利用利什曼原虫破译毛孔形成毒素的分子机制和功能
October 28th, 2022
这里介绍的是使用 利什曼原虫主要 前鞭毛体来确定孔形成毒素诱导的结合、细胞毒性和信号传导的方案。提供了链球菌溶血素O的概念验证。其他毒素也可用于利用 杆菌 中可用的遗传突变体来确定毒素抗性的新机制。
对毛孔形成毒素的抵抗机制知之甚少。我们的协议能够使用大利什曼原虫（一种遗传上易于处理和生理相关的系统）来形成毒素的功能和机制。细胞毒性测定的主要优点是在实时受到毒素攻击时，在中通量测定中比较单细胞水平上多种表型的细胞活力。
两性霉素 B 等膜扰动剂是利什曼原虫的一线疗法。该测定能够鉴定增强两性霉素B和/或新的膜损伤剂的药物。该测定提供了对修复反应和与修复反应相关的信号通路等领域的见解。
该测定可应用于原生动物，如锥虫和福氏内格勒菌。人们发现很难理解毒素系列稀释系列。因此，我能给出的最佳建议是在设置实验之前绘制系列稀释系列的示意图。
首先，将0.5毫升处理过的鞭毛体保留在单独的管中作为未染色的对照。向剩余的前鞭毛体中加入每毫升2毫克碘化丙啶或PI，最终浓度为每毫升10微克。涡旋三秒钟。
将处理好的鞭毛加入V底，96孔板或沼泽管的每个孔中，并将板或管架以大约45度角放置在冰上。向每个无毒素对照中加入100微升碘化丙啶测定缓冲液。通过直观地识别总体积为 200 微升且颜色较深的管，验证是否正确添加了对照。
将毒素体积添加到最高稀释度。然后，连续稀释毒素。上下移液至少八次以确保混合。
从最低毒素浓度开始，快速将100微升毒素添加到正确的行中，并继续直到所有毒素都添加到细胞中。用密封胶带密封板。在37摄氏度下孵育30分钟后，包装并将板运输到流式细胞仪。
对于数据采集，首先根据制造商的说明和设施政策设置流式细胞仪和采集软件。使用未染色的L.major前鞭毛样品，根据所选染料设置前向和侧向散射的门以及初始荧光参数。使用单染色对照，设置活性染料和任何荧光标记毒素的闸门。
监测微堵塞的前向散射与时间的关系，并在细胞仪上为每个样品采集超过10， 000个门控事件。对于数据分析，根据需要通过对前向和侧向散射和时间进行门控来控制总单细胞L.主要前鞭毛体。按照流式细胞仪的建议使用高度或面积。
识别死细胞并将其选为PI高。在Excel中组织剂量 - 反应曲线进行分析。确定两个技术重复之间每个条件的平均PI高百分比。
包括毒素浓度和平均百分比特异性裂解，以及实验细节和/或原始百分比PI高计算。将另外四列标记为建模、残差、参数和参数值。验证第一列是否与实验参数、毒素浓度和比裂解百分比相对应。
通过在"参数值"列中输入值来初始化参数 L、k 和 c。在"建模"列中，创建逻辑模型。在残差列中，计算建模数值与实际特定裂解之间的差值的平方。
在参数值列的 SUM 旁边，对残差列中的所有值求和。在"参数值"列中，在LC50旁边，初始化公式以根据确定的值计算LC50。从数据选项卡中打开规划求解。
选择设置目标作为包含所计算残差总和的像元。将其设置为最小值。更改参数值 L、k 和 c 的变量单元格。
对于负 k 值，通过从 k 中分解出负值来修改方程，以将 k 更改为正。使用 GRG 非线性求解方法，然后单击求解。检查曲线，并自动计算LC50。
通过图形绘制百分比特异性裂解和针对毒素浓度的建模来验证拟合。鞘脂缺陷的SPT2敲除前鞭毛对无血清M199和Tyrode缓冲液中的SLO敏感。野生型和SPT2回加原鞭毛在无血清M199中对SLO具有抗性，但在Tyrode缓冲液中的特异性裂解率低于20%。
SPT2敲除前鞭毛对Tyrode缓冲液中SLO的敏感性大约是M199的八倍。这些数据表明，毒素敏感性可能因使用的缓冲液而异。在L.major前鞭毛体中观察到磷酸化MEK的120千道尔顿带。
对于总MEK，观察到约120千道尔顿和55千道尔顿的条带，分别与MRK1和LmxMKK的大小一致。磷酸化-ERK检测到相似的条带，而ERK抗体染色在该测定中并不可靠。尝试此过程时要记住的最重要的事情是确保正确处理毒素。
利什曼原虫可用作研究质膜修复的遗传学模型，为白蛉中肠利什曼原虫细菌相互作用期间的膜修复机制提供新的见解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本协议利用大型利什曼原虫前鞭毛体来研究孔形成毒素诱导的结合、细胞毒性和信号传导机制。它包括使用链球菌溶血素O的概念验证，并突出了使用各种毒素探索毒素耐药机制的潜力。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 微生物学
背景
- 对孔形成毒素的耐药机制尚不明确。
- 大型利什曼原虫是研究这些机制的遗传可控模型。
- 细胞毒性测定可以评估不同表型的细胞活力。
- 两性霉素B等膜扰动剂常用于治疗。
研究目的
- 阐明孔形成毒素的功能和机制。
- 识别增强两性霉素B功效的药剂。
- 探索新的膜损伤剂。
使用的方法
- 在测定中使用大型利什曼原虫前鞭毛体。
- 实时评估细胞对毒素的活力反应。
- 在中等通量格式下比较多个表型。
- 研究修复反应和相关信号通路。
主要结果
- 证明了孔形成毒素对大型利什曼原虫的细胞毒性效果。
- 识别了可能增强现有治疗的潜在药剂。
- 提供了对细胞修复机制的见解。
- 突出了该测定在研究毒素耐药性方面的实用性。
结论
- 该协议为理解毒素相互作用提供了宝贵的工具。
- 它可能导致发现针对利什曼原虫的新治疗策略。
- 进一步的研究可以扩展对孔形成毒素耐药机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Pore-forming toxin (PFT) resistance mechanisms remain a critical unknown in infectious disease biology and membrane-targeted drug discovery. Leveraging Leishmania major as a genetically tractable, physiologically relevant model enables high-confidence interrogation of membrane dynamics and toxin susceptibility, directly informing early-stage target validation and mechanistic de-risking. This approach supports predictive confidence for membrane-active therapeutics and portfolio triage in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of membrane repair pathways and toxin susceptibility genes.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying lipid and protein contributions to toxin response.
- Facilitates comparative analysis of phenotypes under controlled toxin challenge.
- Provides a genetically tractable system for hypothesis-driven interrogation of membrane biology.
Screening & Assay Development
- Delivers medium-throughput, quantitative cytotoxicity assays for membrane-active compounds.
- Standardizes viability and lysis readouts using flow cytometry and propidium iodide staining.
- Enables robust dose-response modeling and LC50 determination for compound evaluation.
- Supports reproducible screening of agents that potentiate or inhibit membrane damage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns membrane repair and toxin susceptibility findings with disease-relevant protozoan models.
- Enables continuity from in vitro discovery to in vivo infection models in murine systems.
- Supports risk-adjusted advancement of membrane-targeted therapeutics.
- Provides mechanistic insights applicable to related pathogens and membrane-active drug classes.
Pipeline & Workflow Integration
This platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation for membrane-active agents and anti-infective strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on membrane repair, lipid composition, and toxin response pathways.
- Screening: Provides quantitative, reproducible cytotoxicity and lysis data for compound triage.
- Analytics: Enables logistic modeling, LC50 calculation, and statistical comparison of phenotypes and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo infection models for translational continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for membrane biology and toxin mechanism studies across diverse agents.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in membrane-targeted drug mechanisms and target validation.
- Operational Value: Standardizes cytotoxicity workflows and enables medium-throughput, reproducible assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for membrane-active compounds and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-infective and membrane-active therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protozoan culture, flow cytometry, and quantitative data analysis.
- Needs access to flow cytometry instrumentation and analytical software for modeling.
- Demands cross-team standardization of assay setup, controls, and data interpretation.
- Adaptable to other protozoan models with similar membrane biology.
- Buffer composition and toxin handling are critical for reproducibility and data integrity.
