利用Leishmania major解析孔形成毒素的分子机制与功能

对孔形成毒素的耐药机制目前尚不明确。我们的实验方案利用杜氏利什曼原虫（Leishmania major）这一遗传上易于操作且生理学上具有相关性的体系，来研究孔形成毒素的功能与作用机制。细胞毒性检测的主要优势在于，当毒素实时作用时，可在中等通量的单细胞水平上比较多种表型的细胞存活情况。

两性霉素B等膜干扰剂是治疗利什曼原虫的一线疗法。本实验方法可用于鉴定能够增强两性霉素B活性的化合物，和/或发现新的膜损伤类药物。该实验可为修复应答及相关信号通路等研究领域提供重要信息。

该检测方法可应用于锥虫和福氏耐格里阿米巴等原生动物。人们往往难以理解毒素的系列稀释过程，因此我给出的最佳建议是在开展实验前先绘制出系列稀释的示意图。

首先，将0.5毫升处理后的前鞭毛体保留于另一试管中，作为未染色对照。向其余前鞭毛体中加入终浓度为10微克/毫升的碘化丙啶（propidium iodide，PI），其储存液浓度为2毫克/毫升。涡旋振荡3秒。

将处理后的前鞭毛体加入96孔V型底培养板的每个孔中，或加入马什管中，并将培养板或试管架以约45度角倾斜放置于冰上以便观察。向每个无毒素对照孔/管中加入100微升含碘化丙啶的检测缓冲液。通过肉眼观察确认对照是否正确加入：含有200微升总体积且颜色较深的管/孔即为正确添加的对照。

将毒素加入最高稀释度的溶液中，然后对毒素进行系列稀释。至少吹打混合八次，以确保充分混匀。

从最低毒素浓度开始，迅速向相应的行加入100微升毒素，依次操作直至所有毒素均加入细胞中。用封板膜密封培养板。在37摄氏度孵育30分钟后，将培养板包装并运送至流式细胞仪。

进行数据采集时，首先根据制造商说明及实验室相关规定，设置流式细胞仪和数据采集软件。使用未染色的利什曼原虫前鞭毛体样本，根据所选染料设定前向散射光和侧向散射光的门控以及初始荧光参数。利用单染对照样本，设定活力染料及任何荧光标记毒素的门控。

通过监测前向散射随时间的变化来观察微堵塞情况，并在流式细胞仪上对每个样本采集超过 10,000 个门控事件。数据分析时，根据前向散射和侧向散射以及必要的时间参数，圈选总的单细胞利什曼原虫前鞭毛体。根据流式细胞仪的建议，使用高度或面积参数进行分析。

将死细胞鉴定并圈选为PI高表达细胞。在Excel中整理剂量-反应曲线以进行分析。计算每个条件下两个技术重复之间PI高表达细胞的平均百分比。

包括毒素浓度和平均特异性裂解百分比，以及实验细节和/或原始PI高百分比计算结果。另标记四列为“模拟值”、“残差”、“参数”和“参数值”。确认前几列对应实验参数、毒素浓度和特异性裂解百分比。

通过在“参数值”列中输入数值来初始化参数 L、k 和 c。在“建模值”列中，建立逻辑斯蒂模型。在“残差”列中，计算建模数值与实际特异性裂解率之间差值的平方。

在“参数值”列中，于 SUM 旁边，对“残差”列中的所有数值求和。在“参数值”列中，于 LC50 旁边，初始化方程以根据所确定的数值计算 LC50。从“数据”选项卡中打开求解器。

选择目标单元格，该单元格包含计算得到的残差总和，并将其设置为最小值。调整参数 L、k 和 c 的变量单元格。

对于负的 k 值，通过从 k 中提取负一因子，使 k 变为正值，并相应调整方程。使用 GRG 非线性求解方法，然后点击“求解”。检查曲线，并确认 LC50 已自动计算。

通过将特异性裂解百分比和模型拟合结果与毒素浓度进行图示化作图，验证拟合效果。鞘脂缺乏的SPT2基因敲除前鞭毛体在无血清M199培养基和Tyrode's缓冲液中均对链球菌溶素O（SLO）敏感。野生型和SPT2基因回补的前鞭毛体在无血清M199培养基中对SLO具有抗性，但在Tyrode's缓冲液中特异性裂解率低于20%。

在Tyrode缓冲液中，SPT2基因敲除的前鞭毛体对SLO的敏感性比在M199培养基中高出约八倍。这些数据表明，毒素敏感性可能因所用缓冲液的不同而有所差异。在L. major前鞭毛体中观察到分子量为120千道尔顿的磷酸化MEK条带。

对于总MEK，在约120千道尔顿和55千道尔顿处观察到条带，分别与MRK1和LmxMKK的大小一致。磷酸化ERK检测到类似的条带，而在此实验中ERK抗体染色信号较弱。进行该实验操作时最重要的是确保对毒素的正确处理。

利什曼原虫可作为一种遗传上易于操作的模型，用于研究质膜修复，为利什曼原虫与白蛉中肠内细菌相互作用过程中的膜修复机制提供新的见解。