单个胶原纤维的取向角度。使用另一个基于 MATLAB 的工具 FibLab，对角度分布直方图拟合高斯分布。从高斯分布图中提取结构参数，例如分布的众数即主要纤维取向角、纤维角度分布的标准差以及各向异性分数。通过目视检查相机图像，确定裂纹起始发生的帧，并目视识别裂纹位置。使用基于MATLAB的软件ncorr，结合拉伸试验期间记录的相机图像，进行数字图像相关（DIC）分析。选择在最终拉伸至断裂前的最后一帧作为参考图像。对于当前图像，选择从最终拉伸开始直至裂纹萌生前一帧之间的所有图像。将样品表面选为感兴趣区域（ROI）。排除靠近夹具的区域。进行数字图像相关（DIC）分析时，将参数的子集半径设为30像素，子集间距设为3像素，迭代截止值设为50，差分向量范数截止值设为10的5次方，应变半径设为5，自动传播步长设为5。通过ncorr的DIC分析，获得感兴趣区域（ROI）的格林-拉格朗日或欧拉应变分布。利用这些应变分布，计算破裂前最后一帧整个斑块样本表面的平均格林-拉格朗日应变。计算破裂位置处的格林-拉格朗日应变。通过测试样本中的天然标记点，将参考图像与图块扫描图像叠加，以在图块扫描图像上确定破裂位置。确定发生断裂的 MPM-SHG 图像区域。如果断裂未发生在 MPM-SHG 扫描的区域内，则确定距离断裂位置最近的图像区域。获取断裂发生区域的结构参数。此处显示一个新鲜且完整的斑块样本，几乎没有撕裂和大块钙化。斑块样本可取自不含此类撕裂和钙化的区域。二次谐波成像（SHG）及图像后期处理可提供每个成像区域的投影最大强度图像（MIP）。通过纤维检测进行进一步的后处理，可得到纤维取向直方图，并从中提取胶原结构参数。此外，还可获得显示整个斑块样本中局部胶原结构参数分布的彩色图谱，用于可视化分析。在这些测试样本中，观察到胶原结构参数存在较大的样本内变异。此处展示了在拉伸试验中斑块组织样本的破裂起始与扩展过程。数字图像相关分析提供了局部组织变形图，例如格林-拉格朗日应变图。根据这些应变图，观察到样本内部局部应变存在显著差异。一旦在摄像记录中确定了破裂位置，便可将其映射回参考相机图像和显微镜图块扫描图像中。这能够确定发生破裂的多光子显微-二次谐波成像图块，以及该图块处的结构参数。对于严重钙化的斑块而言，获取无钙化且尺寸足够大、可用于力学测试的纤维组织样本可能是一项具有挑战性的任务。一旦确定某种力学或结构特征可作为纤维斑块组织破裂的预测指标，能够测量该特征的体内成像系统将有助于预测患者斑块破裂的风险。

a-method-to-study-correlation-between-local-collagen-structure

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种研究动脉粥样硬化斑块纤维组织局部胶原结构与力学性能相关性的方法

我们描述了利用主动脉窦和升主动脉的精密切片，结合组织化学和免疫组织化学分析，对小鼠模型中的动脉粥样硬化病变进行定量和表征的实验方法。...

小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变的定量分析与表征

本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。...

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

我们描述了使用数字图像相关技术来表征经受单轴拉伸试验的血管组织样本表面局部应变场的方法。这些测量有助于精确量化样本的力学响应，并建立本构应力-应变关系。...

利用数字图像相关技术表征血管组织样本上的局部应变

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通过无标记荧光显微镜评估活体人阻力动脉中胶原蛋白和弹性蛋白的压力依赖性微结构

我们提出了一种标准化方案，用于表征晚期小鼠动脉粥样硬化病变的细胞组成，包括对易发动脉粥样硬化的平滑肌细胞谱系示踪小鼠的臂头动脉进行系统性动物解剖、组织包埋、切片、染色及分析的方法。...

平滑肌细胞谱系示踪小鼠中晚期动脉粥样硬化病变的细胞组成定量分析

动脉粥样硬化的小鼠模型是研究分子水平致病通路的有用工具，但需要对病变发展进行标准化定量。本方案描述了一种优化的方法，用于测定主要动脉血管（包括主动脉根部、主动脉弓和头臂动脉）中的病变大小。...

小鼠动脉粥样硬化的定量分析

有必要确定冠状血管中哪些动脉粥样硬化病变会进展，以便在心肌梗死发生前指导干预措施。本文概述了利用商业有限元求解器中的流固耦合技术，基于光学相干断层成像数据对动脉进行生物力学建模的方法，以帮助预测此类病变的进展。...

基于光学相干断层扫描的冠状动脉粥样硬化进展生物力学流固耦合分析

基于血管内超声图像的有限元建模方法用于量化人冠状动脉的体内力学特性

本方案提供了一种用于动脉粥样硬化斑块定量分析的综合方法，以促进对动脉粥样硬化机制及进展的深入研究。...

动脉粥样硬化小鼠模型中主动脉弓及主动脉根部病变的分离与分析

已设计出一种循环压力生物反应器，可对心脏瓣膜组织施加生理和病理条件下的压力。LabVIEW...

设计一种用于循环压力生物反应器的装置 离体 主动脉心脏瓣膜的研究

了解动脉粥样硬化斑块纤维组织中胶原结构与力学性能相关性的研究方法。该方案通过多光子显微镜和单轴拉伸测试，在同一组织样本上整合结构与力学评估，揭示纤维斑块组织破裂行为的机制联系。

研究局部胶原结构与动脉粥样硬化斑块纤维组织力学特性相关性的方法

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