Name: 利用利什曼原虫破译毛孔形成毒素的分子机制和功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 了解利用利什曼原虫研究毛孔形成毒素分子机制的实验方法。该方案通过实时细胞毒性检测比较不同表型的细胞活力，为探索毒素抗性和膜修复机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢Keyel实验室和Zhang实验室成员对本文手稿的审阅。作者感谢文理学院显微技术中心提供设施支持。

<ol><li>Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+macrophages+and+cholesterol-dependent+cytolysins%3A+The+impact+on+immune+response+and+cellular+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival.</a> Toxins. 12 (9), 531(2020).</li>
<li>Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+streptolysin+O+in+a+mouse+model+of+invasive+group+A+streptococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease.</a> Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).</li>
<li>Farrand, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholesterol-dependent+cytolysin+membrane-binding+interface+discriminates+lipid+environments+of+cholesterol+to+support+beta-barrel+pore+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).</li>
<li>Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+elements+of+the+cholesterol-dependent+cytolysins+that+are+responsible+for+their+cholesterol-sensitive+membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).</li>
<li>Schoenauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+acid+sphingomyelinase+and+neutral+sphingomyelinase-2+inversely+determines+the+cellular+resistance+to+plasmalemmal+injury+by+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins.</a> FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).</li>
<li>Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+repair+triggered+by+cholesterol-dependent+cytolysins+is+activated+by+mixed+lineage+kinases+and+MEK%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK.</a> Science Advances. 8 (11), (2022).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+annexin+A1+reveals+dynamics+of+ceramide+platforms+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells.</a> Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).</li>
<li>Jimenez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT+machinery+is+required+for+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ESCRT machinery is required for plasma membrane repair.</a> Science. 343 (6174), 1247136(2014).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>Wolfmeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%29%28%2B%29-dependent+repair+of+pneumolysin+pores%3A+A+new+paradigm+for+host+cellular+defense+against+bacterial+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).</li>
<li>Bravo, F., Sanchez, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+re-emerging+cutaneous+infectious+diseases+in+Latin+America+and+other+geographic+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas.</a> Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Manfredi, M., Iuliano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+leishmaniasis+with+long+duration+and+bleeding+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer.</a> Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+are+essential+for+differentiation+but+not+growth+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania.</a> EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+de+novo+synthesis+and+salvage+of+lipids+by+Leishmania+amastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes.</a> Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).</li>
<li>Kaur, P., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+role+of+mitogen+activated+protein+kinases+in+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites.</a> Biochimie. 193, 78-89 (2022).</li>
<li>Wiese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+MAP+kinases--Familiar+proteins+in+an+unusual+context%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context.</a> International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).</li>
<li>Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+mitogen-activated+protein+kinases+as+drug+discovery+targets+to+treat+human+protozoan+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Signal+Transduction%22%5BJournal%5D)">Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens.</a> Journal of Signal Transduction. 2011, 971968(2011).</li>
<li>Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+involved+in+flagellar-length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinase involved in flagellar-length control.</a> Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).</li>
<li>Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential%2C+putative+MEK+kinase+of+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biochemistry+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">An essential, putative MEK kinase of Leishmania major.</a> Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).</li>
<li>Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+parameters+beyond+lipid+binding+affinity+drive+cytotoxicity+of+cholesterol-dependent+cytolysins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins.</a> Toxins. 11 (1), (2018).</li>
<li>Beneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Cas9+high-throughput+genome+editing+toolkit+for+kinetoplastids%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids.</a> Royal Society Open Science. 4 (5), 170095(2017).</li>
<li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li>
<li>Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+synthesis+through+cholinephosphate+cytidylyltransferase+is+dispensable+in+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major.</a> Scientific Reports. 9, 7602(2019).</li>
<li>Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bacterial+toxin+induced+responses+using+live+cell+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), 4227(2012).</li>
<li>Romero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+repair+protects+cells+from+pore-forming+toxins+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).</li>
<li>Keyel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+porous+defects+in+plasma+membranes+of+adenosine+triphosphate-depleted+Madin-Darby+canine+kidney+cells+and+its+inhibition+by+glycine%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigations%22%5BJournal%5D)">Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine.</a> Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).</li>
<li>Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+small+molecules+prevent+macrophage+lysis+during+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis.</a> Cell Death & Disease. 10 (4), 326(2019).</li>
</ol>

本研究工作获得了美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所的资助，项目编号为R21AI156225（PI：PAK，合作研究者：KZ）和R01AI139198（PI：KZ，合作研究者）。CH感谢生物科学系在本研究期间提供的助教奖学金支持。
资助机构在研究设计、数据收集、分析或解释、稿件撰写以及决定发表结果等方面均未发挥作用。本文内容完全由作者负责，不一定代表资助机构的官方观点。作者声明不存在任何竞争性利益冲突。

本研究以人类病原体Leishmania major为模型系统，描述了研究孔形成毒素（PFTs）分子机制和功能的方法。建立了一种基于流式细胞术的中通量细胞毒性检测方法，用于测定单细胞存活率。由于可通过逻辑建模从剂量-反应曲线计算LC50值，因此该方法可在群体水平上实现存活率的定量分析。作为原理验证，采用流式细胞术检测证明了培养基的选择可影响野生型和鞘脂缺乏型L. major对SLO的敏感性，并确定了每种培养基中的亚溶血毒素剂量。在后续实验的原理验证中，检测了毒素攻击过程中L. major前鞭毛体内的磷酸化MAPK和磷酸化ERK抗体反应。总体而言，L. major前鞭毛体是一种具有病理相关性且遗传操作可行的模型系统，可用于深入理解毒素介导的细胞损伤机制与功能。
流式细胞术检测具有高度灵活性。如有需要，可使用其他活力染料替代碘化丙啶（PI）。在哺乳动物细胞中，多种活力染料的报告能力未见差异。20. 毒素的选择， L. major ...

孔道形成毒素（pore-forming toxins, PFTs）是细菌毒素中最大的一类1，但其穿孔并破坏细胞的机制尚不明确。其中研究最为深入的是胆固醇依赖性溶细胞素（cholesterol-dependent cytolysins, CDCs）。CDCs 主要由革兰氏阳性菌合成，包括引起坏死性筋膜炎的致病菌Streptococcus pyogenes2。S. pyogenes 分泌 CDC 家族中的链球菌溶素 O（streptolysin O, SLO），该毒素以单体形式结合宿主细胞质膜中的固醇类物质，随后寡聚化，并在膜上插入约 20–30 nm 的孔道1。脂质在此过程中的作用仍不清楚。
研究脂质与胆固醇依赖性细胞溶解素（CDC）相互作用的一种方法是使用化学成分明确的脂质体。尽管成分明确的脂质体可提供关于维持毒素结合和成孔所需脂质阈值的信息3,4，但其无法完全重现细胞的生理功能。例如，重建的脂质体缺乏哺乳动物宿主细胞所具有的脂质不对称性，也无法模拟毒素刺激下发生的脂质修饰5。脂质体的一种替代方案是使用哺乳动物细胞系。虽然这些细胞系在生理相关性上更高，但其毒素感知和抗性机制存在大量冗余2。因此，用于抵抗CDC的膜修复通路至今仍不明确。值得注意的是，Ca2+内流是激活膜修复的主要信号1。在Ca2+内流之后，多个下游通路被激活，包括依赖神经酰胺的修复通路6,7和依赖MEK的修复通路6。这些通路会与其他蛋白效应分子相互作用，例如运输所需的内体分选复合物（ESCRT）8以及膜联蛋白（annexins）6,9,10。由于存在通路冗余，解析哺乳动物细胞中这些修复机制极具挑战性，这使得实验数据的解释变得复杂。
一种在解析修复通路时平衡复杂性与简洁性的方法是使用较为简单的生物体，例如原生动物病原体中的属 利什曼原虫. 利什曼原虫 sp. 可导致人类及其他动物感染利什曼病。利什曼病的临床表现因物种及其他因素而异，可从自限性皮肤利什曼病（皮肤损害）到致命性内脏利什曼病（肝脾肿大）。11. Leishmania major，皮肤利什曼病的致病原，可传播给人类 通过 一种沙蝇传播媒介，用于研究理解 利什曼原虫 功能与感染12此外， 利什曼原虫 sp. 为双基因遗传12它们以细胞内哺乳动物巨噬细胞寄生虫形式存在，称为无鞭毛体，同时也在沙蝇体内以自由游动、具鞭毛的前鞭毛体形式存在。12.&#160;L. major 前鞭毛体可在添加血清的培养基（如M199）中培养至高密度13前鞭毛体也具有可遗传操作性；已存在多种基因敲除株系，包括靶向脂质生物合成通路的基因敲除株系13这些基因敲除株可用于评估其生长情况、感染性差异以及病损形成的变化。 通过 Balb/c小鼠感染13.
除了相对容易的操作之外 利什曼原虫 培养条件及脂质生物合成敲除范围显示，该寄生虫的基因组比哺乳动物更简单。研究最深入的物种是 利什曼原虫 是 L. major，拥有多种现有的遗传工具，例如脂质代谢缺陷的突变体14值得注意的是，许多修复蛋白缺失。 L. major 迄今为止，尚未发现关键哺乳动物修复蛋白（如annexins）的同源物。这使得研究人员能够在排除哺乳动物系统复杂性的前提下，对进化上保守的修复通路进行表征。然而，修复通路在 利什曼原虫 迄今为止。同时，参与修复的关键信号通路，如 MEK 通路6， 在进化上是保守的 利什曼原虫 sp.15,16，尽管同源基因需要进一步验证。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在 L. mexicana，其中它有助于哺乳动物细胞内的细胞内存活和热稳定性，并调控后循环型转化16在 利什曼原虫 sp. 中，15个MAPK中有10个已被表征17LmMAPK9 和 LmMAPK13 根据保守磷酸化唇序列的同源性被预测为与哺乳动物 ERK1/2 最为相似。哺乳动物 ERK1/2 与 LmMAPK9 及 LmMAPK13 的磷酸化唇序列均为 TEY。然而，其中八个的 利什曼原虫 MAPKs 具有 TDY 磷酸化基序15。已在至少两种MEK同源物中被鉴定出 利什曼原虫 sp., LmxMKK18 以及MEKK相关激酶（MRK1）19这表明在其中发现的见解 利什曼原虫 可转化为哺乳动物系统的研究成果。当其无法直接转化为哺乳动物系统时，则可作为治疗利什曼病的治疗靶点。
为了利用L. major前鞭毛体研究膜修复及其与毒素的相互作用，需要采用中等通量的技术。虽然高分辨率的活细胞成像能够实时观察标记的蛋白质和膜结构，但其通量较低，且无法有效检测细胞存活率。中等通量的活力检测方法包括通过流式细胞术检测染料摄取、线粒体活性测定，或细胞内蛋白（如乳酸脱氢酶（LDH））的释放。在哺乳动物细胞中，LDH检测并不能定量测量细胞死亡20。此外，基于群体的检测方法（如LDH释放或线粒体活性测定）无法实现可靠的单细胞或多参数分析20。相比之下，基于流式细胞术的检测方法可实现多参数单细胞分析20。然而，这些方法尚未被应用于研究L. major前鞭毛体对毒素的生物学反应或应答机制。
本研究中，SLO 被用作研究L. major糖鞘脂缺失突变体在两种不同缓冲液中质膜扰动的工具——即常用于培养L. major前鞭毛体的M199培养基和成分更简单的Tyrode's缓冲液。文中描述并使用了一种中等通量的流式细胞术检测方法，用于生成毒素的剂量-反应曲线。流式细胞术检测所得数据通过拟合逻辑斯蒂曲线以确定LC50 值。基于这些信息，可确定SLO的亚溶血剂量，从而利用蛋白质印迹法验证MAPK抗体。

<table><tbody><tr><td>1.2 mL 微量离心管（Marsh）</td><td>Fisher</td><td>02-681-376</td><td>细胞毒性检测</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>毒素稀释液</td></tr><tr><td>15 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Avantor VWR（宾夕法尼亚州拉德诺）</td><td>89039-666</td><td>用于盛放细胞和培养基</td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher</td><td>BP399</td><td>用于细胞处理</td></tr><tr><td>3% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>沃尔玛&amp;nbsp; （费耶特维尔，AR）</td><td>N/A</td><td>用于ECL</td></tr><tr><td>5x M199</td><td>Cell-gro</td><td>11150067</td><td>L. major 前鞭毛体的基础培养基</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>贝克</td><td></td><td>在无菌条件下培养细胞</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher</td><td>BP1605-100</td><td>V型级，可接受纯度</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP510-100</td><td>储存浓度 100 mM</td></tr><tr><td>离心</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>离心收集培养物中的细胞</td></tr><tr><td>Cy5 单反应性染料套装</td><td>Cytiva（马萨诸塞州马尔伯勒）</td><td>PA25031</td><td>毒素的荧光标记</td></tr><tr><td>数字干浴器</td><td>基准</td><td>BSH1002</td><td>使蛋白质样品变性</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-100G</td><td>储备浓度 0.5 M</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft (Redmond, VA)</td><td></td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>流式细胞仪（4 激光 Attune NxT）</td><td>Fisher</td><td></td><td>用于数据采集的流式细胞仪</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD（美国阿什兰）</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td>用于细胞计数的固定剂</td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>BP673-1</td><td>细胞筛选剂</td></tr><tr><td>海尔曼毒素III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td>按1:4比例稀释以清洁流式细胞仪</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>0267151B</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>人类红细胞</td><td>Zen-bio（美国北卡罗来纳州达勒姆）</td><td>SER-10MLRBC</td><td>验证毒素活性</td></tr><tr><td>冰桶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 55i</td><td>观察细胞</td></tr><tr><td>硝酸纤维素</td><td>Fisher</td><td>88018</td><td>通过抗体检测蛋白质</td></tr><tr><td>移液器和吸头</td><td>Avantor VWR</td><td></td><td>用于分配试剂</td></tr><tr><td>电源供应器</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>进行 SDS-PAGE 及转膜</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Biotium</td><td>40016</td><td>储存浓度：2 mg/mL，溶于水</td></tr><tr><td>蛋白分子量标准</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td>测定蛋白质的分子量</td></tr><tr><td>SDS-PAGE电泳装置（Mini Protean III）</td><td>Bio-Rad</td><td>165-3302</td><td>根据蛋白质的大小进行分离</td></tr><tr><td>封口膜</td><td>R&amp;研发</td><td>DY992</td><td>用封板膜密封含细胞的培养板</td></tr><tr><td>链球溶血素 O C530A 质粒插入片段</td><td></td><td></td><td>克隆至 pBAD-gIII 载体（参考文献：7）</td></tr><tr><td>链球溶血素 O C530A 毒素</td><td>实验室纯化</td><td></td><td>特异性活性&amp;nbsp; 4.34 × 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; HU/mg</td></tr><tr><td>水平转子</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>75003607</td><td>离心细胞</td></tr><tr><td>V 型底板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651206</td><td>用于细胞毒性检测</td></tr><tr><td>涡旋震荡</td><td>基准</td><td>BV1000</td><td>混合细胞</td></tr><tr><td>Western blot成像系统（Chemi-doc）</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>通过蛋白质印迹法检测蛋白质</td></tr><tr><td>Western Blot 转膜装置（Mini Protean III）</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3930</td><td>将蛋白质转移至硝酸纤维素膜</td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-700</td><td>用于将蛋白质转移至硝酸纤维素膜</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ERK抗体</td><td>细胞信号技术公司&amp;nbsp;</td><td>货号 9102S</td><td>兔源抗体（1:1000 稀释）</td></tr><tr><td>抗脂磷糖苷（LPG）抗体</td><td>CreativeBioLabs&amp;nbsp;</td><td>货号 WIC79.3</td><td>小鼠（1:1000）</td></tr><tr><td>抗MEK抗体</td><td>细胞信号技术&amp;nbsp;</td><td>货号 9122L</td><td>兔抗（1:1000）</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG，HRP 缀合物</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>货号 715-035-151</td><td>驴抗（1:10000）</td></tr><tr><td>抗磷酸化ERK抗体</td><td>细胞信号技术公司&amp;nbsp;</td><td>货号 9101S</td><td>兔抗（1:1000）</td></tr><tr><td>抗pMEK抗体</td><td>细胞信号转导技术&amp;nbsp;</td><td>货号 9121S</td><td>兔抗（1:1000）</td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 偶联物</td><td>Jackson Immunoresearch&amp;nbsp;</td><td>Cat#711-035-152</td><td>驴抗（1:10000）</td></tr><tr><td>抗微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>货号 T5168</td><td>小鼠（1:2000）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Leishmania major &lt;/em&gt;基因型&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>参考文献：13</td></tr><tr><td>附加型回补（Episomal addback）&lt;strong&gt;&lt;em&gt;spt2&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;/+SPT2&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>&amp;Delta;spt2::HYG/&amp;Delta;spt2:PAC/+pXG-SPT2</td></tr><tr><td>丝氨酸棕榈酰转移酶亚基2基因敲除（&lt;strong&gt;&lt;em&gt;spt2&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>&amp;Delta;spt2::HYG/&amp;Delta;spt2::PAC&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>野生型（&lt;strong&gt;野生型&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>LV39 克隆 5 (Rho/SU/59/P)</td></tr></tbody></table>

利用leishmania major解析孔形成毒素的分子机制与功能

Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

了解孔形成毒素（PFTs）的功能与作用机制具有挑战性，因为细胞能够抵抗PFTs引起的膜损伤。尽管生物物理方法有助于理解孔的形成过程，但这些方法通常依赖于简化体系，缺乏完整的膜脂质和膜蛋白组成。培养的人源细胞提供了一种替代系统，但其修复机制的复杂性和冗余性使得特定机制的鉴定变得困难。相比之下，引起皮肤利什曼病的人类原生动物病原体， Leishmania major,&#160;在复杂性与生理相关性之间提供了最佳平衡。 L. major 具有可遗传操作性，且可培养至高密度 体外，且可在已建立的小鼠模型中测量扰动对感染的影响。此外， L. major 合成的脂质与其哺乳动物对应物不同，可能改变膜动力学。这些膜动力学的改变可通过最明确的一类毒素——胆固醇依赖性溶细胞素（CDCs）中的PFTs进行探测。CDCs可结合麦角固醇 利什曼原虫 膜并可杀死 L. major 前鞭毛体，表明 L. major 是研究PFT功能的细胞和分子机制的合适模型系统。本文描述了在该系统中检测PFT功能的方法 L. major 前鞭毛体，包括寄生虫培养、评估脂质敏感性的遗传工具、膜结合实验和细胞死亡实验。这些实验将促进快速应用 L. major 作为研究多种进化上不同生物中PFT功能及脂质组织共性的强大模型系统。

利什曼原虫前鞭毛体在Tyrode缓冲液中对SLO的敏感性高于M199培养基 
比较了不同检测缓冲液中L. major前鞭毛体对SLO的敏感性。野生型、spt2-突变体及spt2-/+SPT2互补株前鞭毛体分别在无血清M199或含2 mM CaCl2的Tyrode缓冲液中与SLO作用30分钟，随后通过流式细胞仪进行分析。用于分析的合适寄生虫为通过前向散射/侧向散射图谱识别的单细胞（图3A、B）。数据采集使用BL1通道（488 nm激发，530/30 nm发射滤光片）作为自发荧光对照，YL1通道（561 nm激发，585/16 nm发射滤光片）检测碘化丙啶（PI）信号。BL1通道用于识别潜在的自发荧光或补偿问题（图3C–E的x轴）。使用561 nm激光可减少PI信号在BL1通道中的串色干扰。针对每种...

本文介绍了一种利用Leishmania major前鞭毛体来检测成孔毒素所诱导的结合、细胞毒性和信号转导的实验方案。文中以链球菌溶血素O作为概念验证示例，也可使用其他毒素，结合L. major中已有的遗传突变体，以揭示新的毒素抗性机制。

利用Leishmania major解析孔形成毒素的分子机制与功能

理解孔形成毒素（PFTs）的功能与作用机制具有挑战性，因为细胞能够抵抗PFTs所引起的膜损伤。尽管如此……

对孔形成毒素的耐药机制目前尚不明确。我们的实验方案利用杜氏利什曼原虫（Leishmania major）这一遗传上易于操作且生理学上具有相关性的体系，来研究孔形成毒素的功能与作用机制。细胞毒性检测的主要优势在于，当毒素实时作用时，可在中等通量的单细胞水平上比较多种表型的细胞存活情况。两性霉素B等膜干扰剂是治疗利什曼原虫的一线疗法。本实验方法可用于鉴定能够增强两性霉素B活性的化合物，和/或发现新的膜损伤类药物。该实验可为修复应答及相关信号通路等研究领域提供重要信息。该检测方法可应用于锥虫和福氏耐格里阿米巴等原生动物。人们往往难以理解毒素的系列稀释过程，因此我给出的最佳建议是在开展实验前先绘制出系列稀释的示意图。首先，将0.5毫升处理后的前鞭毛体保留于另一试管中，作为未染色对照。向其余前鞭毛体中加入终浓度为10微克/毫升的碘化丙啶（propidium iodide，PI），其储存液浓度为2毫克/毫升。涡旋振荡3秒。将处理后的前鞭毛体加入96孔V型底培养板的每个孔中，或加入马什管中，并将培养板或试管架以约45度角倾斜放置于冰上以便观察。向每个无毒素对照孔/管中加入100微升含碘化丙啶的检测缓冲液。通过肉眼观察确认对照是否正确加入：含有200微升总体积且颜色较深的管/孔即为正确添加的对照。将毒素加入最高稀释度的溶液中，然后对毒素进行系列稀释。至少吹打混合八次，以确保充分混匀。从最低毒素浓度开始，迅速向相应的行加入100微升毒素，依次操作直至所有毒素均加入细胞中。用封板膜密封培养板。在37摄氏度孵育30分钟后，将培养板包装并运送至流式细胞仪。进行数据采集时，首先根据制造商说明及实验室相关规定，设置流式细胞仪和数据采集软件。使用未染色的利什曼原虫前鞭毛体样本，根据所选染料设定前向散射光和侧向散射光的门控以及初始荧光参数。利用单染对照样本，设定活力染料及任何荧光标记毒素的门控。通过监测前向散射随时间的变化来观察微堵塞情况，并在流式细胞仪上对每个样本采集超过 10,000 个门控事件。数据分析时，根据前向散射和侧向散射以及必要的时间参数，圈选总的单细胞利什曼原虫前鞭毛体。根据流式细胞仪的建议，使用高度或面积参数进行分析。将死细胞鉴定并圈选为PI高表达细胞。在Excel中整理剂量-反应曲线以进行分析。计算每个条件下两个技术重复之间PI高表达细胞的平均百分比。包括毒素浓度和平均特异性裂解百分比，以及实验细节和/或原始PI高百分比计算结果。另标记四列为“模拟值”、“残差”、“参数”和“参数值”。确认前几列对应实验参数、毒素浓度和特异性裂解百分比。通过在“参数值”列中输入数值来初始化参数 L、k 和 c。在“建模值”列中，建立逻辑斯蒂模型。在“残差”列中，计算建模数值与实际特异性裂解率之间差值的平方。在“参数值”列中，于 SUM 旁边，对“残差”列中的所有数值求和。在“参数值”列中，于 LC50 旁边，初始化方程以根据所确定的数值计算 LC50。从“数据”选项卡中打开求解器。选择目标单元格，该单元格包含计算得到的残差总和，并将其设置为最小值。调整参数 L、k 和 c 的变量单元格。对于负的 k 值，通过从 k 中提取负一因子，使 k 变为正值，并相应调整方程。使用 GRG 非线性求解方法，然后点击“求解”。检查曲线，并确认 LC50 已自动计算。通过将特异性裂解百分比和模型拟合结果与毒素浓度进行图示化作图，验证拟合效果。鞘脂缺乏的SPT2基因敲除前鞭毛体在无血清M199培养基和Tyrode's缓冲液中均对链球菌溶素O（SLO）敏感。野生型和SPT2基因回补的前鞭毛体在无血清M199培养基中对SLO具有抗性，但在Tyrode's缓冲液中特异性裂解率低于20%。在Tyrode缓冲液中，SPT2基因敲除的前鞭毛体对SLO的敏感性比在M199培养基中高出约八倍。这些数据表明，毒素敏感性可能因所用缓冲液的不同而有所差异。在L. major前鞭毛体中观察到分子量为120千道尔顿的磷酸化MEK条带。对于总MEK，在约120千道尔顿和55千道尔顿处观察到条带，分别与MRK1和LmxMKK的大小一致。磷酸化ERK检测到类似的条带，而在此实验中ERK抗体染色信号较弱。进行该实验操作时最重要的是确保对毒素的正确处理。利什曼原虫可作为一种遗传上易于操作的模型，用于研究质膜修复，为利什曼原虫与白蛉中肠内细菌相互作用过程中的膜修复机制提供新的见解。

deciphering-molecular-mechanism-function-pore-forming-toxins-using

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

利用利什曼原虫破译毛孔形成毒素的分子机制和功能

一个 体内 成像系统用于对利什曼原虫（Trypanosomatid原生动物）感染小鼠的感染情况进行定量测量 利什曼原虫这是一种非侵入性且非致死性的方法，可用于在慢性感染过程中检测多种组织内表达荧光素酶的寄生虫。 利什曼原虫...

in vivo 活体成像转基因Leishmania 寄生虫在活体宿主中的分布

感染THP1细胞的寄生虫拯救与转化实验 体外 与 Leishmania donovani...

一种针对THP1人急性单核细胞白血病细胞系内Leishmania donovani无鞭毛体的抗利什曼原虫药物筛选的寄生虫拯救与转化实验

本文介绍了一种在同一序列中合成具有混合阳离子功能的肽模拟物（赖氨酸型和精氨酸型单体）的方案，并描述了这些化合物对引起皮肤利什曼病的原虫寄生虫Leishmania...

一种高效合成含混合型赖氨酸/精氨酸单体的肽拟物及其抗利什曼原虫活性评价方法

所有致病性利什曼原虫（Leishmania）物种均在其脊椎动物宿主的巨噬细胞内寄居并增殖。本文介绍一种在体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞中感染利什曼原虫（Leishmania）并精确量化其胞内生长动力学的实验方案。该方法适用于研究影响宿主-病原体相互作用及利什曼原虫（Leishmania）毒力的各个独立因素。...

巨噬细胞内生长的定量分析是一种快速可靠的毒力评估方法 利什曼原虫 寄生虫

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

此处，我们提供了一套整合的实验方案，用于评估小鼠皮肤感染情况 Leishmania...

体内感染 Leishmania amazonensis 评估小鼠体内寄生虫毒力

与吞噬作用相关的机制 利什曼原虫 感染仍知之甚少。本文中，我们描述了用于评估感染早期事件的方法 利什曼原虫...

使用共聚焦显微镜研究Leishmania的吞噬作用

本文描述了利用 pLEXSY 系统构建表达 eGFP 基因的稳定整合转基因L. panamensis和L.

Leishmania 物种菌株的构建及其eGFP的组成型表达

本文介绍了一种设计、构建和递送基于四环素调控的可诱导合成回路的实验方案。通过利用本方案所提供的技术流程，可研究合成回路对寄生虫清除及细胞因子表达的影响。该方案适用于从事感染性疾病中基于合成回路治疗研究的科研人员。...

感染中的免疫代谢回路推动宿主导向治疗的发展

本文通过生物发光成像和PCR技术，对经腹腔（IP）或牙龈内（IG）途径感染L. infantum-Luc的金黄地鼠进行纵向评估。在感染后第1天（1 dpi）、感染后第1周（8 dpi）和感染后第3周（22 dpi）对动物进行评估，并于感染后第50天（50th...

体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

了解利用利什曼原虫研究毛孔形成毒素分子机制的实验方法。该方案通过实时细胞毒性检测比较不同表型的细胞活力，为探索毒素抗性和膜修复机制提供重要工具。

利用Leishmania major解析孔形成毒素的分子机制与功能

探索更多视频